Name: Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células basais e células ducto de glândulas submucosas da traqueia de camundongos. Este método permite estudar regeneração epitelial in vivo e identificar vias de autorrenovação celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de reconhecer as grandes Stem Cell FACS Centro de Pesquisa e agradecer especialmente Jessica Scholes e Felicia Codrea por sua ajuda com a classificação celular. O trabalho foi financiado pelo CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, da American Thoracic Society / Fundação DPOC ATS-06-065, A Fundação preocupação, a UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology SPORE Cancer Program / Pulmão, da Universidade da Califórnia do Câncer Pesquisa Comissão de Coordenação e Gwynne Hazen cereja Memorial Laboratories (BG).

Esboço de Passos 1. Dissecção da traquéia 2. Limpeza traquéia e cortá-lo 3. Digestão enzimática e transformação em suspensão de célula única 4. A coloração por FACS e triagem 5. Processamento de células classificadas para in vivo e in vitro, em modelos 1. Dissecção da traquéia <ol><li> Euthanize o rato com uma injeção intraperitoneal de 0,1 cc mg/0.2 de pentobarbital. </li><li> Cortar abrir a parede abdominal, e mover os intestinos para o lado a exposição da aorta abdominal e depois dissecá-lo. </li><li> Abra o peito, cortando através do diafragma e da parede torácica anterior em ambos os lados para expor o coração e os pulmões. Continuar a cortar-se para dentro do gargalo de remover gordura e glândulas salivares para expor a traqueia. </li><li> Remover o timo e cortar o pulmão fora de suas conexões abaixo e atrás. SeparComeram a traqueia do esófago, inserindo uma pinça entre elas, em seguida, cortado a traqueia, na sua parte mais superior acima da sua ligação com a laringe. Em seguida, mantenha a traquéia com uma pinça e dissecá-lo de seu apego e continue para baixo para removê-lo com o coração e pulmão en-bloco. Cortar o coração e os pulmões próximo ao hilo para incluir a maioria dos brônquios direito e esquerdo principal. </li><li> Coloque a traqueia numa placa de Petri que continha a recolha meio em gelo. </li></ol> 2. Traquéia limpeza e corte- <ol><li> Sob o microscópio de dissecação, utilize uma pinça de ponto muito finas (n º 5) e Tübingen Vannas tesouras (FST 15003-08 finescience.com) para limpar a traquéia de todos os outros tecidos ligados a ele. Isto inclui: gânglios linfáticos, nervos laríngeo recorrente, gordura, glândula tireóide e restantes vasos pulmonares. A parte superior da traqueia requer atenção especial, para remover as cartilagens laríngeas grandes, sem comprometer o maior grupo de SMGque esteja alojada entre a cartilagem cricóide eo primeiro anel traqueal cartilaginoso (C1) 4. </li><li> Cortar a traqueia para dentro da parte superior e da parte inferior entre C4 e C5 e, em seguida, cortado ambas as partes através do lúmen da traqueia. </li></ol> 3. A digestão enzimática e Transformação em suspensão de célula única (SCS) <ol><li> Incubar a parte inferior da traqueia, em 1 ml de 16 U dispase em um tubo de Eppendorf à temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos, como descrito anteriormente 5. Em seguida, adicionar 0,5 mg / ml de DNase I em DMEM durante mais 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover as traqueias digeridas em meio fresco a recolha de uma placa de Petri esterilizada, e retirar o epitélio da superfície sob o microscópio de dissecação. Usar uma pipeta para transferir o meio contendo o epitélio evaporadas para um tubo cónico de 50 ml. </li><li> Girar o epitélio despojado a 1.000 xg, a 4 ° C. Remover o sobrenadante e adicionar 0,1% de tripsina / EDTA e incubado com agitação thtubo e em 37 ° C agitando incubadora (200 rpm) durante 30 min. Após a incubação, utilizando uma ponta de 1000 uL, pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados e formar uma suspensão de células simples. </li><li> Coloque a traqueia superior, num tubo cónico contendo 1 ml de pronase 0,15%. Em seguida, incuba-se a 4 ° C durante 4 horas. </li><li> Vortex suavemente o tubo e, em seguida, colocar a traqueia para meio fresco e recolha de confirmar sob o microscópio de dissecação que haja separação completa da superfície do epitélio (SE). </li><li> Picar a traqueia com uma tesoura fina de abrir os compartimentos SMG e depois incubar durante mais uma hora à temperatura ambiente em pronase, com agitação lenta. </li><li> Girar o tecido traqueal, remover a pronase, adicionar 0,1% de tripsina / EDTA e incubado a 37 ° C durante 30 min com agitação como acima descrito. </li><li> Passagem das células digeridas, aglomerados e quaisquer partes restantes das glândulas através de agulhas 20G, 23G e 26G utilizando uma seringa de 10 ml. Repita as vezes várias passagens em cada um com o tamanho de agulha antescargo. Agora, a maioria das células deve ser em um SCS. </li><li> Filtrar a suspensão através de um filtro 40 mM em seguida, lave o coador e girar as células. Em seguida reconstituir as células no volume apropriado de meio, e contar as células imediatamente para coloração de FACS e de classificação. Não deixar as células em 4 ° C ou sobre gelo durante várias horas, pois verificou-se que isto afecta a viabilidade e reduz gravemente a esfera formando eficiência. </li></ol> 4. A coloração para FACS e classificação <ol><li> Tome células suficientes para a preparação dos tubos não coradas e único de compensação coradas então manchar o resto das células com os anticorpos primários, Trop2 cabra e de rato ITGA6, durante 15 min a RT. Em seguida, lave com PBS ou recolher médio, removedor do sobrenadante com muito cuidado e quebrar o pellet celular. </li><li> Mancha com o anticorpo secundário adequado, incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min, lavar e remover o sobrenadante e em seguida romper a pelota. </li><li> Nas FACSARIA, depois de ajustar sua tensão e compensação, portão para fora dos escombros, células muito pequenas, doublets celulares e células mortas. Em seguida, a maioria das células da SE deve ser TROP2 positivo enquanto 20-50% de células SMG será TROP2 + 6. </li><li> Definir o gate de triagem para Trop2 + + ITGA6 células de células basais (SE) e para Trop2 + células (+ /-ITGA6 células positivas) de SMG (células do ducto). </li></ol> 5. Processamento células separadas para: Cultura in vitro e in vivo no modelo do 5,1 in vitro esfera formando 5-9 cultura <ol><li> Misturar 100 ul de &quot;Factor de Crescimento reduzido Matrigel&quot; com 100 ul de meio completo 10,11 (ver Tabela 1), contendo até 50.000 células seleccionadas em seguida, colocar esta mistura na câmara superior de um poço de 24 trans-poço. Em seguida, colocar 400 ul de meio completo em câmara inferior e incubar a 37 ° C. Alterar meio em câmara baixa a cada dois dias e adicionar 100 ul extra de Matrigela cada semana ou mais cedo, se torna-se fina. </li></ol> 5.2 No modelo in vivo <ol><li> Reconstituir o pellet de células classificadas em meio completo misturado 1:1 com matrigel a uma concentração de 5.000-10.000 células por 50 ul. </li><li> Anestesiar os receptores C57/BL6 ratos. Administrar carprofeno (5 mg / kg) subcutaenously como analgésico. Esterilizar e raspar as costas em seguida, fazer uma incisão na pele central longitudinal na parte superior das costas. A incisão deve ser grande o suficiente para identificar o local da injecção de gordura almofada, bem como a bolha que se forma depois da injecção. Use o lado sem corte da tesoura para alargar malotes entre a pele ea parte de trás da parede torácica em ambos os lados para maximizar o acesso e visualização. </li><li> Identificar a borda medial da escápula, empurrando o membro anterior mouse para cima e para trás para ver o movimento da escápula. Tomar 50 ul da suspensão de células para uma seringa de insulina 300 ul BD e injectá-la no corpo adiposo apenas à escápula medial e lateral, paraas vértebras. Você deve ser capaz de ver uma bolha se não você são muito profundas. Repita a mesma do outro lado, em seguida, o grampo ou o ponto de incisão na pele. Verificar ratos e dar carprofeno (5 mg / kg, SC), uma vez por dia, durante 48 hr. </li><li> Após 3 semanas, a eutanásia ratos com pentobarbatol (0,1 cc mg/0.2, IP), abra a pele como acima e dissecar a almofada toda a gordura de ambos os lados com uma margem de segurança para evitar a falta de qualquer estrutura de tecido que pode ter se formado e estendido ao redor. Fixar em PFA e embed em parafina 12. Extremo cuidado deve ser empregado durante o corte e cortar o bloco não para ignorar ou esquecer uma estrutura. A melhor prática é cortar 40 um uma vez e depois cortar uma fatia mM 4, coloque-o sobre uma lâmina de vidro e examiná-lo sob o microscópio para confirmar se existem &quot;estruturas epiteliais&quot; nesta parte do bloco ou não. Se não há nada visto, então cortar mais uma vez e repita esta etapa. </li></ol> 6. Resultados representativos Stripping das traqueias rato irá resultar numa traqueia desnudada que é visível por microscopia de luz, como mostrado na Figura 1A. Figura 1B mostra uma vista de campo claro de uma traqueia após decapagem com epitelial glândulas submucosas ser libertados a partir dos tecidos e dos cachos de uvas que se assemelham. Pronase remove o epítopo ITGA6 e é por isso que as condutas TROP2 células não podem ser separados em ITGA6 + e - as populações. No entanto, dispase, que preserva o epítopo ITGA6, digere todos epitélio da superfície e as células do ducto, mesmo com tempos de incubação muito curtos e, portanto, não pode ser utilizado para separar as células basais da conduta 3. A citometria de fluxo das suspensões de células individuais deve mostrar a frente diagramas de dispersão e de dispersão lateral, que estão representados na Figura 2A. Uma boa separação das células do ducto do resto, se as células da traqueia deve ser visto com o anticorpo Trop2 em citometria de fluxo por fluorescência de células activado sorting (FACS), como visto na Figura 2B. Esferas deve ser visível na matrigel após cerca de 1 semana em cultura e são densos em aparência, como mostrado na Figura 3. A eficiência deste processo é a ordem de 1-2%, e as células individuais ainda estará presente no matrigel e provavelmente representam células de ductos glândulas submucosas que não possuem a capacidade de auto-renovação. A injecção de células-tronco duto no rato resultados almofada de gordura na formação da glândula submucosa estruturas semelhantes que são mostrados Figura 4. Estes são vistos nos blocos, mesmo sem coloração de H &amp; E. Estes são esféricos e possuem um lúmen central. Muitas secções transversais necessitam de ser feitos por meio da almofada de gordura, a fim de não perder essas estruturas epiteliais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Figura 1. Digestão enzimática de epitélio traqueal. A remoção de células epiteliais da superfície é mostrada com blacsetas k, a remoção das células das glândulas submucosas dutos é mostrado com setas verdes. Traqueias desnudadas que são visíveis por microscopia de luz são apresentados após 30 min de digestão dispase e após 4 h de digestão com pronase. <img alt="A Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> Figura 2A. I. Citometria de fluxo das suspensões de células individuais que mostram dispersão frontal representante e gráficos de dispersão laterais da traquéia de rato depois de superfície epitelial stripping. ii. Representante parcelas FACS para TROP2 expressão em células do duto de traquéia de rato. <img alt="A Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> Figura 2B. I. A citometria de fluxo das suspensões de células isoladas a partir de epitélio da superfície despida de dois terços inferiores da traqueia de rato mostrando dispersão representativo para a frente e diagramas de dispersão lateral. ii. Lote típico de FACS ITGA6 expressão em surface epitélio. iii. Outra parcela FACS representante da frente e dispersão lateral do epitélio superfície mostrando volta gating da população de células basais em verde. iv. ITGA6 típico e TROP2 expressar população de células em verde. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Figura 3. Evolução temporal do desenvolvimento das esferas. A. esferas de condutas. Esferas deve ser visível na matrigel após cerca de 1 semana de cultura e quase todos são densos em aparência. As células individuais que não formam esferas são também observadas. (Barra de escala = 50 mm). Esferas B. basais são maiores e luminal na aparência. As células individuais que não formam esferas são também observadas. (Barra de escala = 50 mm). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Figura 4. A injecção de células-tronco duto no rato resultados almofada de gordura na formação da glândula submucosa estruturas semelhantes. Estruturas representativassão mostrados na almofada de gordura e alguns são apresentados produzindo mucina (azul claro), com o ácido de Schiff periódico mancha azul Alcian.

<ol><li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li>
<li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li>
<li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Stem%2FProgenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li>
<li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+an+epithelial+stem%2Fprogenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li>
<li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta técnica para isolar as células do ducto e basal das vias aéreas é importante para melhorar a compreensão de reparação e regeneração das vias aéreas e de doenças das vias respiratórias. As técnicas descritas aqui incluem alguns passos críticos. O primeiro é o período de digestão enzimática optimizado. A segunda é a criação de uma suspensão de células individuais através de passagens em série com agulhas calibre progressivamente mais elevadas para impedir ruptura da célula, mas a romper-se grumos celulares. A terceir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Conclua médio 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090 CV- </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio (3,6 mM ou 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamina (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 Cl- </td></tr><tr><td> Penicilina (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Estreptomicina (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001 CI- </td></tr><tr><td> Anfotericina B (0,25 ug / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> EmSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrina (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Toxina da cólera (0,1 ng / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Factor de Crescimento Epidérmico (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Extrato de Pituitária Bovina (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> O soro de bovino fetal (5%) </td><td> Pescador </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Ácido retinóico (0,05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Fator de Crescimento reduzido Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Conclua componentes de mídia. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Usado em 0,15%: -O / n a 4 ° C para isolar a digestão total de células para a cultura de traqueia (ALI) Digestão hr -4 4 ° C para isolar SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Usado menos 16 Unidades: 30 min à TA </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Utilizada a 0,5 mg / ml: 20-30 min à temperatura ambiente </td></tr></tbody></table> Enzimas Tabela 2. Usado para a digestão enzimática da traqueia.

isolamento de células basais e células duct submucosa glândulas de rato traquéia

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Grandes vias aéreas estão diretamente em contato com o meio ambiente e, portanto, suscetível a lesões de toxinas e agentes infecciosos que respiramos em 1. Grandes vias aéreas, portanto, exigem um mecanismo de reparo eficiente para proteger os nossos corpos. Este processo de reparo ocorre a partir de células-tronco nas vias aéreas e isolar essas células-tronco das vias aéreas é importante para compreender os mecanismos de reparo e regeneração. Também é importante para a compreensão de reparação anormal que pode conduzir a doenças das vias aéreas 2. O objectivo deste método é para isolar uma população de células estaminais a partir de novo os ratos ductos de glândulas submucosas traqueal e para colocar estas células in vitro e em sistemas de modelos in vivo para identificar os mecanismos de reparação e regeneração das glândulas submucosas 3. Isto mostra a produção de métodos que podem ser utilizados para isolar e ensaio das células estaminais e do ducto basal das vias aéreas grandes 3. Isto permitirápara o estudo de doenças das vias respiratórias, como a fibrose cística, asma e doença pulmonar obstrutiva crónica. Actualmente, não existem métodos para o isolamento de células das glândulas submucosas duto e não existem modelos in vivo para estudar a regeneração de glândulas submucosas.

Aqui demonstramos nosso protocolo para isolamento de células basais e das glândulas submucosas duto de traqueias de rato. Nós também demonstram o método de injecção de células estaminais na almofada de gordura dorsal do rato para criar um<em&gt; In vivo</em&gt; Modelo de regeneração da glândula submucosa.

Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

As vias aéreas superiores estão em contato direto com o ambiente e, portanto, são suscetíveis a lesões causadas por toxinas e agentes infecciosos que inalamos 1. ...

O objetivo deste método é isolar células-tronco dos ductos das glândulas submucosas da traqueia de camundongo para estudar, reparar e regenerar. Primeiro, a traqueia é dissecada de um camundongo eutanasiado. A traqueia é limpa, cortada e digerida.Em seguida, o epitélio é removido mecanicamente e submetido a uma digestão adicional para gerar uma suspensão de células isoladas. As células são então coradas, separadas por FACS e, por fim, processadas para uso em ensaios in vivo e in vitro. Em última análise, este método pode ajudar a identificar vias-chave que regulam as vias aéreas, as células-tronco epiteliais, a autorrenovação e a diferenciação.Essas técnicas são importantes porque nos fornecem modelos de reparo e regeneração de vias aéreas epiteliais in vitro e ex vivo. Isso nos permite estudar o reparo normal das vias aéreas, bem como doenças das vias aéreas, como doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística e asma. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando não conseguimos encontrar marcadores superficiais específicos para isolar as células basais das células-tronco ductais, e então decidimos remover o epitélio superficial junto com as células basais, deixando para trás as células ductais. Demonstração dos procedimentos de dissecação traqueal.A dissociação do epitélio das vias aéreas, a obtenção de uma suspensão simples de células e a triagem de fatores serão realizadas pelo hega. Um pesquisador pós-doutorando do meu laboratório demonstrando os procedimentos de processamento de células triadas em modelos in vitro e ex vivo é sim, orga nossa gerente de laboratório. Inicie este procedimento cortando a parede abdominal de um camundongo eutanasiado.Mova os intestinos para o lado para expor a aorta abdominal e, em seguida, dissecione-a. Abra o tórax cortando o diafragma e a parede torácica interna em ambos os lados para expor o coração e os pulmões. Continue cortando em direção ao pescoço, removendo a gordura e as glândulas salivares para expor a traqueia usando tesoura fina.Remova o timo e separe o pulmão do tecido conjuntivo abaixo e atrás dele. Em seguida, insira a pinça entre a traqueia e o esôfago para separá-los. Corte a traqueia em sua parte mais superior, acima da sua conexão com a laringe.Em seguida, segure a traqueia com a pinça e dissecção-a de sua inserção. Continuando para baixo para removê-la com o coração e o bloco pulmonar, corte o coração e os pulmões próximo ao hilo para incluir a maior parte dos brônquios principais direito e esquerdo. Coloque a traqueia em uma pequena placa de Petri contendo meio de coleta sobre gelo sob o microscópio estereoscópico.Use uma pinça de ponta muito fina número cinco, um tubo venoso e uma tesoura para remover qualquer tecido aderido à traqueia. Isso inclui nódulos linfáticos, gordura do nervo laríngeo recorrente, a glândula tireoide e os vasos pulmonares remanescentes. A parte superior da traqueia exige atenção especial para remover os grandes fragmentos de cartilagem laríngea sem comprometer o maior grupo de glândulas submucosas, localizado entre a cartilagem cricoide e o primeiro anel cartilaginoso traqueal C1.Em seguida, corte a traqueia na parte superior e na parte inferior entre C quatro e C cinco e, depois, corte. Abra ambas as partes através da luz da traqueia. Transfira a parte inferior da traqueia para tubos microcentrífugos de um mililitro e a parte superior da traqueia para um tubo cônico de 15 mililitros para digestão enzimática e processamento em suspensões de células isoladas.Na próxima etapa do procedimento, as porções inferior e superior da traqueia são processadas para gerar suspensões de células isoladas. Embora essas porções devam ser processadas simultaneamente aqui, os dois métodos serão demonstrados sequencialmente. Para processar a parte inferior da traqueia, adicione-a a um mililitro de 16 unidades de dis em um tubo de microcentrífuga, incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, transfira a traqueia para um novo tubo contendo 0,5 miligramas por mililitro de DNAase I em DMM por um adicional de 20 minutos à temperatura ambiente após a digestão. Use pinças finas para transferir o tecido para uma placa de Petri estéril contendo meio de coleta fresco. Então, sob o microscópio estereoscópico, remova o epitélio superficial puxando suavemente as lâminas epiteliais para separá-las da membrana basal subjacente. A seguir, use uma pipeta para transferir o meio contendo o epitélio removido para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a 1000 ×g a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, remova o SNAT e adicione tripsina 0,1% EDTA, incube o tubo em um incubador agitado a 37 graus Celsius por 30 minutos; após a incubação, pipete para cima e para baixo repetidamente com uma pipeta de ponteira de 1000 microlitros para desfazer aglomerados de células e garantir que as células formem uma suspensão de células isoladas. Coloque a traqueia superior em um tubo cônico contendo um mililitro de Pronase 0,15%, em seguida incube a quatro graus Celsius por quatro horas. Transfira a parte inferior da traqueia para um tubo microcentrífugo de um mililitro contendo um mililitro de meio com 16 unidades de disc base.Após a incubação, agite suavemente o tubo por vortex e, em seguida, coloque a traqueia em meio de coleta fresco. Sob o microscópio estereoscópico, confirme a completa desanexação do epitélio superficial. Use tesouras finas para mincer a traqueia e expor os compartimentos das glândulas submucosas.Incubar por mais uma hora em pronase a 0,15% à temperatura ambiente com agitação lenta. Centrifugar o tecido traqueal após a remoção da pronase. ADICIONAR tripsina EDTA a 0,1% e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação.Em seguida, filtre os fragmentos maiores com um estrainer de 70 mícrons. Depois, lave o estrainer com meio. Passe os agregados de células digeridas e quaisquer fragmentos remanescentes das glândulas através de agulhas de 20, 23 e 26 furos usando uma seringa de 10 mililitros.Repita o processo de embalagem várias vezes com cada tamanho de agulha antes de reduzir. Agora, a maioria das células deve estar em uma suspensão de célula única. Filtre a suspensão através de uma peneira de 40 micrômetros, depois lave a peneira com meio e centrifugue as células.Em seguida, reconstitua as células no volume apropriado de meio, conte as células e prossiga imediatamente para a marcação com anticorpos e triagem. Reserve um número suficiente de células para preparar os tubos não marcados e os tubos simplesmente marcados para compensação. Em seguida, marque o restante das células com anticorpos primários contra tropo tubo e I TGA seis por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, lave com PBS ou meio de coleta, removendo o sobrenadante com muito cuidado.Resuspenda o pellet celular com o anticorpo secundário apropriado. Incube no escuro, em temperatura ambiente, por 10 minutos. Em seguida, lave e remova o sobrenadante e, então, resuspenda o pellet.As células agora podem ser separadas por meio de citometria de fluxo ativada por fluorescência. Agora que as células foram separadas, elas podem ser utilizadas para investigar os mecanismos de reparo e regeneração, a fim de gerar culturas esféricas formadoras in vitro. Misture 100 microlitros de gel de matriz com fatores de crescimento reduzidos com 100 microlitros de meio completo contendo até 50.000 células separadas.Pipete esta mistura na câmara superior de uma placa transwell de 24 poços; na câmara inferior, pipete 400 microlitros de meio completo e incube a 37 graus Celsius. Troque o meio na câmara inferior a cada dois dias e adicione mais 100 microlitros de matrigel toda semana ou antes, se ficar fino.As esferas geralmente se formam após sete dias e podem ser cultivadas por várias semanas ou passadas serialmente. Para o modelo in vivo, reconstitua o pellet de células classificadas em meio completo misturado na proporção de um para um com gel de matri, numa concentração de 5.000 a 10.000 células por 50 microlitros. Após anestesiar o camundongo C57 black six receptor, esterilize e retire os pelos do dorso, então na região superior das costas.Realize uma incisão cutânea longitudinal central. Use o lado rombo da lâmina da tesoura para alargar as bolsas entre a pele e a parede torácica posterior em ambos os lados. Empurre a pata do camundongo para cima e para trás para movimentar e identificar a borda medial da escápula.Em seguida, utilizando uma seringa de insulina de 300 microlitros, injete 50 microlitros da suspensão celular no coxim adiposo logo medial à escápula e lateral às vértebras. Deve-se formar uma bolha; repita a injeção no outro lado, depois feche a incisão cutânea com grampos ou pontos após três semanas. Abra a pele do camundongo eutanasiado como anteriormente e dissecque todo o coxim adiposo de ambos os lados com uma margem de segurança.Para evitar perder qualquer estrutura tecidual que possa ter se formado e estendido ao redor, fixe o coxim adiposo dissecado em PFA e o inclua em parafina para evitar contornar ou ignorar estruturas durante o corte do bloco. Retire 40 mícrons uma vez, depois corte uma fatia de quatro mícrons.Coloque-o em uma lâmina de vidro e, em seguida, examine-o ao microscópio para determinar se há estruturas epiteliais presentes. Se nada for observado, corte novamente e repita este passo. A remoção da traqueia de camundongo conforme descrito neste vídeo resultará em uma traqueia destituída de epitélio, visível por microscopia de luz, como mostrado aqui em traqueias destituídas.Após 30 minutos de digestão com papaína, as digestões são mostradas à esquerda e as traqueias despidadas. Após quatro horas de digestão com pronase, os resultados são mostrados à direita. Após a remoção do epitélio, as glândulas submucosas são liberadas dos tecidos e assemelham-se a cachos de uvas.A remoção de células epiteliais da superfície é indicada por setas pretas. A remoção de células nas glândulas submucosas e ductos é indicada por setas verdes. A citometria de fluxo das suspensões individuais de células deve mostrar gráficos de dispersão para frente e dispersão lateral conforme mostrado aqui.Boa separação de células ductais do restante. Se as células traqueais devem ser visualizadas com o anticorpo Trop dois em citometria de fluxo para classificação celular ativada por fluorescência, após cerca de uma semana em cultura, esferas devem ser visíveis no gel de matriz e nosso luminal quando derivadas de células basais e em aparência din quando derivadas de células ductais. A eficiência desse processo é da ordem de 1 a 2%, e células individuais ainda estarão presentes no matrigel e provavelmente representam células dos ductos das glândulas submucosas que não possuem capacidade de autorrenovação.As esferas basais são maiores e têm aparência luminal. A injeção de células-tronco ductais na bolsa de gordura do camunduco resulta na formação de glândulas submucosas, estruturas semelhantes a esferas que possuem um lúmen central. Essas estruturas são visíveis nos cortes mesmo sem coloração com hematoxilina e eosina.São necessárias muitas secções transversais no tecido adiposo para obter um corte que contenha essas estruturas epiteliais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população de células-tronco a partir de células ductais da glândula subiácica, e, uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 10 horas. Após este procedimento, as condições de cultivo podem ser alteradas para responder a diversas questões relacionadas à formação de esferoides e ao estímulo da regeneração por fatores de crescimento.

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

As pilhas da escova são pilhas epithelial quimiosensoriais colinérgicos raras encontradas na traquéia ingênua do rato. Devido a seus números limitados, a avaliação ex vivo de seu papel funcional na imunidade e na remodelação da via aérea é desafiante. Nós descrevemos um método para a isolação de pilhas tracheal da escova pelo fluxo cytometry.

Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato

A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Este protocolo descreve um método para quantificar a produção de óxido nítrico (NO) em culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI), medindo nitrito em secreções apicais usando um ensaio de quimioluminescência baseado em triiodeto.

Medição da produção de óxido nítrico em culturas celulares epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas na interface ar-líquido

Aprenda a isolar células basais e células ducto de glândulas submucosas da traqueia de camundongos. Este método permite estudar regeneração epitelial in vivo e identificar vias de autorrenovação celular.

Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

Explorar mais vídeos