Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

O objetivo geral deste procedimento é gerar células T reguladoras humanas a partir de células T primárias. Primeiro, os monócitos do sangue periférico são isolados de amostras de sangue humano. As células T positivas para CD4 são então purificadas da mistura de PBMC e cultivadas.

Após seis dias, as células são separadas em subpopulações de células T efetoras, de memória ingênuas e reguladoras induzidas utilizando um citômetro de fluxo, sendo realizados ensaios de supressão. O uso dessas células demonstra que este método gera células T reguladoras humanas com atividade supressora. As principais vantagens desta técnica em comparação com aquelas que utilizam células mononucleares são que o nosso método humano possui maior relevância fisiológica e clínica e permite a comparação de células Treg com outras populações celulares dentro de um único doador.

Eliminação da variabilidade interna entre os indivíduos. Este método pode responder perguntas fundamentais no campo das células reguladoras, como quais são os eventos regulatórios que modulam a transição entre linfócitos T convencionais e células reguladoras, ou quais são os eventos de sinalização e transcrição específicos das células reguladoras? As implicações desta técnica estendem-se às terapias de doenças autoimunes, condições inflamatórias e câncer, devido ao papel essencial que as células regs desempenham na homeostase imunológica.

Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades devido à variedade de métodos utilizados e, em alguns passos, à estreita janela de condições ideais de cultivo celular. Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento reg, ele também pode ser usado para monitorar a plasticidade da diferenciação de linhagem de linfócitos T ou para analisar a capacidade do mililitro de linfócitos T em induzir ou prevenir esse processo. Desenvolvimento reg. Quem demonstrará o procedimento será Andrea McCool e os estudantes de pós-graduação Marie Catherine Ranier Gavin Ellis e Catalina Vale Ortega.

Inicie este procedimento isolando células mononucleares do sangue periférico humano de 40 a 60 litros de coágulo leucocitário (Buffy coat); para diluir o coágulo leucocitário, transfira-o para uma garrafa de vidro estéril de 500 mililitros contendo 150 mililitros de PBS estéril. Em seguida, adicione mais PBS estéril para elevar o volume final a 250 mililitros. Depois, encha 10 tubos cónicos de 50 mililitros, cada um com 20 mililitros de solução Lympho Prep.

Em seguida, sobreponha cuidadosamente a solução Lympho prep com 25 mililitros do coágulo leucocitário diluído, tomando cuidado para não perturbar a solução de Lympho prep. Centrifugue os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente a 500 vezes G. Certifique-se de desligar o freio da centrífuga para não perturbar a fração de linfócitos.

Após a centrifugação, o CS de PBM estará na interface entre as camadas do meio de linfoprep e do plasma, para coletá-los. Aspire o meio plasmático até que cerca de um mililitro ainda cubra a camada do coágulo branco contendo os pbmc. Utilize uma pipeta de 10 mililitros para transferir os pbmc para um novo tubo de 50 mililitros.

Após lavar as células duas vezes com PBS, re-suspenda-as em 50 mililitros de RPMI frio e conte-as utilizando um hemocitômetro. A recuperação típica é de oito vezes 10 à oitava até um vezes 10 à nona PBMCs após a determinação da concentração. Re-suspenda os PBMCs em concentração final de cinco vezes 10 à sétima por mililitro em PBS contendo 2% de FBS e um milimolar de EDTA e transfira as células para um tubo novo de polipropileno com fundo redondo de 14 mililitros.

Em seguida, o kit de EA será utilizado para selecionar negativamente as células de interesse. Os coquetéis de enriquecimento de linfócitos T fornecidos com o kit contêm um complexo tetramérico de anticorpos, que possui um anticorpo anti-dextrina em um dos lados e um anticorpo contra antígenos de superfície celular indesejados no outro lado. Quando o coquetel é adicionado às células, o complexo tetramérico de anticorpos liga as células indesejadas.

Em seguida, são adicionadas partículas magnéticas revestidas com dextrana, que se ligam ao complexo tetramérico de anticorpos, conectando a célula indesejada à partícula magnética. Um ímã é então aplicado para separar as células indesejadas das células de interesse, que são coletadas para isolamento de linfócitos T CD4 positivos. Pipete de um vezes 10 à oitava até 4,25 vezes 10 à oitava de pbmc em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 50 microlitros do coquetel de enriquecimento de linfócitos T CD4 positivos humanos, contendo anticorpos, para cada mililitro de pbmc.

Misture e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Agite as partículas magnéticas para distribuí-las uniformemente por toda a solução. Adicione 100 microlitros de partículas magnéticas para cada mililitro de PBMC.

Agite suavemente por pipetagem duas a três vezes e, em seguida, incube-os em temperatura ambiente por 10 minutos. Adicione PBS contendo FBS e EDTA para completar o volume até 10 mililitros por tubo, misturando suavemente por pipetagem duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo sem tampa no ímã cept por cinco minutos, mantendo o tubo ainda dentro do ímã.

Despeje o líquido em um novo tubo de 50 mililitros para isolar as células de interesse e obter melhor recuperação. Repita este processo adicionando P-B-S-F-B-S-E-D-T-A adicional ao tubo, misturando e colocando a amostra novamente no ímã. Uma vez que as células tenham sido isoladas, conte-as e, em seguida, centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Resuspenda o pellet celular no meio de polarização para atingir uma concentração de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, prossiga com o cultivo conforme descrito na próxima seção do vídeo para induzir células T regulatórias. Pré-aqueça placas de cultura tecidual de seis poços revestidas com anti-CD3 a 37 graus Celsius.

Uma vez que as placas estejam aquecidas, aspire o PBS dos poços. Em seguida, adicione quatro mililitros da suspensão de células enriquecidas em CD4 positivo a cada poço. Preencha quaisquer poços vazios com PBS para reduzir a evaporação do meio e incube por três dias após a incubação.

Centrifugue a placa por cinco minutos a 500 vezes G. Em seguida, sem perturbar as células no fundo da placa, remova metade do meio e substitua por meio fresco, incubando por mais dois a três dias. As células podem agora ser classificadas por meio de classificação de células ativadas por fluorescência, conforme descrito na próxima seção, ou utilizadas como células-alvo em um ensaio de supressão, conforme descrito posteriormente. Após dois a três dias, as células e os controles de compensação apropriados são preparados para a classificação de células ativadas por fluorescência. Para separar por classificação as células T regulatórias induzidas, as células T naïve e de memória, marque as células a serem classificadas com anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 e anti-CD127 APC, conforme descrito no documento anexo.

Certifique-se também de adicionar anticorpos aos controles de compensação apropriados para análise em citômetro de fluxo. Após a coloração, ressuspenda as células em uma concentração de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro de tampão de lavagem, então adicione 1,5 microlitros de DNase II por mililitro de células e filtre as células através de um filtro de nylon de 40 mícrons. Transfira as células para tubos de polipropileno redondos de cinco mililitros, com não mais de 3,5 mililitros por tubo.

Re-suspenda as células-controle de compensação em 300 microlitros de tampão de lavagem. Ajuste a compensação no citômetro de fluxo para minimizar a detecção cruzada pelos filtros PE, APC e PE-Cy5. Defina as janelhas para separar as células T reguladoras, células T naïve e células T de memória em tubos de poliestireno redondos de cinco mililitros contendo um mililitro de soro de bezerro recém-nascido para avaliar se as células T reguladoras geradas durante a separação são capazes de suprimir a proliferação de linfócitos T.

Um ensaio de supressão é realizado aqui. As células enriquecidas CD4 positivas não ordenadas funcionarão como células-alvo. Essas células não devem conter linfócitos T reguladores induzidos CD25 positivos.

Inicie rotulando as células-alvo com CFSE utilizando um kit de rastreamento celular de acordo com as instruções do fabricante, usando um microlitro de solução estoque cinco molar por mililitro de células em vez de dois microlitros. Em seguida, faça um pellet de um número de microesferas inspector de supressão treg equivalente ao número total de células por meio de centrifugação rápida em tubo de microcentrífuga. Lave as microesferas uma vez com RPMI e refaça o pellet após a centrifugação.

Aspire o RPMI e re-suspendas à concentração apropriada em oito microlitros de meio de ensaio de supressão por poço em uma placa de cultura tecidual de fundo redondo com 96 poços. Adicione as células-alvo marcadas com CFSE, oito microlitros. Inspecione as microesferas e as células classificadas polarizadas até um volume final de ensaio de supressão fresco.

Meio de 200 microlitros. Todas as condições são semeadas em triplicata. Para preparar os controles, adicione 100 microlitros de células coradas com CFSE, oito microlitros de microesferas indicadoras e uma vez 10 à quinta de células frescas não coradas em 92 microlitros do ensaio de supressão.

Adicione meio por poço aos dois primeiros poços controle. Em seguida, adicione 100 microlitros de células marcadas com CFSE e uma vez 10 à quinta de células frescas não marcadas em 92 microlitros de ensaio supressor. Adicione meio por poço aos dois segundos poços controle.

Cubra a placa com papel alumínio e coloque-a no incubador por cinco dias no escuro. Colete as células de cada poço por pipetagem e coloque-as em um tubo de poliestireno redondo de cinco mililitros. Centrifugue as células a 500 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o meio e reuspenda-os em 300 microlitros de tampão de lavagem frio. Para monitorar o progresso da diferenciação de células T reguladoras induzidas, linfócitos T CD4 positivo CD25 negativo primários humanos purificados foram cultivados em alíquotas de meio iTreg, coletadas no dia 0, 1, 3 e 5, e analisadas por citometria de fluxo para avaliar a expressão dos marcadores CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e CD25, conforme pode ser observado nestes gráficos de pontos em pseudocores. Ao longo de um período de cinco dias, as células proliferam e se diferenciam in vitro em resposta ao cruzamento de CD3 na presença de TGF-beta e IL-2, resultando, por fim, em um perfil CD45RA negativo, FoxP3 alto, CTLA-4 alto e CD25 alto. Isso indica o desenvolvimento de Treg induzidas a partir de precursores de linfócitos T convencionais, para avaliar a capacidade relativa das Treg geradas de suprimir a proliferação de linfócitos T.

Células marcadas com CFSE foram cultivadas com microesferas indicadoras de supressão por Treg na presença de células Treg e memória naïve classificadas, conforme pode ser observado neste histograma. Células CD25 alto, CD45RA negativo, CD127 negativo. As células T reguladoras induzidas baixas são o único subconjunto proveniente de um cultivo de cinco dias que adquiriu capacidade supressora regulatória.

Isso indica que as células geradas neste sistema são células T reguladoras supressoras tanto fenotipicamente quanto funcionalmente, e não células T convencionais ativadas, que podem expressar transitoriamente FOX P três e CD 25, mas não são imunossupressoras. A presença de células T reguladoras induzidas abole completamente a proliferação de células T positivas para CD quatro. Os números indicam a porcentagem de células marcadas com CFSC que sofreram divisão, para determinar que o mesmo ocorre com subconjuntos purificados de células T.

Células T primárias humanas, naïve e de memória, foram coradas com CFSE e cultivadas nele. Após cinco dias em meio para Treg, as células foram fenotipadas e as taxas de divisão celular foram estimadas conforme observado. Aqui, Tregs foram induzidas a partir de um pool de células T naïve e de um pool de células T de memória após cultivo de cinco dias.

No meio padrão de regulação IT, coloração com CFSE. O tingimento das células iniciais mostra que tanto linfócitos T naïve quanto de memória se diferenciam em linfócitos T reguladores apenas após várias rodadas de divisão celular; perfis comparativos de coloração com CFSE identificam os linfócitos T reguladores induzidos como as células mais proliferativas durante o cultivo de cinco dias. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter linfócitos T induzidos a partir de uma população de linfócitos T naïve, de memória ou totais obtidos de um único doador durante a tentativa deste procedimento.

É importante manter uma técnica estéril durante todo o procedimento e evitar a exposição do CFSE à luz após este procedimento. Outros métodos, como ensaios funcionais, podem ser realizados para responder a outras questões, como quais são as diferenças nas taxas de divisão celular, na síntese específica de citocinas e no uso de canais iônicos entre linfócitos T reguladores e convencionais após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de imunologia explorassem doenças autoimunes e outras patologias relacionadas às tregs em pacientes humanos.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano é extremamente perigoso e precauções, como testes adequados em bancos de sangue e descarte apropriado, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.