Name: Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a monitorar interações ligante-receptor em tempo real usando FRET com lipossomos de polidiacetileno funcionalizados. Este método simples e sensível permite detectar biomoléculas em concentrações subnanomolares.

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Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.

A. Síntese e Caracterização de Lipossomas de PDA 4,5,6 Nota 1: Proteger a solução da luz PDA usando embalagem de alumínio em cada recipiente ao longo de todas as etapas experimentais. Nota 2: Dois conjuntos diferentes de solução de lipossoma (B e C) foram preparadas seguinte procedimento A (Síntese e caracterização de lipossomas de PDA). 1. Síntese de N-hidroxi-succinimida Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Para preparar os lipossomas, um ingrediente essencial PCDA-NHS é necessária. Temos sintetizado PCDA-NHS usando seguinte procedimento: </li><li> Adicionar ácido 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hidroxissuccinimida (0,0914 g, 0,786 mmol) e 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (0,144 g, 0,713 mmol ) em CH 2 Cl 2 seco (20 ml). </li><li> Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Cuidadosamente remover o solvente usando rotary evaporador para se obter uma película fina seca. </li><li> Use funil de separação para extrair o resíduo com éter dietílico (25 ml) e água (25 ml) três vezes. </li><li> Seca-se a camada orgânica com MgSO4 (1,0 g) durante meia hora. Filtrar e remover o solvente por evaporação rotativa para se obter um pó branco sólido (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analise composto final sob Ressonância Magnética Nuclear (NMR). </li><li> 1 H RMN (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Preparação do lipossoma 5,6,7 <ol><li> Dissolver PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 em 20 ml de diclorometano. </li><li> Filtra-se a solução com papel de filtro para remover agregados. </li><li> Evapora-se o solvente completamente para se obter uma película fina de monómeros. </li><li> Seca-se a película fina a noite sob vacuum. </li><li> Filme o hidrato com água desionizada (50 ml) para fazer uma solução de lipossomas de concentração desejada (0,65-1 mM). </li><li> Sonicar a suspensão resultante com um sonicador de sonda a 76 ° C durante ~ 18 min. </li><li> Cuidadosamente passar a solução através de um filtro de papel para remover os agregados lipídicos </li><li> Arrefece-se a solução a 4 ° C durante a noite para promover a auto-montagem dos monómeros. A solução final deve ser opticamente transparente. </li><li> Polimerizar os monómeros de auto-montagem diacetileno (lipossomas) por irradiação com 254 nm de radiação UV para ~ 2 min utilizando uma fonte de UV Pen Ray (4,5 mW / cm 2) em ar. </li><li> A solução de lipossoma era estável à temperatura ambiente durante pelo menos duas semanas. A solução foi mais estável quando refrigerado. </li></ol> B. Preparação de Rodamina-tagged albumina sérica bovina (BSA-Rh) lipossomas modificados PCDA 1. A ligação de BSA-Rh para a superfície do lipossoma <ol><li> Dissolve-Rh BSA em PBS buffer (concentração iónica foi de 0,01 M, pH 7,2) para fazer uma concentração final de 1,2 uM de BSA Rodamina-solução. </li><li> Adicionar 2 ml (1,2 ^ M) de BSA-Rodamina a 10 ml de solução de lipossoma preparado no passo A.2. (Ver acima), à temperatura ambiente. </li><li> Reacção clássica para a ligação dos grupos amina do resíduo de lisina de proteínas ao ácido carboxílico activado por NHS grupo foi seguido (Esquema de reacção na Figura 2). NHS-PCDA foi concebido (Figura 2, passo 1) para a ligação covalente de moléculas de proteína com lipossomas utilizando NHS-amina reacções (Figura 2, Passo 2). NHS é um excelente agente de deixar que conduz a reacção de amina do ácido carboxílico na direcção para a frente. O rendimento desta reacção sob condições apropriadas deve ser quantitativa. </li><li> Remoção de livre BSA-Rh: Molhe um Spectra / Por Biotech éster de celulose membrana (CE) (MW C O: 100.000) em w deionizadaater, durante 15 min. Esta membrana é utilizada para a diálise de BSA-Rodamina que não reagiu (peso molecular ~ 66000 Da), em água desionizada. </li><li> Transferir cuidadosamente a solução em que a membrana de diálise. </li><li> Troque a água em 2 horas, 8 horas, 14 horas, 24 horas e 36 horas durante a diálise. </li><li> Recolher a solução final num frasco coberto com folha de alumínio. </li></ol> C. Preparação de SR-diamina e marcado com biotina Lipossomas 1. Em vez de usar DMPC na etapa 2.1, iremos utilizar marcado com biotina-(1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (DOPE-biotina). <ol><li> Siga todos os passos através de 2,2-2,9. </li><li> Em vez de BSA-Rh na etapa B, utilize diamina Sulphorhodamine etiquetado (SR-diamina). </li><li> Siga todos os passos adicionais na B. </li><li> Os lipossomas nesta preparação contida biotina e SR-diamina nas suas superfícies. Os passos subsequentes são semelhantes a A e B (ver acima), com uma única excepção: foi adicionada estreptavidina à solutipara investigar interacções biotina-estreptavidina através de alterações na eficácia da FRET. </li></ol> D. Representante Resultados <img alt="Figura título" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figura título. Um desenho que explica o processo de reacção e de FRET ocorre na superfície do lipossoma (preparado seguindo o passo B). A. Monitorização da ligação da proteína de lipossomas utilizando uma FRET Monitorização da FRET entre Rodamina e lipossomas preparados de PDA no passo B. Os espectros de excitação e emissão de BSA-Rh e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 3A). Nós podemos ver claramente que o espectro de emissão do BSA-Rh coincide com o espectro de absorção de PDA. Isso satisfaz o requisito de ressonância para o mecanismo de FRET. BSA-Rodamina lipossomas marcados, antes e após a polimerização foram analisados ​​com UV-Vé e espectroscopia de fluorescência. Para o doador e aceitador isolada, a eficiência de TERF é altamente dependente da distância dador-aceitador (r) e J 1 (j-valor). A extinção da emissão é observada (Figura 3B) por causa da FRET entre rodamina e PDA, devido ao aparecimento de espectro de absorção electrónica de PDA azul após a fotopolimerização. No nosso caso, FRET eficiência é zero para os lipossomas não polimerizados e rodamina porque J = 0 para lipossomas não polimerizada na região visível. Foram realizadas experiências semelhantes com apenas lipossomas PDA que não continham NHS na sua superfície. Nestes casos, a BSA-Rh não foi marcado na superfície dos lipossomas. Nesse caso, a distância média entre a rodamina e PDA (r médio) era muito maior do que o raio de Forster (R 0 = 2,8 nm). Assim, não observamos uma grande diminuição na intensidade de fluorescência. Esta observação de umalso sugere que a extinção de fluorescência é dominante quando R &lt;2,8 nm. J e R 0 Os valores foram calculados usando as fórmulas seguintes: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6 O coeficiente de extinção (ε) de azul-PDA está no intervalo de 2000-10000 ~ M -1 cm -1 antes da adição de estreptavidina. O coeficiente de extinção de azul-PDA está dependente da condição foto-polimerização. [2] Por exemplo, os valores de £ será maior para uma solução que foi polimerizado um tempo mais longo. Além disso, a auto-montagem dos monômeros diacetileno também pode afetar os valores de £. O calcul Jções levar em conta essas alterações, e refletem mudanças nos coeficientes de extinção PDA devido a biotina-estreptavidina interações moleculares. valores de J são calculados usando absorção PDA experimental e SR-101 dados de emissão. As mudanças nos valores de J são devidas à mudança no espectro de absorção electrónica de PDA a seguir à adição de estreptavidina para a solução (Figura 4C). A unidade de valores de J é M -1 cm -1 nm 4. B. Controlo da FRET com adição de estreptavidina para a biotina marcada com solução de lipossomas Nota 1: Monitoramento das FRET entre Rodamina e lipossomas PDA preparados no passo C acima. Os espectros de excitação e emissão de Sulphorhodamine-tagged diamina (SR-diamina) e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 4A). Não polimerizados e polimerizados biotina lipossomas marcados foram analisados ​​por meio de UV-Vise espectroscopia de fluorescência. A emissão da rodamina (SR-101) é diminuída em cerca de 45% após a polimerização (Figura 4B), sugerindo quenching emissão devido a FRET. Adicionar 40 ul de aliquotas (1 uM) de solução de estreptavidina a 2 ml de solução de lipossoma. Com a adição de estreptavidina para a solução, as variações no valor J é observado (Figura 4C). Como a biotina liga-se a estreptavidina, a intensidade do pico de azul PDA lipossoma (centrado em ~ 645 nm na Figura 1) foi diminuído, enquanto que um aumento do pico de absorção a 540 nm é observada (F igura 1 S). Figura 4D mostra a evolução do FRET eficiência. A eficiência de TERF diminuiu com o aumento da concentração de estreptavidina é também consistente com a nossa previsão. Gravar a emissão SR após cada adição aliquota de 40 ul de estreptavidina. Observou-se um aumento constante na emissão de rodamina, após a adição de streptavidina (Figura 5). Este aumento na emissão de rodamina é devido a uma diminuição do valor J para o espectro de emissão sulfo e espectro de absorvância PDA seguindo as interacções biotina-estreptavidina. Ao nível molecular, as interacções biotina-estreptavidina levar a alterações subtis no comprimento de conjugação eficaz do PDA, que resulta num decréscimo na forma azul-PDA a um termodinamicamente mais estável forma vermelho-PDA 2. Esta é a base das alterações nos valores de J. Interessantemente, as diferenças subtis nas interacções moleculares para covalentemente ou não covalentemente a biotina ligada a lipossomas PDA pode ser sondado com o nosso ensaio de detecção 4. Temos também realizados experimentos de controle e foram monitorizadas a emissão das amostras de controlo sob as mesmas condições experimentais como os de estreptavidina-biotina. As experiências de controlo consistir em: (1) a biotina soluções de lipossomas que continham no seusuperfície foram adicionados uma solução tampão de mesmo volume e concentração, e (2) solução de lipossomas, sem receptores de biotina na sua superfície de estreptavidina foram adicionados mesmo volume e concentração. A intensidade da solução de lipossoma marcado com biotina, após a adição de estreptavidina mostrou intensidade melhorado, mas a intensidade da solução de lipossoma das experiências de controlo (por exemplo, ver Figura 2 S), por outro lado, mostraram uma diminuição na intensidade de emissão. Isto é atribuído à diluição da solução. Essas experiências indicaram claramente que a emissão melhorada da solução foi devido a interacções específicas moleculares. Forster raio (R 0) para o par rodamina e PDA é calculada (Eq.2) ser ~ 2,80 nm. Isto significa que para isolados PDA-rodamina pares, 50% das moléculas de rodamina estado excitado terá a energia transferida para PDA quando r é 2,80 nm. Nós obs<html> erved que, quando a biotina é ligado covalentemente ao esqueleto de PDA, o aumento das emissões foi 2-3 vezes maior do que a de uma forma não covalente a biotina ligada a lipossomas. 4 Estes resultados sugerem fortemente que o sistema proposto é sensível para distinguir diferenças subtis nas interacções no transdutor (ligante entre biotina e bicamada de lipossomas), devido à covalentemente ou não covalentemente ligados receptores ligados a lipossomas. Dependendo das capacidades de digitalização e de aquisição de dados a monitorização de espectrofotómetro e em tempo real (em milisegundos a escala de tempo de segundo) de interacções de proteínas (na espectroscopia de UV-Vis), são possíveis com este sistema de detecção. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Figura Espectros de absorção 1. Dos azuis e vermelhos soluções PDA. (Inset) micrografias ópticas tirada com uma câmera digital. g &quot;/&gt; Figura 2. O esquema reaccional para a síntese PCDA-NHS (passo 1). Reacção do PCDA-NHS para o substituinte de amina de proteínas (passo 2). O passo 2 é a base da ligação do resíduo de lisina de proteínas para o ácido carboxílico da PCDA monómero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> Figura 3A. Observada alteração na eficiência de TERF é devido às mudanças no espectro de absorção do PDA. Antes de polimerização, não há sobreposição entre BSA-Rh emissão e absorção de PDA, mas depois de sobreposições de polimerização PDA absorção com BSA-Rh emissão, que é a exigência de FRET. Rodamina é um doador (vermelho) e lipossomas polimerizados PDA actuar como um aceitador (azul). <img alt="A Figura 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figura3B. Espectros de fluorescência do BSA-Rh lipossomas marcados antes (azul) e depois PCDA polimerização (vermelho). Uma grande redução na emissão de rodamina foi observada devido a FRET entre rodamina e PDA. <img alt="A Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> Figura 4A.. Sobreposições espectrais (J) para a mudança de PDA espectro de absorção (azul ou vermelha) e espectro de emissão Sulphorhodamine (laranja) Figura 4A é o espectro representativo para a condição extrema, isto é, quando um excesso de estreptavidina foi adicionado à solução. A Figura 4A mostra uma transformação quase completa azul-a-vermelho PDA, após a adição de um excesso de estreptavidina. Vê-se claramente que J (sobreposição espectral) aumenta com o deslocamento de azul do espectro de absorção no PDA <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> Figura 4B. Espectros de fluorescência antes (azul) e após (red) polimerização de lipossomas. <img alt="A Figura 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Figura 4C Condição para FRET: J. Mudança entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas. <img alt="Figura 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figura 4D. FRET variação da eficiência de entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figura 5. Rodamina espectro de emissão após a adição de alíquotas da solução de estreptavidina a PDA lipossoma. Inserção mostra uma visão ampliada de mudanças de emissão no espectro SR-101.

<ol><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar mudanças nos valores de <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) </td><td> GFS produtos químicos </td><td> 3261 </td><td> Sensível à luz </td></tr><tr><td> N-hidroxi-succinimida (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensíveis à umidade </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) </td><td> Chem-impex Internacional </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-tagged Ser Bovinehum Albumina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento em tempo real de ligante-receptor interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.

Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

O FRET é um processo pelo qual a energia é transferida de forma não radiativa de uma molécula doadora excitada para uma molécula aceitadora no estado fundamental através de interações de longo alcance...

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar interações entre ligantes e receptores por meio da transferência de ressonância de energia por fluorescência. O método apresentado aqui utiliza uma propriedade interessante do DESLOCAMENTO PARA O AZUL da PDA no espectro de absorção eletrônica UV-vis da PDA. Após um analito interagir com receptores ligados à PDA, o primeiro polímero de diacetileno ou a PDA é sintetizado, e lipossomos de PDA são preparados.A seguir, a BSA marcada com o domínio R é ligada à superfície do lipossoma de PDA. Quando a transferência de energia por ressonância de fluorescência é então medida, o espectro de emissão da BSA ligada ao lipossoma com o domínio R se sobrepõe ao espectro de absorção do PDA.Isso satisfaz a exigência de ressonância para o mecanismo de fret. Assim, podem ser obtidos dados que indicam interações entre ligantes e receptores. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como Eliza, é que este método é muito simples e de baixo custo.Como a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a calorimetria, podemos alcançar o limite de detecção em concentrações muito baixas, abaixo de nanomolar ou ainda menores.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

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Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

Este protocolo descreve um ensaio baseado em BRAKET para medir as interações da quinase CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. O protocolo descreve as etapas para preparar as células, ler as emissões de BRET e analisar dados. Um exemplo de resultado com identificação de controles apropriados e solução de problemas para otimização de ensaio também é apresentado.

Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas

A eletrofisiologia é o padrão-ouro para investigar a atividade do canal iônico. No entanto, existem muitas abordagens alternativas, incluindo métodos ópticos. Aqui, descrevemos um método para monitorar a atividade da repetição rica em leucina contendo canais de ânions formados por 8 canais (LRRC8) usando um método baseado em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET)

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a monitorar interações ligante-receptor em tempo real usando FRET com lipossomos de polidiacetileno funcionalizados. Este método simples e sensível permite detectar biomoléculas em concentrações subnanomolares.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

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