Name: A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprenda a microinjetar bactérias fluorescentes em embriões de zebrafish para imagem ao vivo das interações com células imunes. Este método permite visualizar a localização intracelular de patógenos bacterianos em fagócitos fluorescentes usando microscopia confocal.

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Os autores gostariam de agradecer Cui Chao, Andar de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho de imagens na Figura 4, Nehrdich Ulrike e de Davy Witt para cuidado dos peixes, e os membros do laboratório para outras discussões úteis. Este trabalho é apoiado pelo Programa Mix inteligente do Ministério neerlandês dos Assuntos Económicos e do Ministério da Educação, Cultura e Ciência, a Comissão Europeia sétimo projeto quadro ZF-SAÚDE (SAÚDE-F4-2010-242048), o Europeu Marie-Curie Formação inicial Rede FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), e pelo NHMRC australiano (637.394). O australiano Medicina Regenerativa Institute é suportado por concessões do Governo do Estado de Victoria e do governo australiano.

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<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
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<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
<li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
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<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
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<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos de infecção descritas neste artigo são frequentemente usados ​​para estudar a função dos genes hospedeiros inatas imunidade ou genes de virulência bacterianos 1. Os micro-injecção intravenosa métodos (protocolos 5 e 6.1) são usados ​​com mais freqüência para tais estudos. A veia caudal no ilha de sangue posterior é o local mais conveniente para injecção intravenosa de um dia de idade embriões. Como a veia caudal torna-se mais difícil de penetrar em fases posteriores, preferimos o ducto de Cuvier como local da injeção intravenosa de embriões em 2-3 dpf. Em todos os casos é fundamental para injetar os embriões com números consistentes de bactérias, que devem ser verificados por inóculos injeção de revestimento para a contagem de ufc. Os seguintes aspectos devem ser considerados para alcançar injeções reprodutíveis. Em primeiro lugar, é essencial ter vidro de alta qualidade agulhas de injecção microcapilar. Se a ponta da agulha é muito grande, a injecção irá criar um orifício de punção grande o suficiente para que ocorra o sangramento eas bactérias injectadas fluirá para fora da circulação sanguínea. Em segundo lugar, as bactérias devem ser injectado directamente para a circulação sanguínea. Se a ponta da agulha não está dentro da veia ou se espalha injecção de fluido para a extensão saco vitelino, o embrião deve ser descartada a partir da experiência. Em terceiro lugar, usando PVP40 como um portador para injectar M. marinum irá ajudar a prevenir as bactérias de afundar-se na agulha de vidro. PVP40 melhora a homogeneidade da suspensão, resultando em inóculos mais reprodutível durante toda a duração de injecções. PVP40 pode também ser utilizado para S. injecções typhimurium, mas aqui, é menos importante, porque o tamanho maior e fluorescência brilhante das bactérias permite um controlo visual sobre o inoculo de injecção durante as experiências. Para praticar as injecções recomenda-se a utilização de fenol corante vermelho (1% v / v) ou 1 mícron esferas fluorescentes disponíveis em cores diferentes (Invitrogen). Uma vez que a técnica é dominada, leva cerca de 30 minutes para injectar 50-100 embriões, incluindo o tempo necessário para alinhar os embriões em placas de agarose e ajustando o volume de injecção bacteriana. Enquanto injeções intravenosas para a ilha de sangue (protocolo 5) ou no ducto de Cuvier (protocolo 6.1) são os mais usados, as vias alternativas de infecção descritos neste artigo de vídeo têm se mostrado úteis para estudar a quimiotaxia de macrófagos e neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 , e 6,4), para estudar o crescimento de estirpes bacterianas atenuadas (protocolo 6,5), e para adaptar o modelo de infecção do peixe-zebra para aplicações de alto rendimento (protocolo 6,6) 4-8. As micro-injecção descritos métodos também podem ser aplicados para injecções de vírus 18, 19, esporos de fungos 14, 20 ou parasitas protozoários (Maria Forlenza, comunicação pessoal). Uma adição útil para os procedimentos de injecção descritos neste artigo de vídeo é um procedimento recentemente descrito para a injecção subcutânea de bactérias em zebrembriões afish 21. Este procedimento foi aplicado para estudar a fagocitose de bactérias por neutrófilos, que foram encontrados para as bactérias de forma eficiente engolfam em superfícies de tecido, mas, em contraste com os macrófagos, eram virtualmente incapaz de fagocitam bactérias mediante injecção no sangue ou em cavidades cheias de fluido do corpo. Para embriões injecções subcutâneas são posicionados semelhante como para as injecções de cauda musculares descritos neste artigo de vídeo, mas a agulha é inserida debaixo da pele para injectar as bactérias durante um somito. É importante considerar que a micro-injecção é essencialmente uma rota artificial de infecção. No entanto, os embriões precoces são altamente resistentes à exposição externa para agentes patogénicos bacterianos. De facto, os ensaios de imersão, em que os embriões são banhadas numa suspensão bacteriana, não são reprodutíveis nas nossas mãos 22. Enquanto alguns embriões podem ser infectados após imersão, temos observado uma grande variação nas taxas de mortalidade e na expressaião de genes marcadores inflamatórios entre os embriões individuais em tais ensaios. Os métodos de micro-injecção descritos neste artigo atingir infecções reprodutíveis e são particularmente úteis para estudar as interacções bacterianas com hospedeiras inatos células imunes. Uma abordagem eficiente para quantificar a infecção bacteriana em embriões individuais é analisar as imagens fluorescentes de embriões infectados com custom-made software de quantificação, dedicado pixels 17, 23. Esta abordagem tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os resultados das contagens de UFC após o plaqueamento de embriões infectados. Da mesma forma, mudanças relativas no número de leucócitos por embrião foram quantificados pela análise de imagem digital em transgênicos leucócitos linhas repórter fluoróforo; esta abordagem seria aplicável para quantificar a resposta do hospedeiro à infecção leukopoietic 24. A função do hospedeiro inatos genes imunes podem ser investigadas eficientemente in vivo através da combinação dos modelos de infecção descritascom knockdown morfolino. Morpholinos são oligonucleótidos anti-sentido sintéticos que têm como alvo RNAs específicos e reduzir a expressão dos produtos dos genes quando injectado 1 de células de embriões peixe-zebra fase, como mostrado na outros artigos de vídeo nesta revista 10, 25. Em estudos knockdown morfolino, é de grande importância que todos os grupos de embriões a serem comparadas são testados correctamente antes de injecções bacterianas. Isto é especialmente importante porque os embriões têm um desenvolvimento do sistema imunitário que se torna cada vez mais competente ao longo do tempo. Existem várias linhas transgénicas repórter actualmente disponíveis para distinguir os principais inatos subconjuntos imunes, macrófagos e neutrófilos, em embriões de peixe-zebra. A MPX e promotores LYZ têm sido usados ​​para gerar as linhas de repórter de neutrófilos 16, 26, 27, eo csf1r (SFM) e MPEG1 promotores foram usados ​​para produzir repórteres de macrófagos 14, 28. Enquanto csf1r (FMS) é adicionalmente expressa em xanthophores, mpeg1 expressão é exclusivamente nos macrófagos. Como mostrado neste artigo de vídeo, os recentemente desenvolvidos mpeg1 linhas repórter são altamente úteis para a fagocitose de imagem bacteriana por macrófagos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Vermelho de Fenol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco ágar Middlebrook 7H10 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook Enrichment OADC </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth Difco </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook Enrichment ADC </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> 3-aminobenzoato de etilo sal metanossulfonato (tricaina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil celulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agarose (baixo ponto de fusão de agarose) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 uM, vermelho fluorescente (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mM, amarelo-verde fluorescente (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

a infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões são cada vez mais utilizado como um modelo para estudar a função do sistema inato vertebrado imune no hospedeiro de organismos patogénicos interacções 1. Os principais tipos de células do sistema imune inato, macrófagos e neutrófilos, desenvolver-se durante os primeiros dias de embriogénese antes da maturação dos linfócitos que são necessários para as respostas imunitária adaptativa. A facilidade de obtenção de um grande número de embriões, a sua acessibilidade devido ao desenvolvimento externo, a transparência óptica de estágios embrionários e larval, uma ampla gama de ferramentas genéticas, extensos recursos mutantes e coleções de linhas repórter transgênicos, tudo isto contribui para a versatilidade do peixe-zebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum pode residir intracelularmente em macrófagos e são frequentemente usados ​​para estudar interações patógeno-hospedeiro em embriões de peixe zebra. Os processos a infecção destas duaspatógenos bacterianos são interessantes para comparar porque S. infecção typhimurium é aguda e letal dentro de um dia, enquanto M. marinum infecção é crônica e pode ser trabalhada até o estágio larval 2, 3. O local de micro-injecção de bactérias no embrião (Figura 1) determina se a infecção se tornar-se rapidamente sistémica ou será inicialmente permanecer localizada. Uma infecção sistémica rápida pode ser estabelecida por micro-injecção de bactérias directamente para a circulação do sangue através da veia caudal no ilha de sangue posterior ou através do duto de Cuvier, um canal de circulação de largura no saco vitelino de ligar o coração para a vasculatura do tronco. Em 1 dpf, quando embriões nesta fase têm macrófagos phagocytically ativos, mas neutrófilos ainda não amadureceram, injetando na ilha de sangue é o preferido. Para injeções em 2-3 dpf, quando os embriões também desenvolveram funcionais (mieloperoxidase produtora) neutrófilos, o ducto de Cuvier é preferido como tele no local da injecção. Para estudar a migração dirigida de células mielóides no sentido infecções locais, as bactérias podem ser injectado no músculo da cauda, ​​vesícula ótica, ou ventrículo rombencéfalo 4-6. Além disso, o notocórdio, uma estrutura que parece ser normalmente inacessíveis às células mielóides, é altamente susceptíveis à infecção local 7. Uma alternativa útil para aplicações de alto rendimento é a injeção de bactérias na gema de embriões nas primeiras horas após a fertilização 8. Combinando as bactérias fluorescentes e linhas de zebrafish transgênicos fluorescentes com macrófagos ou neutrófilos cria condições ideais para multi-cor de imagem de sistema patógeno-hospedeiro interações. Este artigo irá descrever vídeo protocolos detalhados para a infecção por via intravenosa e local de embriões de zebrafish com S. typhimurium ou M. bactérias marinum e para imagens de fluorescência posterior da interação com células do sistema imune inato.

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais como<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. A micro-injecção de bactérias e de multi-cor de imagem de fluorescência são técnicas essenciais envolvidos na aplicação de modelos de infecção peixe-zebra de embriões.

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Embriões de peixe-zebra (Danio rerio) são cada vez mais utilizados como modelo para estudar a função do sistema imune nato de vertebrados na interação hospedeiro-patógeno...

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar embriões de peixe-zebra com bactérias fluorescentes para a obtenção de imagens em tempo real da interação com células imunes do hospedeiro. Isso é realizado primeiramente preparando e carregando a agulha de injeção com suspensões bacterianas. Em seguida, os embriões são estagiados e alinhados em uma placa de injeção.Em seguida, o inóculo bacteriano é injetado utilizando uma via que permite obter uma infecção bacteriana local ou sistêmica. Por fim, os embriões são montados e submetidos à imagem. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a localização intracelular de patógenos bacterianos no interior de fagócitos fluorescentes do hospedeiro embriônico transparente de peixe-zebra por meio de microscopia de fluorescência e microscopia confocal.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de imunologia, pois o modelo de embrião de peixe-zebra é muito poderoso para a imagem em tempo real de interações entre patógenos e hospedeiros. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois ele exige muita prática para injetar de forma reprodutível bactérias na circulação sanguínea de embriões de peixe-zebra, a fim de provocar infecções sistêmicas, ou em compartimentos específicos para obter infecções locais. Após puxar as agulhas de capilar de vidro e biselar as pontas em um ângulo de 45 graus, estagie os embriões de peixe-zebra em 28 horas pós-fertilização, verificando a presença de circulação sanguínea constante, início da pigmentação no olho, cauda reta e coração posicionado logo ventralmente ao olho.Uma vez que os embriões estejam anestesiados, use uma ponteira de microloader para carregar a agulha com um inóculo bacteriano previamente preparado. Fixe a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um suporte e posicione-a sob um microscópio estereoscópico. Ajuste o tempo de injeção para 0,2 segundos e a pressão de compensação para 15 hPa.Ajuste a pressão de injeção entre 700 e 900 hectorpascais para obter o volume de injeção correto para a agulha utilizada. Posicione o micromanipulador com a agulha carregada na posição correta antes de realizar a injeção. Coloque os embriões anestesiados sobre uma placa de injeção plana contendo agarose 1% e remova qualquer excesso de água dos ovos.Em seguida, utilize uma alça de cabelo para alinhar os embriões para cada injeção. Mova a placa manualmente durante as injeções para orientar os embriões com as caudas apontando em direção à ponta da agulha. Posicione a ponta da agulha diretamente acima da veia coddle, próxima à abertura urogenital.Fure o periderma com a ponta da agulha e injete a dose desejada de bactérias marcadas com fluorescência. Utilizamos aproximadamente 250 unidades formadoras de colônia ou UFCs de salmonella typhimurium e aproximadamente 120 UFCs de mycobacterium marum. A suspensão bacteriana injetada seguirá o fluxo sanguíneo através da veia coddle em direção ao monitor cardíaco, caso a injeção tenha sido realizada corretamente, o que pode ser verificado pela expansão do volume do sistema vascular imediatamente após o pulso.Verifique frequentemente se o volume de injeção permanece o mesmo durante o experimento. Para fornecer um controle da consistência das injeções ao longo do experimento, injete uma gota de bactérias diretamente sobre uma gota de PBS estéril em meio de crescimento bacteriano. Aproximadamente a cada 30ª injeção de embrião, plaque esta gota e conte as colônias bacterianas após a incubação.Para determinar a UFC no volume de injeção, utilize um microscópio estereoscópico fluorescente para observar células individuais fluorescentes do estrias circulando na corrente sanguínea imediatamente após a injeção e descarte embriões que não foram corretamente injetados. Agregados fluorescentes de bactérias M marum devem ser visíveis dois dias após a infecção e aumentam de tamanho ao longo do tempo. Para injetar no ducto de Cuvier, alinhe embriões anestesiados de dois a três dias pós-fertilização.No caso da injeção na veia coddle em um ângulo de 45 graus a partir do lado dorsal do embrião, insira a agulha no ponto inicial do ducto de Cuvier. Logo dorsal à localização onde o ducto começa a alargar-se sobre o saco vitelino, para a posição de injeção no ventrículo do cérebro posterior. Anestesie embriões com 32 horas pós-fertilização com seu lado dorsal voltado para a ponta da agulha.Insira a agulha no ventrículo do cérebro posterior a partir de uma posição anterior, sem tocar o neurohilo, para injetar nos músculos da cauda. Posicione embriões anestesiados de um a dois dias pós-fertilização com a cauda voltada para a ponta da agulha e com a agulha em um ângulo aproximado de 65 graus; injete no músculo acima da abertura urogenital para injeções na vesícula ótica. Oriente embriões anestesiados de dois a três dias pós-fertilização com as caudas apontando em direção à agulha.Injete em um ângulo de 65 graus e com baixa pressão para introduzir no cordão do nó em embriões de um a dois dias pós-fertilização, com a cauda voltada para longe da agulha. Insira a agulha através do tecido muscular da cauda até o cordão.Para uma injeção no vitelo de embriões em estágio de 16 a 1000 células, perfure com a agulha o córion até o centro do vitelo para imagens da infecção. Anestesie os embriões infectados em uma placa de Petri com camada de 1%augurous coberta com água de ovo contendo trica. Usando uma alça de cabelo, alinhe os embriões na posição correta para a aquisição de imagens em um microscópio estereoscópico fluorescente.Podem-se observar individualmente células T fluorescentes circulando na corrente sanguínea logo após a injeção. Caso seja necessária uma posição diferente da vista lateral, monte os embriões em metilcelulose a 1,5% e utilize uma alça de cabelo para manipular o embrião até a posição desejada para a aquisição de imagens da infecção usando um microscópio confocal invertido.Coloque uma gota de aerogel de ponto de fusão baixo em um recipiente de vidro com fundo de vidro. Coloque o embrião anestesiado na gota de aerogel com uma quantidade limitada de água de ovo e use uma alça de cabelo para posicionar o embrião. Deixe o aerogel solidificar e submerja a gota de aerogel em água de ovo contendo trica.A amostra agora está pronta para injeção no interior da ilha sanguínea de embriões, um dia após a fertilização, de bactérias Salmonella typhimurium ou Mycobacterium marium, resultando na fagocitose rápida por macrófagos. A disseminação das bactérias estreptocócicas relativamente grandes e fortemente fluorescentes marcadas com DS.Red pode ser visualizada diretamente por microscopia estereoscópica de fluorescência e por microscopia confocal duas horas após a infecção, mostrando que muitas bactérias são fagocitadas por macrófagos fluorescentes.Uma dose de injeção de 250 UFC de styria selvagem induzirá uma forte resposta pró-inflamatória e será letal em um dia. Em contraste, a injeção intravenosa de erum leva a uma infecção persistente na qual macrófagos infectados formam agregados compactos considerados estágios iniciais de granulomas, que são a característica marcante da tuberculose. A imagem confocal de um agregado semelhante a um granuloma na linhagem transgênica EG um EGFP cinco dias após a infecção mostra o crescimento intracelular de bactérias M num marcadas com m-cherry.Dentro dos macrófagos fluorescentes verdes, as bactérias podem ser injetadas no ventrículo do cérebro posterior, um compartimento desprovido de macrófagos aos 32 horas pós-fertilização. A injeção de 20 a 100 UFC de bactérias M marum marcadas com mCherry neste compartimento resulta na rápida infiltração por macrófagos, que fagocitam as bactérias, conforme mostrado aqui. Ao utilizar o transgênico M-P-X-E-G-F-P, a injeção de aproximadamente 20 UFC de Styria na vesícula otica leva à atração de neutrófilos três horas após a infecção. Embora esta resposta não seja observada em injeções controle com PBS, a notocorda, que aparenta ser resistente à infiltração por leucócitos, é um compartimento permissivo para o crescimento de mutantes erum que são fortemente atenuados quando injetados em outros tecidos.Após a injeção na vesícula vitelínica de uma dose de 2240 UFC, as bactérias se espalham por vários dias pelos tecidos embrionários e formam agregados semelhantes a granulomas, semelhantes aos observados com o método convencional de injeção intravenosa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o estadiamento adequado dos embriões de peixe-zebra é crítico, pois o sistema imunológico embrionário torna-se progressivamente mais competente durante o desenvolvimento.Após este procedimento, outros métodos como o perfilamento do transcriptoma e a imuno-histoquímica podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como o sistema imunológico inato embrionário responde a infecções patogênicas.

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