Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas primárias de células microgliais a partir de cérebros de ratos neonatos. Isso é realizado primeiramente isolando o cérebro e removendo as meninges. O segundo passo é homogeneizar o cérebro e semear a cultura glial mista em frascos T 75.

Em seguida, os frascos são incubados por 10 a 14 dias até que uma monocamada de astrócitos atinja confluência. O passo final é agitar os frascos para liberar os micróglios que estão crescendo sobre a monocamada de astrócitos, resultando em um cultivo purificado de micróglios. Em última instância, micróglios primários de alta pureza podem ser utilizados em ensaios subsequentes de cultura celular simples e co-cultura in vitro.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o método de gradiente Perico, é que a perturbação mecânica nominal minimiza a disfunção ou ativação microglial, e microglia para experimentos pode ser obtida por semanas após o preparo inicial. Demonstrarei este procedimento juntamente com Tammy Tero, aluna de pós-graduação no laboratório do Dr. Clifton Dau guard. As culturas de microglia de alta pureza obtidas durante este protocolo podem ser utilizadas em experimentos in vitro para estudar a função da microglia em condições fisiológicas normais, bem como em condições patológicas de doenças.

As microglias, a resposta ao dano tecidual, bem como aos estímulos inflamatórios, têm relevância direta para lesões neurológicas e condições de doenças neurodegenerativas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque não estão familiarizados com a forma de remover as meninges do tecido cerebral de maneira oportuna, a fim de reduzir a contaminação por fibroblastos nas culturas primárias de microglias. Além disso, deve-se ter cuidado para não danificar a monocamada de astrócitos durante a agitação dos frascos e o manuseio das culturas de microglias.

Para se preparar para o procedimento, resfrie o meio L 15 a quatro graus Celsius, prepare placas de Petri de 60 por 15 milímetros contendo meio L 15 e coloque sobre gelo. Aqueça o meio de cultura a 37 graus Celsius e certifique-se de que todas as ferramentas cirúrgicas foram esterilizadas. Após decapitar um filhote de rato P um a P cinco com tesoura afiada, mergulhe a cabeça em etanol 70%.

Após a coleta das cabeças de cinco filhotes de rato, transfira as cabeças para solução salina. Remova o cérebro inteiro de cada cabeça fazendo cuidadosamente incisões em ambos os lados do crânio acima das orelhas e puxando o cérebro para fora, colocando-o em uma das placas de Petri contendo meio L 15 sobre gelo. Assim que os primeiros cinco cérebros forem transferidos para o meio L 15 sobre gelo, os próximos cinco filhotes podem ser processados da mesma maneira, quando todos os cérebros tiverem sido coletados.

Remova as meninges agarrando suavemente uma borda da lâmina meníngea com uma pinça e descascando-a cuidadosamente da superfície do córtex subjacente. É essencial remover completamente as meninges e fazê-lo o mais rapidamente possível. Após a remoção das meninges, transfira cada cérebro para uma nova placa de Petri contendo meio L 15 sobre gelo.

Use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar o tecido cerebral e o meio da placa para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue a 2.500 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspire.

O supinato então utiliza uma pipeta estéril de 10 mililitros para Reese. Suspenda o pellet em quatro a cinco mililitros de meio L 15 fresco, pipetando o meio e o tecido para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, coloque um filtro celular de poro de 100 microns sobre um tubo cônico novo de 50 mililitros.

Utilize uma pipeta estéril de cinco mililitros para pipetar a suspensão tecidual para cima e para baixo e, em seguida, com a pipeta encostada no filtro celular, transfira o material através do filtro para o tubo cônico. Lave o filtro com quatro a cinco mililitros de meio L 15 fresco e resfriado. Em seguida, centrifugue a 2.500 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Para cada cérebro de filhote de rato processado, prepare um frasco estéril T 75 adicionando 12 mililitros de meio de cultura pré-aquecido em cada frasco. Em seguida, após aspirar o sobrenadante das células em pellet, adicione cinco a seis mililitros de meio de cultura ao pellet celular e pipete para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, transfira um volume igual de suspensão celular para cada frasco T 75.

Incube os frascos em uma estufa com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por um a três semanas, permitindo que as células permaneçam indisturbadas durante os primeiros cinco dias após o plaqueamento inicial. Após cinco dias, substitua o meio condicionado em cada frasco por 12 mililitros de meio fresco para atingir confluência. Isso deve ser feito com muito cuidado, sem tocar o fundo do frasco onde as células estão aderidas.

Uma vez que as culturas mistas de gliócitos atinjam confluência completa, retire o frasco do incubador. Cubra as tampas dos frascos com parafina para evitar a troca gasosa com o ar ambiente e coloque os frascos em um incubador agitador regulado em 100 RPS e 37 graus Celsius por uma hora. Após decorrido o tempo, utilize uma pipeta de 10 mililitros para coletar o meio dos frascos sem perturbar a camada de astrócitos e transfira para tubos cónicos de 50 mililitros. Adicione meio fresco aos frascos e retorne-os ao incubador.

Após centrifugar os tubos a 2.500 RCF durante cinco minutos a quatro graus Celsius, aspire o sobrenadante e re-suspenda as células em um mililitro de meio de plaqueamento de micróglias. Em seguida, conte as células utilizando um citômetro humano e procedimentos padrão. Uma vez determinado o número de células, adicione um volume apropriado de meio de plaqueamento de micróglias para obter uma concentração celular adequada.

Uma concentração de duas vezes 10 elevado a cinco células por mililitro da placa é apropriada para o experimento; retorne então à incubadora. Deixe os micróglios aderirem durante a noite. As células foram imunomarcadas com um anticorpo específico para IBA um, um marcador de micróglios, que aparece em vermelho.

Há uma contaminação mínima da cultura com células neuronais, conforme demonstrado por esta imagem de microscopia de imunomarcação usando um anticorpo para o novo marcador neuronal NA, que aparece em vermelho. A lâmina foi contra-marcada com DPI para corar todos os núcleos celulares de azul. Esta imagem mostra a imunomarcação com GFAP, um marcador de astrócitos.

Os astrócitos aparecem verdes. Aqui vemos uma imagem da cultura de micróglias imunomarcada com um anticorpo específico para CC um, um marcador de oligodendrócito. Os oligodendrócitos aparecem vermelhos.

Este histograma mostra os resultados da quantificação de cada tipo celular. Pode-se observar que os cultivos de micróglias plaqueados possuem pureza superior a 90%. Esta imagem de microscópio de fluorescência mostra um cultivo de micróglias que foi imunomarcado para IBA1.

As áreas vermelhas são microesferas de látex marcadas com fluorescência. A cultura de micróglias mostrada aqui foi tratada com um nanograma por mililitro de lipopolissacarídeo, e pode-se observar que as células de micróglias fagocitaram as microesferas de látex marcadas com fluorescência. Aqui, os resultados do ensaio de fagocitose são exibidos em um histograma.

Observa-se aumento da fagocitose após tratamento com LPS. Esta figura mostra que a produção de óxido nítrico também aumenta em culturas de micróglias após a adição de LPS. Por fim, culturas de neurônios com micróglias separadas direta ou indiretamente por insertos tipo transwell são suscetíveis ao aumento da morte celular após incubação com LPS, conforme medido pela liberação de desidrogenase láctica. Após dominar a primeira parte desta técnica, todo o procedimento até o plaqueamento em frascos T 75 pode ser realizado em uma hora e meia, e o procedimento completo pode ser concluído dentro de duas semanas.

Outro aspecto a considerar durante a otimização deste protocolo é determinar a duração do tempo. As culturas mistas de gliócitos devem ser mantidas antes do isolamento de micróglias primárias para semeadura, após o estabelecimento de culturas de alta pureza. Utilizando este procedimento, a função das micróglias pode ser avaliada in vitro por meio da medição da produção de óxido nítrico, liberação de citocinas e quimiocinas, além de atividade fásica, todos determináveis e mensuráveis com ensaios laboratoriais de rotina.

Assim, com o desenvolvimento deste procedimento, pesquisadores na área de neurociência têm a capacidade de explorar a atividade das micróglias em um ambiente celular homogêneo e investigar seus papéis sob diversas condições neurológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar culturas primárias de células microgliais a partir de cérebros de ratos neonatos. Primeiro, isolando o cérebro e removendo as meninges, em seguida homogeneizando o cérebro e plaqueando em frascos, os quais são incubados por 10 a 14 dias até que uma monocamada de astrócitos atinja confluência.

O passo final é agitar os frascos para liberar os micróglios que estão crescendo sobre a monocamada de astrócitos, resultando em um cultivo purificado de micróglios.