Name: Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a isolar microglia primária de cérebros de ratos neonatais usando cultura mista de células gliais. Este protocolo mecânico minimiza a ativação celular e fornece alta pureza para estudos in vitro de neurociência.

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Financiado pelo programa intramural na Universidade Militar.

1. Dissecção da Tissue Neonatal cérebro de rato <ol><li> L-15 de Leibovitz frio meios condicionados (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) a 4 ° C. Meios de cultura quentes (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) para 37 ° C. Prepare 4 60x15 mm pratos de Petri com 4-5 ml de L-condicionado de 15 meios de comunicação sobre o gelo. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com 100% de etanol. </li><li> Lavar as P2 filhotes rap neonatais com etanol 70%. (Crias de ratos neonatais com idades compreendidas entre P1-P5 pode ser usado neste protocolo.) </li><li> Rapidamente decapitar um rato filhote com uma tesoura afiada estéreis e soltar a cabeça imediatamente em etanol 70%. Repetir para um total de 5 crias de rato, em seguida, transferir cabeças em solução salina. </li><li> Remover os cérebros inteiros das cabeças e coloque em uma placa de Petri com 4 - 5 ml de solução de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) em gelo. </li><li> Repita os procedimentos 1.2 - 1.4 para os filhotes restantes no lixo. </li><li> Remover as meninges a partir do cérebro e transferir o destecido cerebral IRED (isto é, córtex, cerebelo, cérebro inteiro, etc) em uma placa de Petri de novo com 4-5 ml de solução de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) em gelo. </li></ol> 2. Preparação de população mista de células da glia <ol><li> Sem o tecido cerebral prejudicial com uma tesoura ou uma lâmina, transferir o tecido com uma pipeta de 10 ml para um tubo estéril de 50 ml cónico. </li><li> Centrifugar a 2.500 cónica RCF durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Adicionar ml de 4-5 frescos meio L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep). </li><li> Pipetar tecido cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 ml estéril. </li><li> Coloque um filtro celular (100 poros mm) para um novo tubo de 50 ml. Pipetar tecido cima e para baixo uma vez com uma solução estéril 5 ml pipeta e com a pipeta de descarga para o filtro de células, dispensar o material através do filtro de célula para dentro do tubo cónico. </li><li> Lavar o filtro de células com 4-5 ml de frescos meio L-15 (Leibowitz L-15 + BS 0,1%Um Pen + 1% / Strep). </li><li> Centrifugar cónica com células tensas a 2.500 RCF durante 5 min a 4 ° C. </li></ol> 3. Chapeamento e manutenção da cultura mista de células gliais <ol><li> Para cada cérebro de rato pup processado, preparar 1 T-75 estéreis do balão por adição de 12 ml de meio de cultura (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) em cada frasco. </li><li> Aspirar o sobrenadante das células peletizadas e adicionar 5-6 ml de meio de cultura para o sedimento de células. Pipetar cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 ml. </li><li> Transferir um volume igual de suspensão de células a cada balão T-75. </li><li> Incubar em frascos de 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C durante um total de 1-3 semanas. </li><li> Frascos deve ser primeiro incubadas durante 5 dias, e no quinto dia, substituir os meios de cultura em cada balão com 12 ml de meio fresco e retornar para a incubadora. Em seguida, a cada 3 dias, substituir os meios condicionados em cada balão com 12 ml de meio fresco para atingir confluência. Isso deve ser fazerne com muito cuidado, sem tocar no fundo dos frascos, onde as células se ligam. </li></ol> 4. Isolamento e Chapeamento de Microglia primária <ol><li> Após cultura mista de gliais são completamente confluentes, remover frascos da incubadora e cobrir as tampas recipiente com parafilme para evitar a troca gasosa com o ar ambiente. </li><li> Agitar frascos de 100 RPS (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Collect meios de comunicação de todos os frascos com uma pipeta de 10 ml sem perturbar a camada de astrócitos na superfície balão. Coloque a mídia em tubos de 50 ml. Adicionar meios frescos aos frascos e frascos de retorno para a incubadora. </li><li> Centrifugar a 2.500 tubos cónicos RCF durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante a partir de todos os tubos cónicos. Peletes de células são células da microglia de alta pureza. Ressuspender pelotas em 1 ml de plaqueamento microglia media (DMEM + FES 10% + 1% de penicilina / estreptomicina). </li><li> Contar a densidade celular nos meios de comunicação que utilizam ressuspensosum hemocitómetro. </li><li> Adicionar um volume apropriado de meios de revestimento microglia para atingir um 2 x 10e5 células por ml de densidade. Placa conforme for apropriado para análise experimental. </li><li> Permitir microglia para anexar durante a noite. </li></ol> 5. Os resultados representativos O protocolo descrito acima resulta em alta pureza culturas primárias microglia. Como determinado por imuno-histoquímica para um marcador de células de macrófagos / microglia específico (Iba1), as culturas são chapeadas microglia&gt; puro a 90% (Figura 2). Além disso, a coloração para os marcadores de células de astrócitos, oligodendrócitos e neurónio específicos demonstra a contaminação mínima (Figura 2). Depois de estabelecer cultura mista de células gliais, microglia pode ser isolado por agitação até 4 vezes sucessivas. O isolamento inicial microglia irá produzir aproximadamente 2,2 x 106 células / ml ou cerca de 9 milhões de células por 10 frascos eo rendimento esperado diminui com cada sha sucessivake. Microglia isolado por este método têm sido utilizados com sucesso para investigar a capacidade de fagocitose, função, tais como a produção de óxido nítrico, e toxicidade neuronal (Figura 3) 13-14. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do protocolo para a preparação de mistura de culturas de células gliais e de isolamento da microglia primária. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento de microglia alta pureza como verificado pela análise imuno-histoquímica usando microglia (Iba-1, vermelho), astrócitos (GFAP, verde), neurônio (NeuN, vermelho) e oligodendrócitos (CC1, vermelho) marcadores específicos. A coloração para DNA de células em cultura por DAPI (azul) é também mostrada. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Figura 3. Microglia isolado no método descricama têm sido usados ​​em vários ensaios, incluindo, mas não se limitam a, ensaios de fagocitose, ensaios funcionais e estudos de neurotoxicidade. Nestes estudos, verificou-se que a microglia (Iba-1 positivo, verde), quando expostos a controlar (A) ou LPS (B) meios de comunicação tratados, aumentar a sua fagocitose de pérolas de látex marcadas por fluorescência (vermelho), que pode ser quantificado ( C). Além disso, LPS de tratamento (1ng/ml) pode aumentar a produção de óxido nítrico em microglia (D). Finalmente, através de ambos transwell inserto-separadas ou directos microglia-neuronais culturas, nós descobrimos que a microglia incubadas com LPS pode induzir a morte de células neuronais, como medido por lactato desidrogenase (LDH) de libertação (E, F).

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<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Embora este protocolo é rotineiramente utilizado para produzir microglia puro e saudável para experimentos de pesquisa, uma análise cuidadosa dos aspectos técnicos, durante partes críticas do procedimento minimizar a variabilidade na microglia isolado. Primeiro, durante a dissecção do tecido do cérebro de filhotes de ratos neonatos, trabalhando em tempo hábil é necessário para minimizar os danos e hipóxico isquêmica do tecido. No entanto, é também importante para remover completamente o revestimento meníngeo a partir do...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm, placas de Petri </td><td> Fisher marca </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Afiadas tesouras de dissecação </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b fórceps padrão pontas, curvas, 11cm </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps padrão dicas, em linha reta, 11 cm </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cónico de 50 ml de tubos de centrifugação </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml pipetas sorológicas </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml pipetas sorológicas </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 filtro célula mM estéril nylon </td><td> Falcão </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 de cultura de tecidos frascos </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz médio </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal soro eqüino </td><td> Pescador </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> A Warner Empresa Graham </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato, 10X, pH 7,4 </td><td> Qualidade Biológica, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X em água destilada estéril </td></tr><tr><td> Sacos de Biohazard </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-poços de células placas de cultura com a superfície Cellbind </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia conta para aproximadamente 12% do total da população celular no cérebro de mamíferos. Embora os neurónios e astrócitos são considerados os tipos de células principais do sistema nervoso, microglia desempenhar um papel significativo na fisiologia normal do cérebro através da monitorização do tecido para que os detritos e os agentes patogénicos e manutenção da homeostase do parênquima através 1,2 actividade fagocítica. A microglia é ativada durante uma série de lesões e doença, incluindo doenças neurodegenerativas, lesões cerebrais traumáticas e infecção do sistema nervoso 3. Sob estas condições de ativação, microglia aumentar sua atividade fagocitária, passam por mudanças morpohological e proliferativa, e ativamente secretam espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, pró-inflamatórias quimiocinas e citocinas, muitas vezes, ativando um loop parácrina ou autócrina 4-6. Como essas respostas microgliais contribuir para a patogênese da doença em condições neurológicas, a pesquisa focada em microglia se justifica. Devido à heterogeneidade celular do cérebro, é tecnicamente difícil a obtenção de material de amostra suficiente microglial com pureza elevada durante experiências in vivo. A pesquisa atual sobre as funções neuroprotetoras e neurotóxico de microglia exigir um método de rotina técnica para gerar consistentemente microglia puro e saudável, com rendimento suficiente para o estudo. Apresentamos, no texto e vídeo, um protocolo para isolar microglia primário puro a partir de culturas da glia mistos para uma variedade de aplicações a jusante. Resumidamente, esta técnica utiliza tecido cerebral dissociada crias de rato neonatal para produzir mistos culturas de células gliais. Após as culturas mistas gliais atingir a confluência, microglia primárias são mecanicamente isolado a partir da cultura por um breve duração de agitação. Os microglia são então plaqueadas a elevada pureza para o estudo experimental. O princípio e protocolo desta metodologia ter sidodescrito na literatura 7,8. Além disso, as metodologias alternativos para isolar microglia primários estão bem descritos 9-12. Tecido cerebral homogeneizado podem ser separados por centrifugação em gradiente de densidade para produzir microglia primário 12. No entanto, a centrifugação é de comprimento moderado (45 min) e pode causar danos celulares e activação, assim como, causar enriquecido microglia e outras populações celulares. Outro protocolo tem sido utilizada para isolar a microglia primária em uma variedade de organismos por prolongada (16 horas), agitando ao mesmo tempo em cultura 9-11. Após agitação, o sobrenadante é centrifugado meios para isolar a microglia. Este método de isolamento de mais duas etapas também podem perturbar a função e ativação da microglia. Nós principalmente utilizar o protocolo de isolamento seguinte microglia no nosso laboratório para um número de razões: (1) primária microglia simular em biologia in vivo mais fielmente que imortalizadas linhas celulares de roedores microglia, (2) Uma ruptura nominal mecânica minimiza disfunção celular potencial ou activação, e (3) o rendimento suficiente pode ser obtida sem passagem das culturas mistas de células gliais. É importante notar que este protocolo utiliza o tecido cerebral de crias de rato neonatal para isolar microglia e que a utilização de ratos mais velhos para isolar microglia pode ter um impacto significativo no rendimento, estado de activação, e as propriedades funcionais da microglia isolado. Há evidências de que o envelhecimento está relacionada com a disfunção microglia, neuroinflamação aumentada e patologias neurodegenerativas, assim estudos anteriores têm utilizado ex vivo adulto microglia para compreender melhor o papel da microglia em doenças neurodegenerativas, onde o envelhecimento é parâmetro importante. No entanto, ex vivo microglia não pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados de tempo. Consequentemente, embora este protocolo prolonga a vida da microglia primária em cultura, deve notar-se que a microglia comportar differently de adulto microglia e estudos in vitro deve ser cuidadosamente considerado quando traduzido para uma definição em vivo.

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudo e aplicações a jusante.

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

As microglia represent aproximadamente 12% da população celular total no cérebro de mamíferos. Embora os neurônios e os astrócitos sejam considerados os principais...

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas primárias de células microgliais a partir de cérebros de ratos neonatos. Isso é realizado primeiramente isolando o cérebro e removendo as meninges. O segundo passo é homogeneizar o cérebro e semear a cultura glial mista em frascos T 75.Em seguida, os frascos são incubados por 10 a 14 dias até que uma monocamada de astrócitos atinja confluência. O passo final é agitar os frascos para liberar os micróglios que estão crescendo sobre a monocamada de astrócitos, resultando em um cultivo purificado de micróglios. Em última instância, micróglios primários de alta pureza podem ser utilizados em ensaios subsequentes de cultura celular simples e co-cultura in vitro.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o método de gradiente Perico, é que a perturbação mecânica nominal minimiza a disfunção ou ativação microglial, e microglia para experimentos pode ser obtida por semanas após o preparo inicial. Demonstrarei este procedimento juntamente com Tammy Tero, aluna de pós-graduação no laboratório do Dr. Clifton Dau guard. As culturas de microglia de alta pureza obtidas durante este protocolo podem ser utilizadas

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para isolar e cultivar microglia de cérebros de ratos. Envolve a separação da microglia de outras células neuronais e não neuronais usando placas revestidas com um anticorpo monoclonal específico para a microglia.

Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

O vídeo demonstrou o método de isolar e cultivar células de um cérebro de camundongo neonatal. Envolveu dissociação enzimática e mecânica do cérebro, seguida de cultura em meios de crescimento sem fator de crescimento neuronal para obter uma população glial mista.

Obtenção de uma cultura de células gliais mistas de um cérebro de camundongo neonatal

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Aprenda a isolar microglia primária de cérebros de ratos neonatais usando cultura mista de células gliais. Este protocolo mecânico minimiza a ativação celular e fornece alta pureza para estudos in vitro de neurociência.

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

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