Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

O objetivo deste método é isolar células-tronco dos ductos das glândulas submucosas da traqueia de camundongo para estudar, reparar e regenerar. Primeiro, a traqueia é dissecada de um camundongo eutanasiado. A traqueia é limpa, cortada e digerida.

Em seguida, o epitélio é removido mecanicamente e submetido a uma digestão adicional para gerar uma suspensão de células isoladas. As células são então coradas, separadas por FACS e, por fim, processadas para uso em ensaios in vivo e in vitro. Em última análise, este método pode ajudar a identificar vias-chave que regulam as vias aéreas, as células-tronco epiteliais, a autorrenovação e a diferenciação.

Essas técnicas são importantes porque nos fornecem modelos de reparo e regeneração de vias aéreas epiteliais in vitro e ex vivo. Isso nos permite estudar o reparo normal das vias aéreas, bem como doenças das vias aéreas, como doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística e asma. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando não conseguimos encontrar marcadores superficiais específicos para isolar as células basais das células-tronco ductais, e então decidimos remover o epitélio superficial junto com as células basais, deixando para trás as células ductais. Demonstração dos procedimentos de dissecação traqueal.

A dissociação do epitélio das vias aéreas, a obtenção de uma suspensão simples de células e a triagem de fatores serão realizadas pelo hega. Um pesquisador pós-doutorando do meu laboratório demonstrando os procedimentos de processamento de células triadas em modelos in vitro e ex vivo é sim, orga nossa gerente de laboratório. Inicie este procedimento cortando a parede abdominal de um camundongo eutanasiado.

Mova os intestinos para o lado para expor a aorta abdominal e, em seguida, dissecione-a. Abra o tórax cortando o diafragma e a parede torácica interna em ambos os lados para expor o coração e os pulmões. Continue cortando em direção ao pescoço, removendo a gordura e as glândulas salivares para expor a traqueia usando tesoura fina.

Remova o timo e separe o pulmão do tecido conjuntivo abaixo e atrás dele. Em seguida, insira a pinça entre a traqueia e o esôfago para separá-los. Corte a traqueia em sua parte mais superior, acima da sua conexão com a laringe.

Em seguida, segure a traqueia com a pinça e dissecção-a de sua inserção. Continuando para baixo para removê-la com o coração e o bloco pulmonar, corte o coração e os pulmões próximo ao hilo para incluir a maior parte dos brônquios principais direito e esquerdo. Coloque a traqueia em uma pequena placa de Petri contendo meio de coleta sobre gelo sob o microscópio estereoscópico.

Use uma pinça de ponta muito fina número cinco, um tubo venoso e uma tesoura para remover qualquer tecido aderido à traqueia. Isso inclui nódulos linfáticos, gordura do nervo laríngeo recorrente, a glândula tireoide e os vasos pulmonares remanescentes. A parte superior da traqueia exige atenção especial para remover os grandes fragmentos de cartilagem laríngea sem comprometer o maior grupo de glândulas submucosas, localizado entre a cartilagem cricoide e o primeiro anel cartilaginoso traqueal C1.

Em seguida, corte a traqueia na parte superior e na parte inferior entre C quatro e C cinco e, depois, corte. Abra ambas as partes através da luz da traqueia. Transfira a parte inferior da traqueia para tubos microcentrífugos de um mililitro e a parte superior da traqueia para um tubo cônico de 15 mililitros para digestão enzimática e processamento em suspensões de células isoladas.

Na próxima etapa do procedimento, as porções inferior e superior da traqueia são processadas para gerar suspensões de células isoladas. Embora essas porções devam ser processadas simultaneamente aqui, os dois métodos serão demonstrados sequencialmente. Para processar a parte inferior da traqueia, adicione-a a um mililitro de 16 unidades de dis em um tubo de microcentrífuga, incube à temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, transfira a traqueia para um novo tubo contendo 0,5 miligramas por mililitro de DNAase I em DMM por um adicional de 20 minutos à temperatura ambiente após a digestão. Use pinças finas para transferir o tecido para uma placa de Petri estéril contendo meio de coleta fresco. Então, sob o microscópio estereoscópico, remova o epitélio superficial puxando suavemente as lâminas epiteliais para separá-las da membrana basal subjacente. A seguir, use uma pipeta para transferir o meio contendo o epitélio removido para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a 1000 ×g a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova o SNAT e adicione tripsina 0,1% EDTA, incube o tubo em um incubador agitado a 37 graus Celsius por 30 minutos; após a incubação, pipete para cima e para baixo repetidamente com uma pipeta de ponteira de 1000 microlitros para desfazer aglomerados de células e garantir que as células formem uma suspensão de células isoladas. Coloque a traqueia superior em um tubo cônico contendo um mililitro de Pronase 0,15%, em seguida incube a quatro graus Celsius por quatro horas. Transfira a parte inferior da traqueia para um tubo microcentrífugo de um mililitro contendo um mililitro de meio com 16 unidades de disc base.

Após a incubação, agite suavemente o tubo por vortex e, em seguida, coloque a traqueia em meio de coleta fresco. Sob o microscópio estereoscópico, confirme a completa desanexação do epitélio superficial. Use tesouras finas para mincer a traqueia e expor os compartimentos das glândulas submucosas.

Incubar por mais uma hora em pronase a 0,15% à temperatura ambiente com agitação lenta. Centrifugar o tecido traqueal após a remoção da pronase. ADICIONAR tripsina EDTA a 0,1% e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação.

Em seguida, filtre os fragmentos maiores com um estrainer de 70 mícrons. Depois, lave o estrainer com meio. Passe os agregados de células digeridas e quaisquer fragmentos remanescentes das glândulas através de agulhas de 20, 23 e 26 furos usando uma seringa de 10 mililitros.

Repita o processo de embalagem várias vezes com cada tamanho de agulha antes de reduzir. Agora, a maioria das células deve estar em uma suspensão de célula única. Filtre a suspensão através de uma peneira de 40 micrômetros, depois lave a peneira com meio e centrifugue as células.

Em seguida, reconstitua as células no volume apropriado de meio, conte as células e prossiga imediatamente para a marcação com anticorpos e triagem. Reserve um número suficiente de células para preparar os tubos não marcados e os tubos simplesmente marcados para compensação. Em seguida, marque o restante das células com anticorpos primários contra tropo tubo e I TGA seis por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, lave com PBS ou meio de coleta, removendo o sobrenadante com muito cuidado.

Resuspenda o pellet celular com o anticorpo secundário apropriado. Incube no escuro, em temperatura ambiente, por 10 minutos. Em seguida, lave e remova o sobrenadante e, então, resuspenda o pellet.

As células agora podem ser separadas por meio de citometria de fluxo ativada por fluorescência. Agora que as células foram separadas, elas podem ser utilizadas para investigar os mecanismos de reparo e regeneração, a fim de gerar culturas esféricas formadoras in vitro. Misture 100 microlitros de gel de matriz com fatores de crescimento reduzidos com 100 microlitros de meio completo contendo até 50.000 células separadas.

Pipete esta mistura na câmara superior de uma placa transwell de 24 poços; na câmara inferior, pipete 400 microlitros de meio completo e incube a 37 graus Celsius. Troque o meio na câmara inferior a cada dois dias e adicione mais 100 microlitros de matrigel toda semana ou antes, se ficar fino.

As esferas geralmente se formam após sete dias e podem ser cultivadas por várias semanas ou passadas serialmente. Para o modelo in vivo, reconstitua o pellet de células classificadas em meio completo misturado na proporção de um para um com gel de matri, numa concentração de 5.000 a 10.000 células por 50 microlitros. Após anestesiar o camundongo C57 black six receptor, esterilize e retire os pelos do dorso, então na região superior das costas.

Realize uma incisão cutânea longitudinal central. Use o lado rombo da lâmina da tesoura para alargar as bolsas entre a pele e a parede torácica posterior em ambos os lados. Empurre a pata do camundongo para cima e para trás para movimentar e identificar a borda medial da escápula.

Em seguida, utilizando uma seringa de insulina de 300 microlitros, injete 50 microlitros da suspensão celular no coxim adiposo logo medial à escápula e lateral às vértebras. Deve-se formar uma bolha; repita a injeção no outro lado, depois feche a incisão cutânea com grampos ou pontos após três semanas. Abra a pele do camundongo eutanasiado como anteriormente e dissecque todo o coxim adiposo de ambos os lados com uma margem de segurança.

Para evitar perder qualquer estrutura tecidual que possa ter se formado e estendido ao redor, fixe o coxim adiposo dissecado em PFA e o inclua em parafina para evitar contornar ou ignorar estruturas durante o corte do bloco. Retire 40 mícrons uma vez, depois corte uma fatia de quatro mícrons.

Coloque-o em uma lâmina de vidro e, em seguida, examine-o ao microscópio para determinar se há estruturas epiteliais presentes. Se nada for observado, corte novamente e repita este passo. A remoção da traqueia de camundongo conforme descrito neste vídeo resultará em uma traqueia destituída de epitélio, visível por microscopia de luz, como mostrado aqui em traqueias destituídas.

Após 30 minutos de digestão com papaína, as digestões são mostradas à esquerda e as traqueias despidadas. Após quatro horas de digestão com pronase, os resultados são mostrados à direita. Após a remoção do epitélio, as glândulas submucosas são liberadas dos tecidos e assemelham-se a cachos de uvas.

A remoção de células epiteliais da superfície é indicada por setas pretas. A remoção de células nas glândulas submucosas e ductos é indicada por setas verdes. A citometria de fluxo das suspensões individuais de células deve mostrar gráficos de dispersão para frente e dispersão lateral conforme mostrado aqui.

Boa separação de células ductais do restante. Se as células traqueais devem ser visualizadas com o anticorpo Trop dois em citometria de fluxo para classificação celular ativada por fluorescência, após cerca de uma semana em cultura, esferas devem ser visíveis no gel de matriz e nosso luminal quando derivadas de células basais e em aparência din quando derivadas de células ductais. A eficiência desse processo é da ordem de 1 a 2%, e células individuais ainda estarão presentes no matrigel e provavelmente representam células dos ductos das glândulas submucosas que não possuem capacidade de autorrenovação.

As esferas basais são maiores e têm aparência luminal. A injeção de células-tronco ductais na bolsa de gordura do camunduco resulta na formação de glândulas submucosas, estruturas semelhantes a esferas que possuem um lúmen central. Essas estruturas são visíveis nos cortes mesmo sem coloração com hematoxilina e eosina.

São necessárias muitas secções transversais no tecido adiposo para obter um corte que contenha essas estruturas epiteliais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população de células-tronco a partir de células ductais da glândula subiácica, e, uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 10 horas. Após este procedimento, as condições de cultivo podem ser alteradas para responder a diversas questões relacionadas à formação de esferoides e ao estímulo da regeneração por fatores de crescimento.