Name: A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprenda a realizar testes de toxicidade letal em longo prazo com Artemia franciscana. Este protocolo padronizado avalia impactos de substâncias químicas e resíduos industriais em crustáceos marinhos por 14 dias.

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Produzido por Loredana Manfra do Instituto para a proteção ambiental e à pesquisa (ISPRA-Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental) e Savorelli Federica da Agência Regional de Proteção Ambiental (Emilia-Romagna, Itália). Os membros de referência para o subgrupo de trabalho sobre o crustáceo Artemia dentro do Grupo métodos biológicos - água salgada / água salobra e Sedimentos da Comissão UNICHIM da Qualidade da Água (Instituto para a operação de normalização técnica no sector químico). Videografia e edição por Marco Pisapia de ISPRA (Unidade de Web). Coordenação de Produção por Anna Maria Cícero e Magaletti Erika de ISPRA (Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental). Gostaríamos de agradecer à Agência Regional de Proteção Ambiental da Emilia-Romagna, Ferrara Branch, o Grupo de Métodos Biológicos - água salgada / salobraÁgua e Sedimentos da Comissão UNICHIM sobre Qualidade da Água e Migliore Luciana, da Universidade Tor Vergata (Roma) da sua cooperação; Boscolo Rossella e Massimo Gabellini de ISPRA (Departamento de Prevenção e Mitigação de Impactos) pelo apoio financeiro; Matassa Fabio e Londres Escola de Idiomas em Roma, pelo seu apoio linguístico.

1. Método Padrão O nosso teste envolve a exposição larvas de Artemia a um intervalo de concentrações da substância ou uma amostra de ensaio para a finalidade de determinar os níveis de concentração ou diluição que poderiam causar a morte de 50% dos organismos (CL 50) expostos ao longo de 14 dias e que satisfaça as condições definidas por este método. Se necessário e possível, a seguinte pode também ser determinada: a) o nível de concentração que causa a morte de 20% dos organismos expostos (LC 20), b) o nível de concentração mais elevada analisados ​​que não determina uma maior taxa de mortalidade do que a do o controlo negativo (NOEC); a concentração mais baixa testada que determina, após 14 dias, uma maior taxa de mortalidade do que a do controle negativo (LOEC). 2. Testing Materials 2.1 ovos de Artemia Para realizar testes, Artemia franciscana </em&gt; Larvas de menos de 48 horas de idade (náuplios) são necessários, no estádio II ou III, obtida a partir de ovos recentemente chocadas 5. Ovos ou cistos certificados utilizados para apoiar os testes estão disponíveis comercialmente, por exemplo, da Divisão de Pesquisa de Qualidade, EUA Agência de Proteção Ambiental, Cincinnati OH 45268, EUA ou do Laboratório de Pesquisas Biológicas da poluição aquática, Universidade de Ghent, na Bélgica. 2,2 diluição Água Água salgada sintética pode ser usado como água de diluição, preparada por dissolução de reconhecidos reagentes de qualidade analítica ou uma formulação comercialmente disponível em água destilada ou desionizada. Misturas de sal para a criação do ideal de água salgada estão comercialmente disponíveis, por exemplo, as misturas Instant Ocean. Recomenda-se uma água de diluição, com uma salinidade igual a 35 (± 2) PSU, bem como uma concentração de oxigénio dissolvido superior a 80% do valor de saturação e uma temperatura de 25 (± 2) egraus; C. Após arejamento durante 48 horas e de filtração em filtros com uma porosidade de pelo menos 0,45, a diluição pode ser armazenado durante um máximo de 30 dias no escuro a uma temperatura de 0-4 ° C. 2,3 cultura de algas Recomenda-se que os organismos de teste são alimentam de microalgas Dunaliella tertiolecta, que crescem exponencialmente e atingir densidades de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 células / ml. Testes em amostras ambientais requer culturas com densidades superiores a 2.0x10 6 células / ml 6. Sugere-se que Dunaliella tertiolecta cresce em meio de cultura contendo água do mar (30 (± 2) PSU e 20 (± 1) ° C) com a adição de nutrientes essenciais, minerais e vitaminas. Algumas indicações sobre a composição do meio de algas e preparação são apresentados no Apêndice. A densidade de células inicial é sugerido para ser de aproximadamente 10 5 células / ml. A cultura de algas é mantida numatermostato ambiente a 20 (± 1) ° C, iluminada com lâmpadas fluorescentes 3000 (± 300) lx, com um rácio de fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Espécies de fitoplâncton Outros também poderia ser utilizado para a alimentação mas seria necessário fazer estudos comparativos com estas espécies de fitoplâncton para encontrar os &quot;equivalentes&quot; espécies a Dunaliella tertiolecta, porque as condições experimentais (por exemplo, densidades celulares iniciais, de iluminação com luz, temperatura, composição do meios de cultura e tempo de exposição) varia entre as espécies do fitoplâncton. Além da tolerância do microalgas para diferentes poluentes precisa ser considerado, porque os efeitos de poluentes sobre o crescimento e desenvolvimento de impacto fitoplâncton também para a Artemia. 2,4 substância de referência A substância de referência no presente ensaio é dodecil sulfato de sódio. 2,5 de vidro para laboratório <ol><li> Recipientes de teste, incluindo 100 ml provetas de vidro de borossilicato (18 para executar os testes e 18 para a transferência de soluções). </li><li> Um balão (por exemplo, frasco de 500 ml) para preparar a solução padrão. </li><li> Seis frascos (por exemplo, 200 frascos ml) para preparar as soluções de teste. </li><li> De vidro ou poliestireno 5 cm de diâmetro pratos de Petri com tampas removíveis para ser usado para activar os cistos e transferindo Artemia a partir do prato incubação para os recipientes de teste. </li><li> Pipetas de vidro Pasteur (com pontas arredondadas por chama) para a transferência de náuplios. </li><li> Vidro cânulas ou Pasteur 3 ml descartáveis ​​pipetas de plástico (a ser cortado) para a transferência de Artemia. </li><li> Micropipetas e pipetas graduadas para preparar as soluções de teste. </li><li> Seis cilindros graduadas (por exemplo, 50 cilindros ml) para a transferência de soluções de teste a partir dos frascos para tele testando recipientes. </li></ol> 3. Ativação de cisto 3,1. Placas de Petri contendo cistos + de derramar água Para gerar organismos de teste, 20 mg de cistos são colocados em uma placa de Petri contendo 12 ml de água de diluição 48 horas antes do teste. 3,2. De incubação na luz e no escuro O prato Petri é mantida a 25 (± 2) ° C e à 4000 (± 1000) lux (lúmens por metro quadrado) a intensidade da luz durante uma hora. 3,3. Substituição do meio usando o microscópio Após 24 horas, a incubação de larvas são transferidos para uma placa de Petri de novo cheio com água artificial. A transferência é realizada utilizando o microscópio, ou seja, usando uma fonte de luz de modo que a incubação de larvas, phototropic migram para o feixe de luz. Uma pipeta de Pasteur de vidro é usado para fazer a transferência, assegurando que apenas o nascente larvas are transferido e não os quistos ou as larvas ainda em membranas. 3,4. A incubação no escuro O prato contendo as larvas é colocado numa câmara termostática escuro durante 24 horas a 25 (± 2) ° C. 4. Preparação das soluções de teste 4,1. Pesando a substância + transferir para o balão Recomenda-se que a solução padrão para a substância de teste é preparado por dissolução de 0,5 g da substância em um balão de 500 ml. O balão é cheio com água desionizada ou destilada ea solução é agitada até que a substância de teste é completamente dissolvido. Soluções têm de ser preparadas no momento da utilização, salvo se não se sabe se a substância é estável em solução. Nesse caso, a solução padrão podem ser preparados até dois dias antes do teste. 4,2. Preparação do controlo negativo, adicionando a água de diluição e algas with a 10 ml de pipeta O controlo negativo é preparada em um balão (por exemplo, o volume de 200 ml) por adição de uma alíquota da suspensão de algas para a água de diluição de modo que uma densidade de 10 5 células / ml é obtido. 4,3. Preparar as soluções de testes: a adição de água de diluição, as algas e uma solução padrão Sugere-se que as soluções de teste são preparados em cinco balões de 200 ml por adição da solução padrão para a água de diluição nas quantidades especificadas de modo a que as concentrações desejadas para teste é obtido. Para alimentar os organismos, alíquotas de uma suspensão de microalgas Dunaliella tertiolecta pode ser utilizado e adicionado a atingir uma densidade de 10 5 células / ml quando as soluções de ensaio são preparados. A seguinte ordem de adição é recomendada: água de diluição, a suspensão de algas e solução padrão. Após a preparação das soluções de teste, eles têm de ser utilizados no ensaio o mais rapidamente possível. 4,4. Transferir a partir de soluções o balão para os recipientes de teste, em seguida, para as placas de Petri Quantidades iguais (50 ml) das soluções de ensaio são introduzidos nos recipientes de ensaio, utilizando o cilindro graduado. Três réplicas para cada concentração são feitas. Para cada série de testes, um recipiente de controle é preparado com uma quantidade de água de diluição igual ao volume das soluções de ensaio. Volumes iguais (cerca de 12 ml) de as soluções de ensaio são introduzidos nas placas de Petri. Para cada série de testes, um prato de Petri de controlo é usado. 5. Preparação para Testes 5,1. Náuplios na fase II-III Quarenta e oito horas após a activação do cisto, os náuplios atingir a II-III fase larval e são, em seguida, utilizável para o teste. 5,2. Náuplios ser transferido para as placas de Petri, usando o microscópio A placa de Petri utilizado para cisto<html> activação é levada para fora da câmara termostática. Uma pequena quantidade de larvas são transferidas para as placas de Petri contendo o controlo e as soluções de teste. Esta tarefa é para ser realizado com o microscópio utilizando uma pipeta de diâmetro suficientemente larga de modo que os organismos não ficar danificado. Nesta fase do ensaio, a transferência pode ser realizada com uma pipeta de Pasteur de vidro (com ponta arredondada à chama) e uma fonte de luz posicionada lateralmente que encoraja a Artemia a agregação. 5,3. Náuplios transferência a partir das placas de Petri em recipientes de teste com o microscópio Dez larvas são transferidas a partir dos pratos de Petri de ensaio soluções para os recipientes de teste. Também esta operação tem que ser executada, utilizando a pipeta de Pasteur e microscópio. Recomenda-se que um volume não superior a 1 mL é transferido durante a passagem das larvas para não afectar o volume global de sistema de teste. e_step &quot;&gt; 5.4 Os recipientes cheios cobertos com parafilme As provetas de ensaio são cobertos com parafilme (deixando um espaço para a passagem de ar), e mantido a uma temperatura de 25 (± 2) ° C durante toda a duração do teste e com uma iluminação de 900 (± 100) lx com um fotoperíodo proporção de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. 6. Substituindo o suplemento Médio e Alimentação 6,1. Controle da taxa de sobrevivência Dois dias após o teste foi iniciado, e, em seguida, após dias 5, 7, 9 e 12, a Artemia é observada ao microscópio a fim de verificar a taxa de sobrevivência e para substituir o meio eo suplemento alimentar. Número de organismos vivos é contado em cada contêiner de teste. Após a observação ao microscópio e estimulação mecânica leve (por exemplo, tocar as larvas com uma pipeta Pasteur de vidro) organismos que não apresentam algum movimento por cerca de 10 segundos deve ser considerado morto. 6,2. Preparação de uma solução de teste exibindo amostragem algas com uma pipeta de 10 ml e amostragem da substância a ser testada com uma micropipeta. Transferir a partir de soluções o balão com os recipientes de teste Embora o teste, as soluções de teste devem ser periodicamente substituído, e preparado no mesmo dia em que eles são para ser usado. As soluções de ensaio são feitos a partir da solução padrão previamente preparada. 6,3. Transferência de Artemia, utilizando uma pipeta de Pasteur de corte, a partir dos recipientes de teste antigos para os três recipientes novos A transferência de Artemia é realizada usando uma pipeta com um diâmetro suficientemente larga de modo a não danificar os organismos. Durante esta fase, de 3 ml de plástico pipeta de Pasteur (a ser cortado) pode ser utilizado. 6,4. As larvas num copo contendo quer Artemia vivo ou morto Após 1<html> 4 dias de exposição no final do teste, o número de sobreviventes larvas é contado e registado na folha de cálculo. LC 50 e / ou LC 20, NOEC e LOEC menos 14 dias, são calculados e registrados, bem como limites de confiança de 95% no caso de métodos apropriados, e de cálculo. 7. Os resultados representativos No final do ensaio (14 dias), calcular a percentagem de mortalidade para cada concentração, de acordo com a seguinte fórmula: (M s / N) * 100 Onde: M s é o número médio de indivíduos morreram na amostra analisada N é o número total de indivíduos expostos Tabela 1 relata um exemplo de dados de um ensaio de (14d) com Artemia expostos a dodecil sulfato de sódio. <table border="1"><tbody><tr><td> Concentrações (mg / l) </td>&quot;&gt; Número de pessoas morreram em cada réplica </td><td> Mortalidade (%) </td></tr><tr><td></td><td> Eu </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Controle negativo </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Além disso, determinar oLC valor 50 por um lote Gaussian gráfica logarítmica ou utilizando métodos estatísticos adequados (por exemplo Spearman-Karber ou Método Probit). O cálculo da LC 50 para os dados da tabela 1 é 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Se a concentração máxima testada causou uma menor taxa de mortalidade de 50%, você não deve continuar para o cálculo do 50 LC valor que seria, então, não confiáveis ​​ou até mesmo não-computável. Neste caso, no entanto, seria apropriado para repetir o ensaio, alargando a gama de concentrações testadas. Alternativamente, o LC 50 valor é mais correctamente expresso como maior do que a maior concentração testada, possivelmente indicando a percentagem de mortalidade na maior concentração testada ea concentração mais elevada que corresponde a uma nenhum efeito. Os resultados são considerados válidos se no fim de testar as condições a seguir foram atendidos: <ol class="lalpha"><li> a taxa de controle de mortalidade médiaé ≤ 20%; </li><li> onde usando dodecil sulfato de sódio, o LC 50, 14 dias está incluído no 8,0 (± 5) mg / l de intervalo. </li></ol> Se as condições acima não foram cumpridos, todos os dados obtidos com o mesmo lote de organismos devem ser considerados inválidos e repetidos testes.

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<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Artemia é um dos organismos de teste mais valiosos disponíveis para testes de ecotoxicidade e de investigação feito até agora permite-nos afirmar que é possível manter várias opções relacionadas com Artemia uso em Toxicologia e Ecotoxicologia. As características que tornam este organismo em uma espécie com potencial para bioensaios são: uma ampla distribuição geográfica, alta adaptabilidade às condições ambientais adversas e nutrientes variados, cultura laboratorial relativamente simples e de manutençã...

Produzido por Loredana Manfra do Instituto para a proteção ambiental e à pesquisa (ISPRA-Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental) e Savorelli Federica da Agência Regional de Proteção Ambiental (Emilia-Romagna, Itália). Os membros de referência para o subgrupo de trabalho sobre o crustáceo Artemia dentro do Grupo métodos biológicos - água salgada / água salobra e Sedimentos da Comissão UNICHIM da Qualidade da Água (Instituto para a operação de normalização técnica no sector químico). Videografia e edição por Marco Pisapia de ISPRA (Scientific Advisory e Serviços de Documentação). Coordenação de Produção por Anna Maria Cícero e Magaletti Erika de ISPRA (Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental). Gostaríamos de agradecer à Agência Regional de Proteção Ambiental da Emilia-Romagna, Ferrara Branch e BiologGrupo de Métodos ical - água salgada / água salobra e Sedimentos da Comissão UNICHIM da Qualidade da Água da sua cooperação; Rossella Boscolo e Massimo Gabellini de ISPRA (Departamento de Prevenção e Mitigação de Impactos) pelo apoio financeiro, e da London School of Languages, em Roma por seu apoio linguístico. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número do produto </td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Apêndice Os meios de comunicação de algas tem de ser preparada utilizando reagentes de qualidade analítica. Um litro de solução nutritiva é preparada por dissolução de 300 g de NaNO 3, 30 g de KH g PO 4 e 20 2 de NH4CI em água destilada. Quatro soluções iniciais (A, B, C, D) De minerais são preparados como se segue: <ul><li> Um litro de solução &quot;A&quot; contendo 30 g de ZnSO 4 H2O, 25 g de CuSO4 5 H2O, 30 g de COSO 4 7 H2O e 20 g de MnSO4 H2O em água destilada; </li><li> Um litro de solução &quot;B&quot; contendo 50 g de FeCl 3 • 6 H2O em água destilada; </li><li> Um litro de solução &quot;C&quot;, contendo 25 g de Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O em água destilada; </li><li> Um litro de solução &quot;D&quot;, contendo 50 g di Na 2 EDTA • 2 H 2 O em água destilada. </li></ul> Um litro de uma solução final de minerais (solução &quot;E&quot;) é obtida adicionando alíquotas das soluções acima mencionadas para a água destilada. A seguinte ordem de adição é recomendado: 100 ml de solução &quot;D&quot;, 10 ml de solução &quot;C&quot;, 10 ml de solução &quot;B&quot; e 10 ml de solução &quot;A&quot;. Três iniciativasl soluções (F, G, H) de vitaminas são preparados como se segue: <ul><li> Um litro de solução &quot;F&quot; contendo 100 mg de biotina em água destilada; </li><li> Um litro de solução de &quot;G&quot; contendo 10 g de tiamina em água destilada; </li><li> Um litro de solução &quot;H&quot; contendo 100 mg de cobalamina em água destilada. </li></ul> Um litro de uma solução final de vitaminas (solução &quot;I&quot;) é obtida adicionando-se 10 ml das três soluções iniciais para a água destilada. Um litro de meio de algas é preparado por dissolução de 1 ml da solução de nutrientes, 1 ml da solução de mineral final (solução &quot;E&quot;) e 1 ml da solução de vitamina final (solução &quot;I&quot;) na água do mar. Este último pode ser obtida por dissolução reconhecidos reagentes de qualidade analítica ou uma formulação comercialmente disponível em água destilada ou desionizada. Misturas de sal para a criação do ideal de água salgada estão comercialmente disponíveis, por exemplo, as misturas Instant Ocean. É recomended a utilização de uma água do mar com salinidade de 30 (± 2) PSU e temperatura de 20 (± 1) ° C.

a longo prazo de teste de toxicidade letal com o crustáceo artemia franciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Nossas atividades de pesquisa sobre a utilização de métodos biológicos para a avaliação da qualidade ambiental, com particular referência à água salgada / água salobra e sedimentos. A escolha dos indicadores biológicos devem ser baseadas em conhecimentos científicos confiáveis ​​e, possivelmente, sobre a disponibilidade de procedimentos padronizados. Neste artigo, apresentamos um protocolo padronizado que utilizou o crustáceo marinho Artemia para avaliar a toxicidade de produtos químicos e / ou marinhos matrizes ambientais. Os cientistas propõem que o camarão (Artemia) é um candidato adequado para o desenvolvimento de um bioensaio padrão para utilização em todo o mundo. Uma série de artigos têm sido publicados sobre os efeitos tóxicos de vários produtos químicos e substâncias tóxicas sobre Artemia salina (Artemia). A principal vantagem do presente crustáceo para estudos de toxicidade é a disponibilidade geral dos cistos secos; estes podem ser imediatamente utilizado no teste e de difícil cultivo não é exigido <sup&gt; 1,2. Cisto ensaios baseados toxicidade são baratos, continuamente disponível, simples e confiável, e são, portanto, uma resposta importante para as necessidades de rotina de triagem de toxicidade, por exigências de controlo industriais ou para fins de regulamentação 3. O método proposto envolve a mortalidade como um ponto final. O número de sobreviventes foram contadas ea percentagem de mortes foram calculados. As larvas foram considerados mortos se eles não apresentaram qualquer movimento interno ou externo durante vários segundos de observação 4. Este procedimento foi testes padronizados uma substância de referência (dodecil sulfato de sódio); alguns resultados são reportados neste trabalho. Este artigo acompanha um vídeo que descreve o desempenho de testes de toxicidade processual, mostrando todos os passos relacionados com o protocolo.

Este estudo diz respeito ao desenvolvimento e padronização de um protocolo metodológico valioso para determinar toxicidade a longo prazo (14 dias) letal exercida por substâncias químicas, efluentes industriais ou esgotos e líquidos amostras ambientais sobre o crustáceo de água salgada,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Nossas atividades de pesquisa visam a utilização de métodos biológicos para a avaliação da qualidade ambiental, com referência particular a águas salinas/salobras ...

Somos Laura Manfra e Federica Selli, pesquisadoras do Instituto Superior para a Proteção e Pesquisa Ambiental, ISRA, departamento do Laboratório de Monitoramento da Qualidade Ambiental do Fitoplâncton, Ecotoxicologia e Ecologia. Nossas atividades de pesquisa visam o uso de métodos biológicos para a avaliação da qualidade ambiental, com referência particular à água salgada, água salobra e sedimentos. Nosso estudo mais recente diz respeito ao desenvolvimento e padronização de um protocolo metodológico valioso para determinar a toxicidade letal de longo prazo de 14 dias exercida por substâncias químicas, resíduos industriais, efluentes, esgotos e amostras ambientais líquidas sobre o crustáceo marinho *Artemia franciscana*.Este vídeo descreve a realização de testes de toxicidade procedimental. Nosso teste envolve expor larvas de artia a uma faixa de concentrações de substância ou a uma amostra-teste com o objetivo de determinar a concentração ou os níveis de diluição que causariam a morte de 50% dos organismos expostos ao longo de 14 dias, atendendo às condições definidas por este método. Se necessário e possível, os seguintes parâmetros também podem ser determinados.O nível de concentração que causa a morte de 20% dos organismos expostos à maior concentração analisada que não determina uma taxa de mortalidade superior à do controle negativo, e o menor nível de concentração testado que determina, após 14 dias, uma taxa de mortalidade superior à do controle negativo. Para realizar os testes, exigimos que nossa equipe utilizasse larvas de Franciscan com menos de 48 horas de idade, nos estágios dois ou três, obtidas de ovos recém-eclodidos. Pode-se usar água salina sintética como água de diluição, preparando-a pela dissolução de reagentes de qualidade analítica reconhecida ou de uma formulação comercialmente disponível em água destilada ou deionizada.Após variação por 48 horas e filtração em filtros com porosidade de pelo menos 0,45 µm, você pode conservar a diluição por um máximo de 30 dias no escuro. À temperatura de quatro graus Celsius, você deve alimentar os organismos-teste Ella Ter com microalgas, que crescem exponencialmente com densidades entre 1,3 × 10⁶ e 2,0 × 10⁶ células/mL. A substância de referência neste teste é o dodecilsulfato de sódio.Além do equipamento laboratorial usual, você também precisará dos seguintes recipientes para testes: béqueres de vidro borossilicato de 100 milímetros, frasco de 500 milímetros para preparar a solução padrão, seis frascos de cem milímetros para preparar as soluções de teste, placas de Petri de vidro ou poli com diâmetro de cinco centímetros e tampas removíveis, para ativar os cistos e transferir as artêmias da placa de eclosão para os recipientes de teste. Pipetas de vidro com pontas arredondadas por chama para transferência das náuplios, ou pipetas plásticas descartáveis de três mililitros a serem cortadas para transferir as artêmias, micropipetas e pipetas graduadas para preparar as soluções de teste. Seis cilindros graduados de 50 mililitros para transferir as soluções de teste dos frascos para os recipientes de teste, a fim de gerar os organismos de teste.Coloque 20 miligramas de cistos em uma placa de Petri contendo 12 mililitros de água de diluição 48 horas antes do teste. Mantenha a placa a 25 graus e sob intensidade luminosa de 4.000 lúmens por metro quadrado por uma hora. Após 24 horas, transfira as larvas eclodidas para uma nova placa de Petri preenchida com água artificial.Realize a transferência com o microscópio utilizando uma fonte de luz para que as larvas fototrópicas recém-eclodidas migrem em direção ao feixe de luz. Use um pipeta de vidro de Pasteur para realizar a transferência, garantindo que apenas as larvas emergentes sejam transferidas, e não os cistos propriamente ditos nem as larvas ainda dentro das membranas. Coloque a placa contendo as larvas em uma câmara termostática escura por mais 24 horas a 25 graus.A solução padrão da substância a ser testada deve ser preparada dissolvendo meio grama da substância em um balão volumétrico de 500 mililitros. Complete o volume com água deionizada ou destilada e agite até dissolução completa. As soluções devem ser preparadas no momento do uso, a menos que não se saiba se a substância é estável em solução.Nesse caso, você pode preparar a solução padrão até dois dias antes do teste. Você deve preparar o controle negativo em um frasco de 200 mililitros, adicionando uma quantidade adequada de uma suspensão de algas à água de diluição, de modo a obter uma densidade de 10 elevado à potência de cinco células. As soluções de teste devem ser preparadas em frascos de 5 a 100 mililitros, adicionando a solução padrão à água de diluição na quantidade especificada, de forma a obter as concentrações desejadas para o teste.Para alimentar os organismos, você deve usar uma suspensão de microalgas do tipo *duna teta*, adicionando-as quando preparar as soluções de teste até atingirem uma densidade de 10 elevado à potência de cinco células por mililitro. Porém, antes de começar, recomendamos que siga esta ordem de adição: diluição, suspensão algal e, em seguida, solução padrão. Introduza quantidades iguais, 50 mililitros das soluções de teste, nos recipientes de teste utilizando o cilindro graduado.Prepare três réplicas para cada concentração em cada série de testes. Prepare um recipiente controle com uma quantidade de água de diluição equivalente ao volume das soluções-teste. Introduza volumes iguais, cerca de 12 mililitros, das soluções-teste nas placas de Petri.Para cada série de testes, prepare um recipiente de Petri controle. 48 horas após a ativação dos cistos, as larvas atingirão o segundo ou terceiro estágio larval e estarão prontas para uso nos testes. Retire o recipiente de Petri utilizado para a ativação dos cistos da câmara termostática.Transfira uma pequena quantidade de larvas para as placas de Petri contendo as soluções controle e de teste. Nesta fase do teste, você pode realizar a transferência com uma pipeta de vidro cuja ponta foi arredondada com chama e com uma fonte de luz posicionada lateralmente, o que estimula a agregação das artias. Transfira 10 larvas das soluções de teste.Placas de Petri aos recipientes de teste. Realize também esta operação utilizando a pipeta usada anteriormente e cubra os béqueres de teste com parafina, deixando uma abertura para a passagem de ar, mantendo-os à temperatura de 25 graus durante toda a duração do teste. E sob uma iluminação de 900 lúmens por metro quadrado com uma proporção fotoperiódica de 14 horas de luz para 10 horas de escuridão, dois dias após o início do teste.Em seguida, após 5, 7, 9 e 12 dias, observe as artias ao microscópio e verifique sua taxa de sobrevivência. Substitua o meio e os suplementos alimentares; organismos que não apresentarem algum movimento por cerca de 10 segundos devem ser considerados mortos durante o teste. Você deve substituir periodicamente as soluções de teste, preparando-as no mesmo dia em que serão utilizadas.Prepare as soluções de teste a partir da solução padrão que você preparou anteriormente. Realize a transferência ARTIA usando EPI PET com diâmetro suficientemente largo para não danificar os organismos durante esta fase. Você pode usar uma pipeta plástica de três milímetros de diâmetro que será cortada após 14 dias de exposição.No final do teste, conte o número de larvas sobreviventes e registre o resultado em sua planilha. Calcule a CL50 e/ou a CL20, NOEC e LOEC aos 14 dias e informe seus valores. Os limites de confiança a 95% foram apropriados e os métodos de cálculo.Se, ao final dos testes, as seguintes condições tiverem sido atendidas, a taxa média de mortalidade dos controles for menor ou igual a 20 %, estivermos utilizando dodecil sulfato de sódio e a CL50 aos 14 dias estiver incluída no intervalo de 8,0 miligramas por litro. Se as condições anteriores não forem atendidas, todos os dados obtidos com o mesmo lote de organismos devem ser considerados inválidos e o teste deve ser repetido.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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