Name: Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Aprenda o método ChIA-PET para mapear interações cromatínicas em larga escala e compreender a regulação transcricional. Esta técnica combina imunoprecipitação de cromatina com ligação de proximidade e sequenciamento de nova geração.

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Os autores são apoiados por A * STAR de Cingapura. Além disso, MJF é apoiada por um Nacional ESTRELA A * Bolsa de Ciência, L&#39;Oréal para Mulheres na Ciência Nacional Fellowship e Lee Kuan Yew Sociedade Pós-Doutorado. YR é suportado pelo NIH (R01 Codificar subsídios HG004456-01 e R01 HG003521-01). Os autores também reconhecem a equipe de vídeo de 8 Productions Pixels, de Cingapura, em especial o Sr. Kelvin Issey, Chang Kai Xiang Sr. e Sherwin Mr. Gan para filmar as cenas, a Sra. Siti Rahim para edição de vídeo e Michelle Sra. Teo para o voice-over.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Chia-PET é um método desenvolvido para identificar interações de longo alcance na regulação da transcrição. Um dos factores críticos que determinam a qualidade de uma biblioteca de Chia-PET é a qualidade do material ChIP. O protocolo mostrado no vídeo incorpora o uso de EGS e formaldeído para reticular as células. A utilização de formaldeído combinado com um reagente de ligação cruzada tendo um segundo braço mais longo espaçador pode ajudar na ligação de proteínas que não podiam ser ligados por formaldeído sozinho 3,11,15. Foram construídas bibliotecas com este método que demonstraram robustos sítios de ligação e de longo alcance das interacções 9. No entanto, a reticulação e das condições de chip deve ser optimizada para cada factor de interesse, e é importante para não sobre-reticulação como demasiada reticulação irá resultar em dificuldades de fragmentação por sonicação, e pode possivelmente resultar em interacções de cromatina espúrios . Interações de cromatinaidentificado por Chia-PET deve ser validado por um método diferente, tais como hibridação in-situ de fluorescência 4. Recomendamos um mínimo de 100 ng de material de cromatina. Embora tenhamos construído bibliotecas de boa qualidade a partir de 50 ng de material de cromatina, observou-se que grandes quantidades de material de partida permitiu a construção de bibliotecas de Chia-PET com menos de 16 ciclos de PCR, amplicons, minimizando assim e redundância de cada biblioteca. Esta menor redundância correlacionada com a maior únicas marcas mapeadas e também uma alta porcentagem de dados úteis, permitindo assim um mapa de interação mais abrangente cromatina com pistas menos de seqüenciamento. O volume final embalado de grânulos em cada tubo deve ser de 50 uL e 100 uL de pérolas magnéticas e Sepharose respectivamente. Se o volume embalado grânulo é menos do que o indicado, para trazer o volume mínimo embalado com similarmente pré-limpos em branco esferas magnéticas ou Sepharose para minimizar a perda de DNA-rolamento de esferass nas etapas subseqüentes. Cano serrado dicas ou grande-core dicas devem ser usadas para pipetagem contas Sepharose. As modificações que se seguem foram incorporados na sequência do publicado anteriormente Chia-PET protocolo 5. Em primeiro lugar, as esferas magnéticas g foram utilizados para minimizar a perda de amostra durante as lavagens. Além disso, identificou-se as bandas não específicas com tamanhos aproximados de 100 pb e 138 pb para ser amplicões de auto-ligadura meias-linkers e / ou adaptadores. Assim, nós reduziu a concentração de biotinilados meias-linkers e 454 GS20 adaptadores para minimizar as bandas não específicas durante a amplificação por PCR. O volume ligadura proximidade foi reduzida de 50 ml a 10 ml para minimizar a perda de amostra durante os passos de purificação subsequentes e também economizar nos custos de reagentes. Nós também aumentou o tempo de incubação para imobilizar Chia-PET DNA para grânulos para garantir a captura máxima de Chia-PET ADN sobre as pérolas de estreptavidina. Durante o passo de ligação proximidade, ligaduras quiméricos that não representam verdadeira de interacções in vivo de cromatina são inevitavelmente gerado de uma forma não-específica e aleatórios. Assim, para avaliar a qualidade dos dados a partir de qualquer experiência Chia-PET, a taxa de quimerismo é estimado a partir da utilização de dois diferentes meias-linkers com específica de nucleótidos códigos de barras e TAAG ATGT 5. Depois de alto rendimento sequenciação, as sequências de Chia-PET são primeiro analisado para uma composição de código de barras linker e sequências derivadas de produtos de ligação específicos e produtos não específicos de ligação podem ser distinguidos 8. A percentagem de quimeras conhecidos (isto é, ligantes heterodímeros AB) apresentam no nosso em casa MCF-7 a RNA polimerase II Chia-PET bibliotecas é menos do que 15%. Chia-PET sequências são posteriormente classificadas em duas categorias, a saber, auto-ligadura os animais de estimação e laqueadura inter-PETS. Auto-ligação TAP são obtidos a partir de auto-circularização ligadura dos fragmentos de cromatina, enquanto a ligadura inter-TAP são derivados a partir de inter ligadura entre dois fragmentos de DNA diferentes. Este último é, então, sub-divididos em três categorias diferentes com base na distância genômico de cada tag no mesmo cromossomo (intracromossômica ligadura inter-PET) ou que ambas as marcas são mapeados para dois cromossomos diferentes (intercromossômicas ligadura inter-PET). Nós desenvolvemos um Chia-PET pacote de software ferramenta para classificar as diferentes categorias 8. Isto será baseado nos fragmentos de ADN que estão na biblioteca. Geralmente, os fragmentos menores chip vai dar uma maior resolução e cortado o para estes RNA polimerase II Chia-PET bibliotecas é de cerca de 4 kb. Além disso, as interacções de cromatina reais pode ser distinguida de ruído aleatório por contagem do número de ligadura inter-TAP em um cluster de interacção, por outras palavras, um aglomerado de contagem de PET de alta diz-se ter uma maior probabilidade de ser uma interacção real, 8 cromatina . Para filtrar os falsos positivos umsubir de âncoras altamente enriquecido, que pode formar a ligadura inter-PETs por acaso, um quadro de análise estatística também foi formulada para explicar a formação aleatória de algum animal de estimação de ligação inter-entre duas âncoras 8. Em conclusão, a técnica Chia-PET permite o mapeamento de redes de interação de cromatina em uma escala global. A implementação de ChIP em Chia-PET permite a redução da complexidade da biblioteca e ruído de fundo. Além disso, adiciona ChIP especificidade para as interacções de cromatina, permitindo o exame das interacções de cromatina específicos associados com factores de transcrição específicos 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 4-20% gradiente de TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Passo B, 6,3 </td></tr><tr><td> 5 x tampão ligase T4 DNA com PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Passo B, 2,2 </td></tr><tr><td> 6% de gel de TBE </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Passo B, 6,8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Ensaio </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Passo B, 7,1 </td></tr><tr><td> Agilent Ensaio DNA de alta sensibilidade </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugar Filtros Tubo (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Passo B, 3,7 e 6,9 </td></tr><tr><td> Transilluminator Leitor escuro </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Passo B, 6,8 </td></tr><tr><td> Digital Celular Sonifier Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Passo A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 ímã (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Passo A, Passo B 7.5.1, para todos os passos de lavagem esferas magnéticas </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Ímã (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Passo A, 5 e 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Concentrador de Partículas Magnéticas) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Passo B, 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA Polimerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Passo B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Passo A, Passo B 7.5.1, 4,3 e 6,5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Sistema de Geração de Cluster </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Passo B, 7,4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Passo B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Passo B, 5,4 (se necessário) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Passo B, quaisquer incubações com rotação </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Passo A, Passo B 7.5.3, 7,3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Etapa B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Estreptavidina Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Passo B, 5,2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnética (Dynabeads) Proteína G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Etapa A, 5.1.1 e 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract de Alta Densidade (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Passo A 7.5.1, </td></tr><tr><td> MaXtract de Alta Densidade (50 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Passo B, 4,2 </td></tr><tr><td> CEMm </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase Ribonuclease ONE </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Passo B, 4,8 </td></tr><tr><td> RNA polimerase II (8WG16) anticorpo monoclonal </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Passo A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Tubos da centrífuga (polipropileno) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Passo A, 3,1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Tubos da centrífuga (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Passo B, 4,3 </td></tr><tr><td> Phusion Alta Fidelidade Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Passo B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) Reagente dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Passo A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Poliestireno Tubo de Ensaio de fundo redondo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Passo A, 4,1 </td></tr><tr><td> Inibidor da Protease Comprimidos Cocktail (completo, EDTA-free) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Etapa A, 1.6 em diante </td></tr><tr><td> Proteinase K Solução (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Passo A, 4,4, 7.5.1 Passo B, 4,1 </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Passo B, 2,2, 3,9 e 5,4 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligase Buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Passo B, 3,3 e 3,9 </td></tr><tr><td> DNA polimerase de T4 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Passo B, 1,2 </td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 DNA </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Passo B, 3,3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regentes para Illumina Genome Analyzer IIx sistema </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> para ser usado com Illumina Sistema de Geração de Cluster CBOT </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Etapa B, 6,3 e 6,8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Sistema de Electroforese Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Etapa B, 6,3 e 6,8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td colspan="2"> Seqüência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado meias-linkers A (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole HPLC purificada Interna Biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole HPLC escala purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilado meias-linkers B (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole HPLC purificada Interna Biotina dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GGA GTT TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole HPLC escala purificada </td></tr><tr><td rowspan="2"> Não biotinilado meias-linkers (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;TTG GGA TCC ATC GAT GC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;TCT CCA CAT CCC TGC GTG CAT TCCCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA GGA GGG AAC CAG AGA TGG CAG GAC ACG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptador B (200ng/μl) </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;GCA CTG AGA CAC ACA AGG GGG GAT CAA GGC CAG ACA GG GGG ATA 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCT CCC TGT GTG TGC CCT CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adaptadores </td><td> Topo </td><td> 5 &#39;CTC TTT ACA ACG CCC TAC ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole escala purificada por HPLC Veja Etapa B, 5,4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;fosfato - GAT CGG GGT AAG AGC TCA ACG GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmole escala purificada por HPLC fosforilada 5 &#39;Veja Etapa B, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (frente) primer (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;ACG AAT GAT GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 primer (reverso) (10 mM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA ACG GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT ATC TCC ACT TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 escala nmole PCR Grau </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;ACG AAT GAT GCG GAG ACC ACC AT 3&#39; </td><td> 10nmole escala PCR Grau </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA ACG GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole escala PCR Grau </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 iniciador de sequenciação (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG CAT TCC CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole CLAE em escala purificada </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 iniciador de sequenciação (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT CTA TGC GTT GCG TCC CCT TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> Escala 100nmoleHPLC purificada </td></tr></tbody></table> Oligos Tabela de oligos e adaptadores. Pedido de DNA integrado Technologies (IDT) e preparar linkers e adaptadores da mesma maneira como descrito anteriormente 10. Meia-linkers e adaptadores podem ser preparados de antemão e armazenados durante vários meses a -20 ° C.

cromatina análise de interação com emparelhados fim-tag sequencing (chia-pet) para mapeamento interações cromatina e compreensão regulação da transcrição

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomas são organizadas em estruturas tridimensionais, que adopta conformações de ordem mais elevada no interior dos espaços micron de tamanho nucleares 7, 2, 12. Tais arquiteturas não são aleatórias e envolvem interações entre genes promotores e elementos regulatórios 13. A ligação de fatores de transcrição específicos para seqüências regulatórias traz uma rede de regulação da transcrição e coordenação 1, 14. Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) foi desenvolvido para identificar estas estruturas de ordem superior de cromatina 5,6. As células são fixadas e loci que interagem entre são capturados por covalentes DNA-proteína ligações cruzadas. Para minimizar o ruído não-específica e reduzir a complexidade, bem como para aumentar a especificidade da interacção análise da cromatina, cromatina imunoprecipitação (ChIP) é usada contra factores proteicos específicos para enriquecer fragmentos de cromatina de interesse antes da ligadura proximidade. Ligadura envolvendo meias-linkers subsequentemente forma ligações covalentes entre os pares de fragmentos de DNA amarrados em conjunto dentro de complexos de cromatina individuais. Os sítios de restrição flanqueando CEMm enzimas nas meias-linkers permitir a extração de pares finais tag-tag-linker construções (PETS) sobre a digestão CEMm. À medida que os ligantes são meias-biotinilado, essas construções de PET são purificados utilizando estreptavidina-magnéticos grânulos. Os PETs purificados são ligados com adaptadores de seqüenciamento da próxima geração e um catálogo de fragmentos de interação é gerada através de próxima geração de sequenciadores como o Analyzer Genoma Illumina. Mapeamento e análise bioinformática é então realizada para identificar ChIP enriquecido locais de ligação e as interações ChIP enriquecidos com cromatina 8. Produzimos um vídeo para demonstrar aspectos críticos do protocolo Chia-PET, especialmente a preparação de ChIP como a qualidade do ChIP desempenha um papel importante no resultado de uma biblioteca de Chia-PET. À medida que os protocolos sãomuito longo, apenas os passos críticos são mostrados no vídeo.

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método para<em&gt; De novo</em&gt; Detecção de interações de cromatina, para melhor entendimento do controle da transcrição.

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Os genomas são organizados em estruturas tridimensionais, adotando conformações de ordem superior dentro dos espaços nucleares de tamanho micrométrico 7, 2, 12. Tais...

A análise de interação COMIN utilizando sequenciamento de fragmentos e marcadores é um método para análise de interações genômicas de longa distância em todo o genoma. De forma resumida, chamamos isso de prancheta mágica compartilhada. Este método envolve muitas etapas de biologia molecular e pode ser complicado.Portanto, neste próximo vídeo, mostraremos alguns dos principais passos envolvidos na imunoprecipitação de cromatina e na construção da biblioteca para a análise de PET por imunoprecipitação de cromatina. A imunoprecipitação de cromatina, conhecida como ChIP, é o primeiro passo crítico na construção de uma biblioteca ChIP-PET. Neste procedimento, amostras de cromatina provenientes de culturas celulares são reticuladas, sonicadas e imunoprecipitadas.Alíquotas separadas de DNA do chip são então ligadas a half linkers com códigos de barras e a ligação de proximidade é realizada. Os PETS são liberados por digestão com enzima de restrição, purificados em esferas magnéticas revestidas e ligados a adaptadores para sequenciamento de nova geração. Os PETS em forma de quimera são identificados pela composição do linker AB e pela região flanqueadora da etiqueta.A sequência do conector central é lida e mapeada para o genoma. Neste vídeo, mostraremos o protocolo padrão de chip rotineiramente utilizado em nosso laboratório em uma linhagem celular de câncer de mama MCF seven. A partir de nossos dados, um maior enriquecimento no chip com anticorpos específicos resulta em melhores dados de chair pet. Por isso, recomendamos fortemente a otimização do protocolo de chip e a validação do enriquecimento por QPCR.Antes de prosseguir para a construção da biblioteca chair pet, sete culturas celulares são cultivadas até cerca de 75% de confluência em uma placa de cultura tecidual de 500 centímetros quadrados, o que corresponde a aproximadamente 20 milhões de células antes da reticulação. Descarte o meio de crescimento e lave as células duas vezes. Com PBS morno, fixe as células com EGS recém-preparado 1,5 milimolar durante 45 minutos em um agitador rotativo à temperatura ambiente e adicione formaldeído a 37% para uma concentração final de 1% e incube por 20 minutos.A eficiência da reticulação é crítica e varia conforme a linhagem celular e a proteína de interesse. A concentração, tempo de incubação e temperatura da reticulação devem ser otimizadas. Inative os reticulantes com uma concentração final de 200 milimolar de glicina durante 10 minutos.Descarte os agentes de reticulação inativados e lave duas vezes com PBS frio. Recolha as células raspando o pellet com um centrifugador de bancada refrigerado. O pellet está agora pronto para a lise celular. Alternativamente, congele o pellet a menos 80 graus Celsius. Se o pellet celular estiver congelado, descongele-o sobre gelo antes de prosseguir com a lise celular e reconstitua o pellet com tampão de lise contendo 0,1% de SDS.Rotacione o tubo a quatro graus Celsius com uma centrífuga refrigerada, descarte o sobrenadante e repita a lise celular. Uma vez realizada a lise nuclear para liberar a cromatina reticulada antes da fragmentação da cromatina. A ausência da membrana nuclear permite que a cromatina reticulada seja sonificada em condições mais brandas.Reúna a paleta nuclear de Reus no tampão de lise com 1% de SDS. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de alta velocidade. Gire o tubo a quatro graus Celsius.Remova detritos nucleares por centrifugação. A paleta cromática deve ter esta aparência. Use uma ponteira de pipeta P1000 para fragmentar a paleta e lave duas vezes com Tampão de lise 0,1% SDS.Centrifugue o tubo a quatro graus Celsius com uma centrífuga refrigerada. O pellet nuclear está agora pronto para sonicação. Alternativamente, congele o pellet a menos 80 graus Celsius.Transfira o palato para um tubo transparente. Adicione tampão de lise com SDS 0,1% ao palato e remova todas as bolhas. Mantenha as amostras frias durante toda a sonicação para evitar superaquecimento. Diferentes condições, como volume de tampão, profundidade da sonda, intensidade da sonicação, número de ciclos e grau de reticulação, podem influenciar a eficiência da sonicação.Realize a inversão da reticulação e alíquota da cromatina usando proteinase K e execute um gel aros. Para verificar a eficiência da fragmentação, a otimização é recomendada para obter a faixa desejada de tamanho de DNA entre 200 e 600 pares de bases. Remova os detritos celulares por centrifugação.A cromatina agora está pronta para ser pré-limpa com esferas magnéticas. Alternativamente, pode ser interrompida a menos 80 graus Celsius até que quantidade suficiente de cromatina seja coletada. Para iniciar um chip, lave as esferas três vezes com tampão de lavagem de esferas; esta e as futuras lavagens envolvendo esferas magnéticas de proteína consistem nas seguintes etapas.Adicione a cromatina sonificada às esferas pré-lavadas e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um tubo separado. Recubra as esferas pré-lavadas com anticorpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as esferas recobertas com anticorpo duas vezes com tampão de lavagem de esferas.A alta complexidade do substrato para a ligação por proximidade inevitavelmente leva a um ruído não específico substancial, aumentando assim o custo do sequenciamento. Além de reduzir o nível de complexidade e o ruído de fundo, utilizamos um anticorpo monoclonal contra a polimerase de RNA de camundongo tipo dois para identificar interações da cromatina envolvidas na regulação da transcrição.Isso permite a investigação de promotores ativos e suas regiões regulatórias correspondentes, possibilitando a compreensão da transcrição eficiente e possivelmente cooperativa. Descarte o tampão de lavagem dos grânulos revestidos com anticorpo, combine a cromatina pré-limpa com os grânulos revestidos com anticorpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação noturna, os grânulos são submetidos a uma série de lavagens para remover a cromatina não ligada e os grânulos em alíquotas de tampão TE. Uma pequena quantidade é utilizada para análise quantitativa e verificação de enriquecimento. A análise de interação da cromatina utilizando sequenciamento pad e tag é uma técnica desenvolvida para análise em larga escala *de novo* de estruturas cromatínicas de ordem superior que interagem.Fragmentos de DNA que foram enriquecidos por imunoprecipitação de cromatina são capturados por ligação de proximidade. A estratégia de pad e tag é aplicada à construção de bibliotecas CHI PET, que são sequenciadas por tecnologias de sequenciamento de nova geração de alto rendimento. Neste vídeo, mostraremos os aspectos experimentais críticos na construção de bibliotecas CHI PET.A primeira metade da construção da biblioteca envolve a manipulação de microesferas de proteína A ou G, às quais os fragmentos de DNA estão ligados, para remover as enzimas e o sal tampão. Após cada reação enzimática, utilize centrifugação suave e movimento rápido com o dedo em cada etapa de lavagem. Pipete o sobrenadante várias vezes para maximizar a captura das microesferas quando colocadas em um separador magnético.Concentrador para todos os passos de incubação contendo esferas na mistura reacional. Prepare a mistura mestra previamente e adicione a enzima por último, após as esferas serem ressuspendidas homogeneamente. Certifique-se de que as esferas estejam bem misturadas durante toda a incubação. Os oligonucleotídeos semilinkers são projetados com um código de barras interno composto por quatro nucleotídeos e um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição tipo dois S MME1.Após a ligação dos semilinkers aos fragmentos de DNA ancorados nos complexos cromatínicos C, os fragmentos de DNA interagentes serão conectados por uma sequência completa de linker. Esses semilinkers geram sequências com linkers heterodímeros ab derivados de produtos de ligação não específicos ou sequências com linkers homodímeros, AA ou BB, derivados de produtos de ligação específicos. Assim, o uso de dois semilinkers com códigos de barras nucleotídicos diferentes permite a especificação de diferentes experimentos ou réplicas, bem como o monitoramento das taxas de ligação quimérica não específica entre diferentes complexos de chip.É importante montar a reação no gelo e descongelar suavemente os half linkers sobre o gelo. Combine bem os half linkers com água e, em seguida, com tampão de ligase contendo PEG. Certifique-se de que a mistura mestra esteja bem homogeneizada antes da ressuspensão.Suspenda o DNA do chip e adicione T4 DNA ligase somente após os half linkers e os fragmentos de DNA do chip estarem bem misturados, para prevenir a concatenação dos half linkers. Selle o tubo com parafina e incube durante a noite a 16 graus Celsius com rotação. Os complexos de cromatina intactos são então eluídos das esferas pela adição de SDS no tampão EB para eluir o DNA, reduzindo a concentração de SDS com Triton X-100 para neutralizar todo o SDS. A circularização dos complexos de cromatina é facilitada pela ligação de dois half linkers, criando uma sequência completa de linker na junção de interação. Realize a ligação dos complexos de cromatina eluídos em condições extremamente diluídas para minimizar as ligações entre diferentes complexos de DNA-proteína, utilizando T4 DNA ligase somente após os complexos de cromatina eluídos terem sido bem diluídos na mistura de reação. Após a desreticulação, remova as proteínas associadas ao DNA e purifique os fragmentos de DNA circularizados utilizando extração com fenol-clorofórmio, empregando o sistema de gel de bloqueio de fase KaiGen para fácil separação.Após a extração com fenol, utilize o corante glicoblue, um vetor de DNA, para aumentar a massa e a visibilidade do palato. Os oligonucleotídeos de ligação parcial contêm sítios de reconhecimento MM E um nas regiões flanqueadoras. A enzima de restrição tipo dois S MM E um corta 18 e 20 pares de bases a jusante de seus sítios de ligação alvo, gerando fragmentos curtos do fragmento de cromatina, produzindo construtos de ligação com fragmentos chamados PET, abreviados como pets.Além disso, cada ligante parcial é modificado com biotina para permitir a purificação de construtos pet por meio de microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Realize uma digestão com MME para liberar os construtos do ligante marcador. Purifique os pets por ligação seletiva a microesferas de adenina ligadas e ligue os construtos pet aos adaptadores para sequenciamento de alto rendimento.Use uma polimerase de fusão para amplificar a Biblioteca de Fusão CHI PET. A polimerase de DNA é utilizada para gerar modelos com alta precisão e eficiência. Monte a reação de PCR em temperatura baixa e adicione a polimerase de fusão por último.Como a enzima apresenta atividade exonucleolítica de três para cinco que pode degradar primers na ausência de DN Tps. Se a biblioteca de plásmidos for construída com sucesso, deve haver uma banda proeminente e bem definida de aproximadamente 223 pares de bases. Evite bandas inespecíficas ao recortar a banda de 223 pares de bases do gel e purifique a banda recortada utilizando o Protocolo de Trituração em Gel.Realize uma verificação de qualidade utilizando o bioanalisador Agilent 2,100 com um kit DNA 1000 antes do sequenciamento de alto rendimento. Acabamos de demonstrar o procedimento CHI PET para detecção imparcial de interações de cromatina em todo o genoma. A qualidade dos dados CHI PET depende da eficácia do anticorpo do chip utilizado e da profundidade do sequenciamento.Aqui utilizamos de 18 a 20 milhões de leituras para o mapeamento de interações. Este protocolo específico foi usado com sucesso para caracterizar redes de interação da cromatina ligadas ao receptor de estrógeno e à RNA polimerase no genoma humano. Prevemos que este ensaio seja uma ferramenta poderosa para estudos futuros da biologia da transcrição na arquitetura tridimensional em contexto de genoma inteiro.Esperamos que este vídeo seja útil para você. Obrigado por assistir.I.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.

Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA

Aprenda o método ChIA-PET para mapear interações cromatínicas em larga escala e compreender a regulação transcricional. Esta técnica combina imunoprecipitação de cromatina com ligação de proximidade e sequenciamento de nova geração.

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição (Vídeo) | JoVE Journal

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

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