Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas de células microgliais primárias a partir de cérebros de ratos neonatais. Isso é feito primeiro isolando o cérebro e removendo as meninges. O segundo passo é homogeneizar o cérebro e colocar a cultura glial mista em frascos T 75.

Em seguida, os frascos são incubados por 10 a 14 dias até que uma monocamada de astrócitos atinja a confluência. A etapa final é agitar os frascos para liberar a microglia que está crescendo no topo da monocamada de astrócitos, resultando em uma cultura purificada de microglia. Em última análise, a microglia primária de alta pureza pode ser usada em ensaios subsequentes de cultura de células únicas in vitro e co-cultura.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o método do gradiente de Perico, é que a interrupção mecânica nominal minimiza a disfunção ou ativação microglial, e a microglia para experimentos pode ser gerada por semanas após a preparação inicial. Estarei demonstrando esse procedimento junto com Tammy Tero, uma estudante de pós-graduação no laboratório do guarda Dr.Clifton Dau. As culturas de microglia de alta pureza obtidas durante este protocolo podem ser usadas em experimentos in vitro para estudar a função da microglia em condições fisiológicas normais, bem como em condições patológicas de doenças.

A microglia, a capacidade de resposta a danos teciduais, bem como estímulos inflamatórios, têm relevância direta para lesões neurológicas e condições de doenças neurodegenerativas. Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque não estão familiarizados com a remoção das meninges do tecido cerebral em tempo hábil, a fim de reduzir a contaminação por fibroblastos nas culturas primárias da microglia. Além disso, deve-se tomar cuidado para não danificar a monocamada de astrócitos durante a agitação dos frascos e o manuseio das culturas da microglia.

Para se preparar para o procedimento, Chi Livi é L 15 media a quatro graus Celsius, pronto para placas de Petri de 60 por 15 milímetros contendo L 15 media e coloque no gelo. Aqueça o meio de cultura a 37 graus Celsius e certifique-se de que todas as ferramentas cirúrgicas foram esterilizadas. Depois de decapitar um filhote de rato P um a P cinco com uma tesoura afiada, solte a cabeça em 70% de etanol.

Depois que as cabeças de cinco filhotes de rato forem coletadas, transfira as cabeças para solução salina. Remova todo o cérebro de cada cabeça fazendo cuidadosamente incisões em ambos os lados do crânio acima das orelhas e puxando o cérebro para fora e para uma das edições de Petri contendo meio L 15 no gelo. Uma vez que os primeiros cinco cérebros tenham sido transferidos para L 15 no gelo, os próximos cinco filhotes podem ser processados da mesma maneira quando todos os cérebros forem coletados.

Remova as meninges segurando suavemente uma borda da folha meníngea com uma pinça e retirando-a cuidadosamente do córtex subjacente. É essencial remover completamente as meninges e fazê-lo o mais rápido possível. Depois de remover as meninges, transfira cada um dos cérebros para uma placa de Petri fresca de meio L 15 no gelo.

Use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar o tecido cerebral e o meio da placa para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue a 2.500 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após aspirado por centrifugação.

O supinado então usa pipeta estéril de 10 mililitros para Reese. Suspenda o pellet em quatro a cinco mililitros de meio L 15 fresco, pipete o meio e o tecido para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, coloque um filtro de células de poros de 100 mícrons em um tubo cônico novo de 50 mililitros.

Use uma pipeta estéril de cinco mililitros para pipetar a suspensão de tecido para cima e para baixo e, em seguida, com a pipeta lavada no filtro de células, dispense o material através do filtro de células no tubo cônico. Enxágue o filtro com quatro a cinco mililitros de meio L 15 fresco e resfriado. Em seguida, centrifugue seus 2.500 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Para cada cérebro de filhote de rato processado, prepare um frasco T 75 estéril adicionando 12 mililitros de meios de cultura pré-guerra em cada frasco. Em seguida, depois de aspirar o líquido das células peletizadas, adicione cinco a seis mililitros de meios de cultura ao pellet celular, pipete para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, transferir um volume igual de suspensão celular para cada balão T 75.

Incube os frascos em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por uma a três semanas, permitindo que as células permaneçam intactas nos primeiros cinco dias após o plaqueamento inicial. Após cinco dias, substitua o meio condicionado em cada frasco por 12 mililitros de meio fresco para obter a confluência. Isso deve ser feito com muito cuidado, sem tocar no fundo do frasco onde as células se fixam.

Quando as culturas gliais mistas estiverem completamente confluídas, remova o frasco da incubadora. Cubra as tampas dos frascos com parâmetros para evitar trocas gasosas com o ar ambiente e coloque os frascos em uma incubadora agitada ajustada para 100 RPS e 37 graus Celsius por uma hora após a hora ter decorrido, use uma pipeta de 10 mililitros para coletar o meio dos frascos sem interromper a camada de astrócitos e distribua em tubos cônicos de 50 mililitros. Adicione meios novos aos frascos e volte para a incubadora.

Depois de centrifugar os tubos a 2.500 RCF durante cinco minutos a quatro graus Celsius, aspirar o supinato e suspender novamente as células num mililitro de meio de plaqueamento da microglia. Em seguida, conte as células usando um citômetro humano e procedimentos padrão. Uma vez determinado o número de células, adicione um volume apropriado de meio de plaqueamento microglial para obter uma célula.

A concentração de duas vezes 10 elevado a cinco células por mililitro de placa é apropriada para o experimento e retorno à incubadora. Para permitir que a microglia se fixe durante a noite. As células foram imunomarcadas com um anticorpo específico para IBA, um marcador microglial, que aparece em vermelho.

Há contaminação mínima da cultura com células neuronais, conforme demonstrado por esta imagem microscópica de imunocoloração usando um anticorpo para novo marcador neuronal NA, que aparece em vermelho. A lâmina foi corada com DPI para corar todos os núcleos celulares de azul. Esta imagem mostra imunocoloração com GFAP e marcador de astrócitos.

Os astrócitos aparecem verdes. Aqui vemos uma imagem da cultura microglial imunocorada com um anticorpo específico para CC um, um marcador de oligodendrócitos. Os oligodendrócitos aparecem vermelhos.

Este histograma mostra os resultados da quantificação de cada tipo de célula. Pode-se observar que as culturas microgliais plaqueadas são mais de 90% puras. Esta imagem de microscópio de fluorescência mostra uma cultura microglial que foi imunocorada para IBA.

As áreas vermelhas são contas de látex marcadas com fluorescência. A cultura microglial mostrada aqui foi tratada com um nanograma por mililitro de polissacarídeo lipo, e pode-se observar que as células microgliais têm fagocitose nas esferas de látex marcadas com fluorescência. Aqui, os resultados do ensaio de fagocitose são exibidos em um histograma.

Aumento da fagocitose é observado após o tratamento com LPS. Esta figura mostra que a produção de óxido nítrico também aumenta em culturas microgliais após a adição de LPS. Finalmente, as culturas de neurônios da microglia separadas por inserção direta ou transwell são suscetíveis ao aumento da morte celular após a incubação com LPS, conforme medido pela liberação de lactato desidrogenase Uma vez dominada a primeira parte desta técnica, até o plaqueamento em T 75, os frascos podem ser feitos em uma hora e meia, e o procedimento completo pode ser feito em duas semanas.

Outra consideração durante a otimização deste protocolo é determinar a duração do tempo. As culturas gliais mistas devem ser mantidas antes de isolar a micróglia primária para plaqueamento Após o estabelecimento de culturas de alta pureza. Usando este procedimento, a função da microglia pode ser avaliada in vitro da produção de óxido nítrico, liberação de citocinas e quimiocinas, bem como a atividade fásica pode ser determinada e medida usando ensaios laboratoriais de rotina.

Assim, com o desenvolvimento desse procedimento, pesquisadores da área de neurociência têm a capacidade de explorar a atividade da microglia em um ambiente celular homogêneo e investigar seus papéis em diversas condições neurológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar culturas de células microgliais primárias a partir de cérebros de ratos neonatais. Primeiro isolando o cérebro e removendo as meninges e, em seguida, homogeneizando o cérebro e colocando em frascos, os frascos são incubados por 10 a 14 dias até que uma monocamada de astrócitos atinja a confluência.

A etapa final é sacudir os frascos para liberar a microglia que está crescendo no topo da monocamada de astrócitos, resultando em uma cultura purificada de microglia.