Name: Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a dissecção da utrícula de camundongo adulto e infecção de células de suporte com adenovírus. Este método permite estudar biologia de células ciliadas e regeneração auditiva em modelos in vitro.

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Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação. Apoio adicional foi fornecido por NIDCD 5R01 DC007613.

1. Dissecção utrículo e Cultura <ol><li> Euthanize um adulto (4 semanas de idade ou mais velhos) do mouse através de um protocolo aprovado e decapitar. </li><li> Cortar o canal auditivo externo em ambos os lados da cabeça e puxar a pele para a frente para o nariz. Bisect a cabeça de trás para a frente e retirar o cérebro de ambos os lados para revelar o labirinto ósseo. </li><li> Aparar o crânio para longe da cóclea óssea e transferir o labirinto ósseo (incluindo a bolha) para um capuz de cultura de tecidos equipado com um microscópio de dissecação (Nota: Adenovirus trabalho deve ser realizado numa câmara de segurança biológica Classe II). </li><li> Na capa, transferir cada cóclea para um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos contendo estéreis meios de dissecção (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A). </li><li> Se a bula auditiva ainda está intacto (é possível remover a bolha durante a dissecção macroscópica, inserindo o seu polegar entre a bula eo ápice doa cóclea), utilizar duas pinças (um # 3 e # 5 um) para quebrar a bolha (Figura 1B). </li><li> Identificar os marcos da preparação cóclea óssea: ápice, base, ossículos, janelas oval e redonda, VIII raiz nervosa, canais semicirculares (Figura 1 C, D). </li><li> Colocar o ouvido interno no prato com o lado medial voltada para cima, de tal modo que as janelas oval e redonda e ápice estão na parte inferior do prato ea raiz do nervo VIII está virada para cima. Mantenha a preparação usando um # 3 fórceps na região dos canais semicirculares (Figura 1D). </li><li> Usando um bisturi equipado com uma lâmina de # 11, cortar o ápice da cóclea apenas apical para a raiz do nervo (Figura 1D). </li><li> Transformar a preparação de modo que a porção de corte é voltada para cima. Use o canal semicircular anterior como uma pega para estabilizar a preparação (Figura 1E). </li><li> Usando # 5 pinças, remova a cóclea nas modíolo baixopara a base. No ponto onde a região de gancho da cóclea vira para baixo, usar uma sonda fina (metade de um quebradas # 55 fórceps) para levantar a última prateleira óssea do lâmina espiral óssea (Figura 1F), revelando a sáculo. Apenas sob o sáculo é a platina do estribo, que é um marco importante. O utrículo é imediatamente adjacente ao platina do estribo (Figura 1G), e é rodeado por osso. Use a sonda para lascar o osso distância suficiente para revelar aproximadamente 1/3 do utrículo. Retire cuidadosamente o utrículo usando # 55 fórceps (Figura 1H). Este procedimento normalmente irá resultar na remoção do epitélio pigmentado telhado como o utrículo é puxada a partir da preparação óssea. No entanto, se o utrículo é removido com o epitélio telhado intacto, o telhado pode ser removida utilizando # 55 fórceps. </li><li> Utrículos para a infecção por adenovirus (ou experiências para imagens ao vivo) deve ter o otoconia removido durante a dissecção (antes da infecção).Neste caso, usar uma seringa Luer-Lock que é preenchida com os meios de dissecação e equipada com uma agulha de pequeno calibre (geralmente 26-28 manométrica). Segure o utrículo na borda usando # 55 fórceps (Figura 1I). Traga a ponta da agulha perto do utrículo com o bisel da agulha apontando para baixo. Use um fluxo de dissecar mídia para explodir o otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia pode ser removido por escovagem-los fora usando uma ferramenta de pestana (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que não vão se submeter a infecção adenoviral são normalmente cultivadas de livre flutuação em placas de 24 poços de cultura de tecidos com o otoconia intacta (veja abaixo a correção pós-remoção otoconia, que é mais fácil). </li><li> Uma vez que todos os utrículos são dissecados, alterar os meios de comunicação de dissecação para meios de cultura estéril: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado com 5% de FBS e 50 U / ml de penicilina G (Sigma). </li><li> Utrículos são cultivadas a 37 ° C e 5% de CO 2. Se as culturas são para ser maintaINED por mais de 48 horas, metade dos meios de cultura deve ser mudada a cada dois dias. Culturas pode ser mantida, durante uma semana ou mais. </li></ol> 2. Infecção por adenovírus de Células de Apoio Importante: Trabalhando com o adenovírus exige Nível de Biossegurança 2 (BSL2) procedimentos e certificação. Verifique com o seu Diretor de Biossegurança Institucional para a orientação e treinamento sobre BSL2 procedimentos. <ol><li> Dissecar utrículos como acima em meios de dissecção (sem soro). Remover otoconia como acima. </li><li> Quando pronto para infectar, transferir um utrículo (células ciliadas acima) em cada poço de uma mini-Nunc bandeja-(Fisher # 12-565-68) contendo 15 uL DMEM isento de soro F12 (isto é importante porque o soro pode inactivar o vírus) . Esta transferência é mais fácil com um 1,5 milímetros microcurette (# 10082-15 de Ferramentas Ciência Belas). </li><li> O nosso Ad-GFP é serotipo 5 com os genes virais E1 e E3 e apagados do promotor de CMV humano dirigindo o transgeno (GFP). Este vírus foi obtido a partir de Vector Biolabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Os vírus de Stock são fornecidos em títulos de 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml. Adicionar 0,5-2 ul de estoque de vírus a cada poço contendo um utrículo (Figura 1D). A quantidade real utilizada varia, dependendo do título do vírus e do material. Nós normalmente infectam cada utrículo com 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Cultura os utrículos em vírus, contendo meios a 37 ° C / 5% de CO2 durante 2 horas. Após 2 horas, transferir os utrículos de volta para a placa de cultura de 24 poços contendo meio de cultura de tecidos com o soro. Cultura os utrículos durante a noite a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utrículos pode ser usado no dia seguinte para experiências para imagens ao vivo, ou eles podem ser fixados para imunoquímica de células ciliadas (ver abaixo). Aumentos transgene virais expressão ao longo do tempo, por isso, se a expressão do transgene é baixa de 24 horas pós-infecção, ele podebenéfico para células de cultura de um período adicional de 24 horas em soro contendo meios de comunicação. Se você ver toxicidade celular de cabelo, reduzir a quantidade de vírus utilizado. </li></ol> 3. Fixação utrículo, Remoção otoconia e Imunoquímica <ol><li> No final do período de cultura, fixar utrículos em paraformaldeído a 4%, quer para 3 horas à temperatura ambiente (numa plataforma de agitação) ou durante a noite a 4 ° C. Utrículos de lavagem (3 vezes, 15 min cada) em 0,1 M (1X) pH tampão de Sorensen fosfato 7,4. Estes passos são realizados numa placa de cultura de 24 poços de tecido. </li><li> Otoconia remoção: Nota: otoconia deve ser removido antes da infecção com adenovírus (ver passo 1,11, supra). No entanto, utrículos que não são para ser infectadas podem ser cultivadas e fixada com o otoconia ainda intacta. Neste caso, use os passos descritos aqui para remover o otoconia após a fixação. Inspecione utrículos para qualquer epitélio pigmentado telhado restante. Remova cuidadosamente qualquer epitélio telhado restante usando dois f # 55orceps. Para remover o otoconia, substituir tampão de Sorensen de fosfato com 750-1000 uL Cal-Ex descalcificante (Fisher # CS510-1D). Deixe Cal-Ex em utrículos por 1 minuto e 40 segundos (não ultrapassar 2 minutos). Substituir Cal-Ex com 0,1 M de tampão fosfato de Sorensen e de lavagem (5 vezes, 5 min cada). </li><li> Incubar utrículos em boro-hidreto de sódio (Sigma # 452,882, 1% em água desionizada) durante 10 mins. Lavar utrículos em tampão fosfato 0,1 M de Sorensen (5 vezes, 5 min cada). </li><li> Utrículos lugar em solução de bloqueio (PBS + 2% de albumina sérica bovina + 0,8% do normal soro de cabra + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Adicionar anticorpos primários e incubar durante a noite a 4 ° C. Anti-Miosina 7a (quer Proteus Biosciences # 25-6790 ou # 138-1 MYO7A a partir do Developmental Estudos Hybridoma Bank) em 1:100 em solução de bloqueio rótulos todas as células ciliadas. Para separadamente rotular células ciliadas striolar e não-striolar, utilizou-se um duplo Protoco-labell com anticorpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma # 3545 C; 1:150) e policlonais anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, EUA; 1:200). Os anticorpos secundário (geralmente Alexa Fluor anticorpos secundários conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) são diluídos 1:500 em solução de bloqueio e incubadas durante 4 horas no escuro à temperatura ambiente em uma plataforma de agitação. </li><li> Utrículos montagem em lâminas de vidro usando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA). </li></ol> 4. Os resultados representativos Utrículos cultivadas utilizando este método reter complementos da tanto as células do cabelo e células de suporte (Figura 2). As células capilares nas culturas saudáveis ​​mostram redondos perfis nucleares rodeadas por finas regiões citoplasmáticas que são miosina 7a-positivo (Figura 2, painel superior). Células de suporte (marcado com anti-Sox2) são menores e mais densamente do que células ciliadas (Figura 2, painel inferior). Adeadenovírus infecta 25-50% das células de suporte na utrículo, e não as células ciliadas são infectadas (Figura 2, o Ad-GFP painéis). Deve notar-se que o título óptima de trabalho de cada adenovírus devem ser determinadas empiricamente, dado que a morte celular de cabelo é possível se o título virai é muito alta. Além disso, as regiões de danos mecânicos (causados ​​durante a dissecção) vai ocupar grandes quantidades de vírus. Estas regiões de danos mecânicos são facilmente distinguíveis por uma linha contínua de células com níveis muito elevados de expressão da GFP e células ciliadas ausentes. Isto está em contraste com a expressão da GFP dispersa em células de suporte de uma cultura danificado (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. Utrículo Dissection. A: C A bula é quebrada usando duas pinças robustas::. Auditivo bulla (AB) B. Cóclea Bony (RW = janela redonda, S =. artéria estapediano, C = cóclea, st = estribo) D: A lâmina de bisturi (SB) é usado para cortar o ápice da cóclea apical do nervo craniano VIII (8 º N) ASC = E canal semicircular anterior..: A preparação é mantida firmemente usando uma pinça # 3 com um garfo inserido no canal semicircular anterior (ASC) eo outro sobre o osso mais exterior (setas). O labirinto membranoso é removido utilizando fórceps F:. Com o labirinto membranoso removido, o giro basal da lâmina espiral óssea é visível perto da região de gancho. Uma sonda fina é inserido por baixo desta prateleira ósseo para levantar a prateleira para cima e removê-la (seta) G:. Após a remoção do sáculo, utrículo (U) é visível imediatamente adjacente à platina do estribo (SF) H:. Utrículo (U ) é removido usando um fórceps # 55 (seta) SF = platina do estribo I:.. utrículo com otoconia (O) parcialmente removida umad sensoriais epitélio (SE) por baixo visíveis J:. otoconia (O) são removidos do utrículo com uma corrente de material fornecido por uma seringa com uma agulha de calibre 26. A sombra da agulha (S) é visível na parte inferior da imagem de K:. Utrículo com otoconia removido e epitélio sensorial (SE) L visível:. Infecção adenoviral: cada utrículo (U) é colocado em um poço individual de um mini -bandeja. Células de suporte são infectadas com adenovírus por pipetagem de vírus para dentro do poço (P = ponta de pipeta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. Adenovírus mediada infecção de células de suporte. Utrículos foram infectadas com adenovírus de condução de expressão da proteína fluorescente verde (Ad-GFP). Mostrado são imagens confocais da camada de células do cabelo e da camada de células de suporte na mesma área de um utrículo. As células ciliadas são rotulados com um anticorpo contra 7a Miosina(Magenta). Células de suporte são rotulados com um anticorpo contra Sox2 (vermelho). Esquemática mostra a estrutura do epitélio utricular sensorial e as localizações das células ciliadas (HC) e células de suporte (SC). Localizações de confocal (óptico) secções mostradas na parte superior (U) e inferior (L) Os painéis são indicadas por linhas tracejadas na esquemática. Os painéis superiores: Em imagens confocais tomadas ao nível dos núcleos de células ciliadas, Ad-GFP sinal aparece nos espaços entre as células ciliadas e não se sobrepõem com o cabelo 7a Miosina célula marcador. Os painéis inferiores: Em secções confocal ao nível dos núcleos das células de suporte, Ad-GFP sinal colocalizes com o marcador de células de suporte Sox-2. Resultados anúncio GFP-infecção em GFP expressão em células de suporte apenas, e não células ciliadas estão infectados. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Infecção adenoviral não resultar na morte das células ciliadas ou células de suporte. Utricles foram infectadas com o Ad-GFP em 4 × 10 8 PFU / ml. Utrículos foram marcadas com anticorpos contra Miosina 7a (marcador de células ciliadas) e Sox2 (suportando marcador de células). Células ciliadas e contagem de células de apoio foram iguais para utrículos controle e Ad-GFP utrículos infectados.

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Não há conflitos de interesse declarados.

As células pilosas sensitivas são susceptíveis à morte provocada por uma variedade de tensões, incluindo o envelhecimento, trauma de ruído, e exposição a drogas ototóxicas, incluindo os antibióticos aminoglicósidos e da cisplatina agente antineoplásico. Em mamíferos cabelo resulta de morte celular em perda permanente da audição e / ou distúrbio do equilíbrio. Em sistemas de modelo in vitro são ferramentas importantes para estudos que visem determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes a ...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de Catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Meio 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 55)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine fórceps (# 5)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fórceps (# 3)</td&gt;<td&gt; Belas Ferramentas Ciência</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soro fetal de bovino</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-bandeja-</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovírus GFP-</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ex-Cal descalcificante</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Boro-hidreto de sódio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (policlonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7 Anti-Miosina (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Banco</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindina</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabela 1</strong&gt;. Reagentes e instrumentos utilizados na cultura utrículo e infecção por adenovírus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP normalmente é fornecido pelo Biolabs vetor em um título de estoque de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Nós solicitada uma amplificação costume, a fim de proporcionar o vírus Estoque a um título de 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus infecção mediada por células coadjuvante

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

A perda de audição e distúrbios de equilíbrio são frequentemente causada pela morte das células ciliadas mecanosensorial, que são as células receptoras do ouvido interno. Uma vez que não há nenhuma linha de células que satisfatoriamente representa células capilares dos mamíferos, a investigação sobre as células ciliadas depende culturas de órgãos principais. A melhor caracterizados in vitro sistema modelo de células maduras de cabelo de mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratinhos adultos (Figura 1) 1-6. O utrículo é um órgão vestibular, e as células ciliadas do utrículo são semelhantes em estrutura e função das células ciliadas no órgão auditivo, o órgão de Corti. O adulto preparação utrículo rato representa um epitélio maduro sensorial para os estudos dos sinais moleculares que regulam a sobrevivência, a homeostase e morte dessas células. Mamífero células ciliadas são terminalmente diferenciadas e não são regenerados, quando são perdidos. Em não-mamvertebrados do Mali, auditivas ou morte celular vestibular cabelo é seguido por regeneração robusta que restaura a audição e equilíbrio funções 7, 8. Regeneração de células ciliadas é mediada por células gliais-like células de suporte, que contactam com as superfícies basolateral de células ciliadas no epitélio sensorial 9, 10. Células de suporte são também mediadores importantes da sobrevivência de células ciliadas e morte 11. Recentemente, desenvolveu uma técnica para a infecção de células de suporte em utrículos cultivadas utilizando adenovírus. Usando o adenovírus tipo 5 (dE1/E3) para entregar um transgene contendo GFP sob o controlo do promotor de CMV, descobrimos que o adenovírus especificamente e de forma eficiente infecta células de suporte. Suportando eficiência de infecção de células é de aproximadamente 25-50%, e as células do cabelo não estão infectadas (Figura 2). Importante, descobrimos que a infecção adenoviral de células de suporte não resultar em toxicidade para as células ciliadas ou células de suporte, tal como as contagens de células em Ad-GFP infutrículos ected são equivalentes aos da não-infectadas utrículos (Figura 3). Assim adenovírus mediada por expressão gênica em células de suporte de utrículos cultura fornece uma ferramenta poderosa para estudar os papéis de células de suporte, como mediadores da sobrevivência das células ciliadas, morte e regeneração.

Células ciliadas mecanosensorial são as células receptoras do ouvido interno. A melhor caracterizado<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo de células maduras capilares dos mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratos adultos. Apresentamos a dissecção do utrículo rato adulto, e demonstramos adenovírus mediada por infecção de células de suporte no utrículos cultivadas.

Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

A perda auditiva e os distúrbios do equilíbrio são frequentemente causados pela morte de células ciliadas mecanossensoriais, que são as células receptoras do ouvido interno. Visto que há...

Esta apresentação é uma demonstração dos procedimentos para culturas de órgãos inteiros do utrículo de camundongos adultos. Também será demonstrado o uso de adenovírus para infectar células de suporte do utrículo cultivado. Isso é realizado primeiramente dissecando cuidadosamente o utrículo da orelha interna.O segundo passo é remover o epitélio do teto. Em seguida, as otoconias são removidas, deixando o epitélio sensorial intacto. O passo final é infectar as células de suporte do sáculo utilizando adenovírus.Essas técnicas podem ser utilizadas em uma ampla variedade de experimentos projetados para examinar células ciliadas e células de suporte maduras de mamíferos in vitro. As células receptoras sensoriais na orelha interna são chamadas de células ciliadas, e essas células são responsáveis por converter energia sonora ou movimento da cabeça em sinais neurais para o cérebro.A perda auditiva é frequentemente causada pela morte dessas células ciliadas sensoriais. Para estudar os mecanismos subjacentes à morte das células ciliadas sensoriais, é muito útil dispor de um sistema modelo in vitro. O método que demonstraremos utiliza culturas de órgãos inteiros do utrículo de camundongos adultos.O utrículo é um órgão vestibular na orelha interna, e as células ciliadas do utrículo são semelhantes às células ciliadas no órgão auditivo, chamado órgão de Corti. O preparo do utrículo é o sistema modelo mais bem caracterizado para estudos de células ciliadas e células de suporte de mamíferos adultos. Além disso, demonstraremos um método que nosso laboratório desenvolveu recentemente para usar adenovírus a fim de infectar as células de suporte do utrículo.A técnica do adenovírus permite-nos examinar os papéis das células de suporte como mediadoras da sobrevivência, morte e regeneração das células ciliadas. Utilizamos estas técnicas em nosso laboratório para abordar duas questões principais. Primeiro, quais são os sinais celulares e moleculares que determinam se uma célula ciliada sob estresse sobrevive ou morre?E em segundo lugar, como podemos utilizar essas informações para desenvolver terapias, terapias clínicas para prevenir ou reverter a perda auditiva? Lindsey Maye, uma bióloga do meu laboratório, demonstrará essas técnicas. A demonstração visual da dissecação do utrículo é importante porque o tecido é pequeno e frágil, sendo muito suscetível a danos mecânicos, especialmente durante as etapas de remoção das otoconias e do epitélio de cobertura.Após eutanasiar e decapitar um camundongo adulto de acordo com um protocolo aprovado institucionalmente de cuidados e uso de animais, biseccione o crânio do cóccix até a região rostral e remova o cérebro de ambas as metades para expor o labirinto ósseo. Em seguida, retire os tecidos ao redor da cóclea óssea e transfira o labirinto ósseo para uma placa de cultura tecidual de 35 milímetros contendo meio estéril, 1 99. Se o bulbo auditivo ainda estiver intacto, utilize duas pinças resistentes para quebrar o bulbo.Reserve um momento para identificar os marcos anatômicos da preparação óssea, incluindo o ápice, a base, os acúleos, as janelas oval e redonda, a raiz do nervo auditivo e os canais semicirculares, conforme visto nestas imagens reproduzidas no protocolo escrito. Oriente a preparação no recipiente de modo que os ossículos fiquem na parte inferior do recipiente e a raiz do nervo auditivo esteja voltada para cima. Use uma pinça para segurar a preparação na região dos canais semicirculares e, com um bisturi de lâmina número 11, corte o ápice da cóclea logo acima da raiz nervosa. Utilize o canal semicircular anterior como alça para estabilizar a preparação e gire-a de modo que a porção cortada fique voltada para cima.Agora, utilizando pin&ccedil;as n&uacute;mero cinco, remova a c&oacute;clea no modi&oacute;lio at&eacute; a base. Em seguida, use uma sonda fina feita da metade de uma pin&ccedil;a n&uacute;mero 55 para levantar a &uacute;ltima sali&ecirc;ncia &oacute;ssea da l&acirc;mina espiral &oacute;ssea. Para revelar o S abaixo do S est&aacute; a placa basal do estape.Esta imagem mostra a placa basilar do estape (sf), que é um marco importante para identificar a posição do utrículo (U), localizado imediatamente adjacente à placa basilar do estape. Use a sonda fina para remover cuidadosamente o osso suficiente para expor cerca de um terço do utrículo. Em seguida, utilizando pinças número 55, remova cuidadosamente o utrículo segurando-o muito próximo à borda ou na raiz do nervo.Se o epitélio pigmentado do teto ainda estiver aderido ao utrículo, remova-o utilizando pinças finas. Se os túbulos semicirculares forem utilizados para infecção por adenovírus, a remoção das otoconias é necessária para realizar este procedimento. Encha uma seringa com meio de dissecação e acople uma agulha de calibre 26 ou 28.Segure a utrícula na borda com pin&ccedil;as n&uacute;mero 55 e remova os ot&oacute;conios usando um fluxo de meio. Alternativamente, os ot&oacute;conios podem ser removidos com uma ferramenta de c&iacute;lio. Depois que todas as U tiverem sido dissecadas, troque o meio de dissec&ccedil;&atilde;o por meio de cultura est&eacute;ril e coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de di&oacute;xido de carbono.Todos os procedimentos com adenovírus são realizados de acordo com as precauções de nível biosseguro dois. Quando estiver pronto para infectar, use uma cureta micro para transferir um grupo de células ciliadas do utrículo para um poço de uma bandeja sem mini contendo 15 microlitros de D-M-E-M-F 12 sem soro. Adicione de uma a quatro vezes 10 à sétima unidades formadoras de placa de adenovírus ao poço contendo o cultivo do utrículo.O u trickles e o meio contendo vírus são incubados a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada durante duas horas. Após duas horas, transfira o u trickles para uma placa de cultura tecidual de 24 poços contendo meio de cultura com soro. Uma vez transferido, o u trickles é novamente cultivado durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Os utrículos podem ser usados no dia seguinte para experimentos de imagemagem ao vivo ou podem ser fixados para imunoquímica. Os utrículos são fixados em paraformaldeído 4% em uma plataforma agitadora por três horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o utrículo três vezes, por 15 minutos cada, em tampão fosfato sorenson 0,1 molar.Se os otocônios não foram removidos para a infecção por adenovírus, remova-os neste momento imergindo o utrículo em calx decalcify por um a dois minutos, depois lave com solução tampão fosfato de sorense 0,1 molar e imerja o utrículo na solução bloqueadora por três horas à temperatura ambiente. Após a etapa de bloqueio, dilua o anticorpo primário na solução bloqueadora. Adicione à placa contendo os utrículos e incube durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave os utrículos e as cócleas com tampão fosfato. Em seguida, adicione o anticorpo secundário diluído na solução bloqueadora e incube por quatro horas, protegido da luz, em temperatura ambiente, em uma plataforma agitadora. Por fim, monte o utrículo em lâminas de vidro utilizando o Flora Mount G. Essas imagens confocais mostram a camada de células ciliadas e a camada de células de suporte na mesma região de um utrículo infectado com adenovírus que induz a expressão da proteína verde fluorescente.As células ciliadas são marcadas com um anticorpo contra a miosina sete A, que aparece em magenta. As células de suporte são marcadas com um anticorpo contra socks, dois, que aparece em vermelho aqui. Pode-se observar que o GFP do adenovírus se localiza nas células de suporte e não nas células ciliadas.Este gráfico demonstra que a infecção adenoviral com o adenovírus GFP a quatro vezes 10 à oitava. Unidades formadoras de placas por mililitro não resulta na morte de células ciliadas ou células de suporte uma vez que a dissecação seja dominada. Tanto o utrículo quanto de um único animal podem ser colocados em cultura em 10 a 15 minutos.No entanto, é importante, durante o desenvolvimento deste procedimento, lembrar-se de ter calma e cuidado ao manipular o tecido após este procedimento. Outros métodos, como imagem confocal em tempo real, imunohistoquímica, R-T-P-C-R e Western blot, podem ser realizados para responder perguntas sobre a morte, sobrevivência e regeneração de células de suporte e células ciliadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar o utrículo e infectar células de suporte utilizando adenovírus.Lembre-se de que trabalhar com vírus pode ser perigoso e requer biossegurança. Precauções de nível dois devem sempre ser adotadas ao realizar estes procedimentos.

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

A abordagem cirúrgica pós-auricular descrita permite a entrega rápida e direta na escala timpânica coclear do camundongo, minimizando a perda de sangue e a mortalidade animal. Este método pode ser usado para terapia coclear usando entrega molecular, farmacológica e viral a camundongos pós-natais através da membrana da janela redonda.

Método cirúrgico para Virally Mediated Gene entrega à orelha de rato Inner através da janela redonda Membrane

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Culturas organotypic tridimensional do utrículo murino e cóclea em opticamente clara colágeno eu geles preservar tecido inata morfologia, permitam a estimulação mecânica através do ajuste da rigidez da matriz e permitam a entrega de genes mediada por vírus.

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Aprenda a dissecção da utrícula de camundongo adulto e infecção de células de suporte com adenovírus. Este método permite estudar biologia de células ciliadas e regeneração auditiva em modelos in vitro.

Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

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