Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

A análise de interação COMIN utilizando sequenciamento de fragmentos e marcadores é um método para análise de interações genômicas de longa distância em todo o genoma. De forma resumida, chamamos isso de prancheta mágica compartilhada. Este método envolve muitas etapas de biologia molecular e pode ser complicado.

Portanto, neste próximo vídeo, mostraremos alguns dos principais passos envolvidos na imunoprecipitação de cromatina e na construção da biblioteca para a análise de PET por imunoprecipitação de cromatina. A imunoprecipitação de cromatina, conhecida como ChIP, é o primeiro passo crítico na construção de uma biblioteca ChIP-PET. Neste procedimento, amostras de cromatina provenientes de culturas celulares são reticuladas, sonicadas e imunoprecipitadas.

Alíquotas separadas de DNA do chip são então ligadas a half linkers com códigos de barras e a ligação de proximidade é realizada. Os PETS são liberados por digestão com enzima de restrição, purificados em esferas magnéticas revestidas e ligados a adaptadores para sequenciamento de nova geração. Os PETS em forma de quimera são identificados pela composição do linker AB e pela região flanqueadora da etiqueta.

A sequência do conector central é lida e mapeada para o genoma. Neste vídeo, mostraremos o protocolo padrão de chip rotineiramente utilizado em nosso laboratório em uma linhagem celular de câncer de mama MCF seven. A partir de nossos dados, um maior enriquecimento no chip com anticorpos específicos resulta em melhores dados de chair pet. Por isso, recomendamos fortemente a otimização do protocolo de chip e a validação do enriquecimento por QPCR.

Antes de prosseguir para a construção da biblioteca chair pet, sete culturas celulares são cultivadas até cerca de 75% de confluência em uma placa de cultura tecidual de 500 centímetros quadrados, o que corresponde a aproximadamente 20 milhões de células antes da reticulação. Descarte o meio de crescimento e lave as células duas vezes. Com PBS morno, fixe as células com EGS recém-preparado 1,5 milimolar durante 45 minutos em um agitador rotativo à temperatura ambiente e adicione formaldeído a 37% para uma concentração final de 1% e incube por 20 minutos.

A eficiência da reticulação é crítica e varia conforme a linhagem celular e a proteína de interesse. A concentração, tempo de incubação e temperatura da reticulação devem ser otimizadas. Inative os reticulantes com uma concentração final de 200 milimolar de glicina durante 10 minutos.

Descarte os agentes de reticulação inativados e lave duas vezes com PBS frio. Recolha as células raspando o pellet com um centrifugador de bancada refrigerado. O pellet está agora pronto para a lise celular. Alternativamente, congele o pellet a menos 80 graus Celsius. Se o pellet celular estiver congelado, descongele-o sobre gelo antes de prosseguir com a lise celular e reconstitua o pellet com tampão de lise contendo 0,1% de SDS.

Rotacione o tubo a quatro graus Celsius com uma centrífuga refrigerada, descarte o sobrenadante e repita a lise celular. Uma vez realizada a lise nuclear para liberar a cromatina reticulada antes da fragmentação da cromatina. A ausência da membrana nuclear permite que a cromatina reticulada seja sonificada em condições mais brandas.

Reúna a paleta nuclear de Reus no tampão de lise com 1% de SDS. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de alta velocidade. Gire o tubo a quatro graus Celsius.

Remova detritos nucleares por centrifugação. A paleta cromática deve ter esta aparência. Use uma ponteira de pipeta P1000 para fragmentar a paleta e lave duas vezes com Tampão de lise 0,1% SDS.

Centrifugue o tubo a quatro graus Celsius com uma centrífuga refrigerada. O pellet nuclear está agora pronto para sonicação. Alternativamente, congele o pellet a menos 80 graus Celsius.

Transfira o palato para um tubo transparente. Adicione tampão de lise com SDS 0,1% ao palato e remova todas as bolhas. Mantenha as amostras frias durante toda a sonicação para evitar superaquecimento. Diferentes condições, como volume de tampão, profundidade da sonda, intensidade da sonicação, número de ciclos e grau de reticulação, podem influenciar a eficiência da sonicação.

Realize a inversão da reticulação e alíquota da cromatina usando proteinase K e execute um gel aros. Para verificar a eficiência da fragmentação, a otimização é recomendada para obter a faixa desejada de tamanho de DNA entre 200 e 600 pares de bases. Remova os detritos celulares por centrifugação.

A cromatina agora está pronta para ser pré-limpa com esferas magnéticas. Alternativamente, pode ser interrompida a menos 80 graus Celsius até que quantidade suficiente de cromatina seja coletada. Para iniciar um chip, lave as esferas três vezes com tampão de lavagem de esferas; esta e as futuras lavagens envolvendo esferas magnéticas de proteína consistem nas seguintes etapas.

Adicione a cromatina sonificada às esferas pré-lavadas e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um tubo separado. Recubra as esferas pré-lavadas com anticorpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as esferas recobertas com anticorpo duas vezes com tampão de lavagem de esferas.

A alta complexidade do substrato para a ligação por proximidade inevitavelmente leva a um ruído não específico substancial, aumentando assim o custo do sequenciamento. Além de reduzir o nível de complexidade e o ruído de fundo, utilizamos um anticorpo monoclonal contra a polimerase de RNA de camundongo tipo dois para identificar interações da cromatina envolvidas na regulação da transcrição.

Isso permite a investigação de promotores ativos e suas regiões regulatórias correspondentes, possibilitando a compreensão da transcrição eficiente e possivelmente cooperativa. Descarte o tampão de lavagem dos grânulos revestidos com anticorpo, combine a cromatina pré-limpa com os grânulos revestidos com anticorpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação noturna, os grânulos são submetidos a uma série de lavagens para remover a cromatina não ligada e os grânulos em alíquotas de tampão TE. Uma pequena quantidade é utilizada para análise quantitativa e verificação de enriquecimento. A análise de interação da cromatina utilizando sequenciamento pad e tag é uma técnica desenvolvida para análise em larga escala *de novo* de estruturas cromatínicas de ordem superior que interagem.

Fragmentos de DNA que foram enriquecidos por imunoprecipitação de cromatina são capturados por ligação de proximidade. A estratégia de pad e tag é aplicada à construção de bibliotecas CHI PET, que são sequenciadas por tecnologias de sequenciamento de nova geração de alto rendimento. Neste vídeo, mostraremos os aspectos experimentais críticos na construção de bibliotecas CHI PET.

A primeira metade da construção da biblioteca envolve a manipulação de microesferas de proteína A ou G, às quais os fragmentos de DNA estão ligados, para remover as enzimas e o sal tampão. Após cada reação enzimática, utilize centrifugação suave e movimento rápido com o dedo em cada etapa de lavagem. Pipete o sobrenadante várias vezes para maximizar a captura das microesferas quando colocadas em um separador magnético.

Concentrador para todos os passos de incubação contendo esferas na mistura reacional. Prepare a mistura mestra previamente e adicione a enzima por último, após as esferas serem ressuspendidas homogeneamente. Certifique-se de que as esferas estejam bem misturadas durante toda a incubação. Os oligonucleotídeos semilinkers são projetados com um código de barras interno composto por quatro nucleotídeos e um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição tipo dois S MME1.

Após a ligação dos semilinkers aos fragmentos de DNA ancorados nos complexos cromatínicos C, os fragmentos de DNA interagentes serão conectados por uma sequência completa de linker. Esses semilinkers geram sequências com linkers heterodímeros ab derivados de produtos de ligação não específicos ou sequências com linkers homodímeros, AA ou BB, derivados de produtos de ligação específicos. Assim, o uso de dois semilinkers com códigos de barras nucleotídicos diferentes permite a especificação de diferentes experimentos ou réplicas, bem como o monitoramento das taxas de ligação quimérica não específica entre diferentes complexos de chip.

É importante montar a reação no gelo e descongelar suavemente os half linkers sobre o gelo. Combine bem os half linkers com água e, em seguida, com tampão de ligase contendo PEG. Certifique-se de que a mistura mestra esteja bem homogeneizada antes da ressuspensão.

Suspenda o DNA do chip e adicione T4 DNA ligase somente após os half linkers e os fragmentos de DNA do chip estarem bem misturados, para prevenir a concatenação dos half linkers. Selle o tubo com parafina e incube durante a noite a 16 graus Celsius com rotação. Os complexos de cromatina intactos são então eluídos das esferas pela adição de SDS no tampão EB para eluir o DNA, reduzindo a concentração de SDS com Triton X-100 para neutralizar todo o SDS. A circularização dos complexos de cromatina é facilitada pela ligação de dois half linkers, criando uma sequência completa de linker na junção de interação. Realize a ligação dos complexos de cromatina eluídos em condições extremamente diluídas para minimizar as ligações entre diferentes complexos de DNA-proteína, utilizando T4 DNA ligase somente após os complexos de cromatina eluídos terem sido bem diluídos na mistura de reação. Após a desreticulação, remova as proteínas associadas ao DNA e purifique os fragmentos de DNA circularizados utilizando extração com fenol-clorofórmio, empregando o sistema de gel de bloqueio de fase KaiGen para fácil separação.

Após a extração com fenol, utilize o corante glicoblue, um vetor de DNA, para aumentar a massa e a visibilidade do palato. Os oligonucleotídeos de ligação parcial contêm sítios de reconhecimento MM E um nas regiões flanqueadoras. A enzima de restrição tipo dois S MM E um corta 18 e 20 pares de bases a jusante de seus sítios de ligação alvo, gerando fragmentos curtos do fragmento de cromatina, produzindo construtos de ligação com fragmentos chamados PET, abreviados como pets.

Além disso, cada ligante parcial é modificado com biotina para permitir a purificação de construtos pet por meio de microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Realize uma digestão com MME para liberar os construtos do ligante marcador. Purifique os pets por ligação seletiva a microesferas de adenina ligadas e ligue os construtos pet aos adaptadores para sequenciamento de alto rendimento.

Use uma polimerase de fusão para amplificar a Biblioteca de Fusão CHI PET. A polimerase de DNA é utilizada para gerar modelos com alta precisão e eficiência. Monte a reação de PCR em temperatura baixa e adicione a polimerase de fusão por último.

Como a enzima apresenta atividade exonucleolítica de três para cinco que pode degradar primers na ausência de DN Tps. Se a biblioteca de plásmidos for construída com sucesso, deve haver uma banda proeminente e bem definida de aproximadamente 223 pares de bases. Evite bandas inespecíficas ao recortar a banda de 223 pares de bases do gel e purifique a banda recortada utilizando o Protocolo de Trituração em Gel.

Realize uma verificação de qualidade utilizando o bioanalisador Agilent 2,100 com um kit DNA 1000 antes do sequenciamento de alto rendimento. Acabamos de demonstrar o procedimento CHI PET para detecção imparcial de interações de cromatina em todo o genoma. A qualidade dos dados CHI PET depende da eficácia do anticorpo do chip utilizado e da profundidade do sequenciamento.

Aqui utilizamos de 18 a 20 milhões de leituras para o mapeamento de interações. Este protocolo específico foi usado com sucesso para caracterizar redes de interação da cromatina ligadas ao receptor de estrógeno e à RNA polimerase no genoma humano. Prevemos que este ensaio seja uma ferramenta poderosa para estudos futuros da biologia da transcrição na arquitetura tridimensional em contexto de genoma inteiro.

Esperamos que este vídeo seja útil para você. Obrigado por assistir.I.