Name: Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a cultivar células progenitoras neurais humanas em hidrogel de peptídeo 3D para análise de diferenciação neuronal. Este método utiliza citometria de fluxo para quantificar marcadores de diferenciação e apoptose.

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Os autores gostariam de agradecer a Norman Krüger para o seu excelente suporte técnico.

1. Parte 1: Cultura da hNPCs em PuraMatrix <ol><li> Com antecedência, para a geração de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix sem laminina, é necessário preparar as seguintes soluções </li><li> Prepare uma solução contendo sacarose 20% e uma solução contendo 10% de sacarose dissolvida em água destilada estéril. </li><li> Para solução 1 ml mix 120 da solução de sacarose 20% com 120 mL de água destilada em um tubo de 1,5 ml cônico. </li><li> Para a solução 2 mL mix 60 do PuraMatrix solução com 60 ml de solução de sacarose 20% em um tubo de 1,5 ml cônico. </li></ol> De uma preparação de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix suplementado com laminina (8 mg por 100 mL Matrix), é necessário preparar as seguintes soluções. <ol class="lroman"><li> Para solução 1 ml mix 72 de água destilada com 120 ml de solução de sacarose 20% e 48 mL laminina em um tubo de 1,5 ml cônico. </li><li>Para a solução 2 mix solução PuraMatrix 60 mL com 60 mL da solução de sacarose 20% em um tubo de 1,5 ml cônico. </li></ol><ol start="5"><li> Para o encaixe de células no PuraMatrix preparar um 4-bem placa de cultura de células e coloque uma lamínula esterilizada de vidro (mm diâmetro 13) em dois poços. Armazenar a placa na bancada limpa para o uso posterior. Lamínulas de vidro são utilizadas apenas para os estudos imunocitoquímicos. Se não colorações imunocitoquímicos são destinados, a etapa pode ser ignorada. </li></ol> Para preparar o hNPCs para encapsulamento em um scaffolds 3D tem que se preparar as seguintes soluções. Diluir o Benzonase na solução Tripsina / EDTA, utilizando um factor de diluição de 1:10.000. Para uma mistura solução Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + Tripsina-inibidor (0,5 mg). <ol start="6"><li> Separar as células por adição de 500 solução de Tripsina / Benzonase mL e incubar por 5 min em uma incubadora (37 CO ° C, 5% 2). Parar a reação com solução Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Posteriormente centrifugar as células destacadas por 5 min a 3000 x g. Lavar as células com 5 ml da solução de sacarose 10% e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em solução de sacarose 10%, a solução final deve conter células 1x10 6 células / ml. </li></ol> Os próximos passos, 1,8-1,11, deve ser feito o mais rápido possível, devido ao baixo pH da solução PuraMatrix, o que pode ser prejudicial para as células. <ol start="8"><li> Misture 60 mL de suspensão de células com a solução 1. </li><li> Adicione 120 ml de solução 1, que contém as células, para o tubo cônico com solução de 2 e misture cuidadosamente. </li><li> ML colocar 100 da mistura imediatamente sobre cada tampa desliza residia na placa de quatro poços. </li><li> Adicione lentamente 200 mL meio de cultura de células por poço e depois de 2-3 minutos outra mL 200. Isto irá iniciar o auto-montagem da matriz. </li><li> Incubar cells a 37 ° C, por 1h na bancada limpa em uma placa de aquecimento ou a área aquecida de sua bancada limpa. Na medida do possível não se movem a placa pois isso pode prejudicar a montagem das matrizes. </li><li> Remover a maior parte do meio, mas não todos, para evitar as matrizes caindo seco, com uma pipeta de 1000 mL. Adicionar 500 mL de meio de matrizes para lavar por 10 min. Finalmente retire a médio e adicionar 500 mL de médio fresco e colocar a placa de cultura em uma incubadora (37 ° CO C, 5% 2). Como as matrizes são sensíveis ao choque das placas deve ser movido o menos possível e armazenado, se possível, em uma incubadora separado. </li><li> O hNPCs aqui utilizados foram proliferaram por 7 dias no scaffolds 3D e diferenciação foi iniciada pela retirada dos fatores de crescimento 13. Meio foi trocado a cada 2-3 dias. </li></ol> 2. Parte 2: coloração imunocitoquímico de matrizes inteira <ol><li> Com antecedência, para o procedimento de coloração, é necessário preparar: absolução tampão de bloqueio constituído de soro de cabra normal de 5% e 0,3% de Triton X-100 (dissolvida em PBS, uma solução de paraformaldeído a 4% com base em 0,1 M PBS e se precisava de uma solução com 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) para uma coloração núcleos contendo 100 ng DAPI / ml dissolvida em PBS. As amostras foram montadas com uma mistura de Mowiol e DABCO. </li><li> Para lavar as matrizes remover o meio com uma pipeta de 1000 mL e lavar os andaimes, uma vez com PBS por 5 minutos. </li><li> Para corrigir os andaimes remover o PBS e adicionar 400 mL de paraformaldeído (4% em 0,1 M PBS) para cada poço e incubar as matrizes por 30 minutos em temperatura ambiente. Os andaimes fixos podem ser armazenados em PBS suplementado com 0,02% NaN 3 a 4 ° C por várias semanas até vários meses. </li><li> Antes de uma coloração lavar os andaimes com PBS por 5 minutos. </li><li> Incubar os andaimes em solução de bloqueio buffer. Solução de bloqueio foi mudado três vezes a cada 2-3 horas e subsequcantes andaimes foram incubadas em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução tampão de bloqueio e adicionar o anticorpo primário dissolvida em PBS suplementado com soro de cabra normal de 1% e incubar as matrizes durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução anticorpo primário e lavar andaimes 4 vezes por 2 h e, posteriormente, durante a noite a 4 ° C com PBS. </li><li> Remover o PBS e adicionar a solução com o anticorpo secundário, dissolvida em PBS suplementado com soro de cabra 1% normal, por 4 h à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar as amostras com PBS 4-6 vezes por 1 hora e, posteriormente, durante a noite a 4 ° C no escuro. </li><li> Para uma coloração núcleos pode-se adicionar 400 mL da solução de DAPI por 30 min. </li><li> Para montar as amostras é necessário lâminas de microscópio. Adicionar 50 mL Mowiol / Dabco na lâminas de microscópio. Remova a tampa desliza a partir da placa de 4 bem e colocá-los cuidadosamente sobre o meio de montagem. </li><li> Aqui usamos um 8000 Biozeromicroscópio (Keyence, Alemanha, Karlsruhe) para obter micrografias única e z-stacks. Cada pilha contém 30 imagens de solteiro com uma distância de M 1-2. Usando o software analisador correspondentes a desfocagem inerente à fluorescência foi removido antes projeções completa do z-stacks foram produzidos. </li></ol> 3. Parte 3: Lançamento do hNPCs dos andaimes para a análise de citometria de fluxo <ol><li> Com antecedência, para a liberação das células de andaimes lavar os andaimes com 500 mL HBSS. </li><li> Transferir os andaimes por meio de uma pipeta de 1000 mL para um tubo cônico de 15 ml contendo meio de cultura celular. </li><li> Para perturbar a andaimes mecanicamente ressuspender a solução celular várias vezes com uma pipeta de 1000 mL e, posteriormente, centrifugar a solução a 3000 xg por 5 min. </li><li> Retire o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 500 mL de tripsina / Benzonase solução e ressuspender o pellet celular várias vezes. </li><li> Incubar as células por 5 mina 37 ° C na solução de Tripsina / Benzonase. Para parar a reacção adicionar uma solução Trypsin-inhibitor/Benzonase ml e pipeta para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Centrifugar a suspensão celular 5 min a 3000 xg, remover o sobrenadante e lavar as células com tampão HBSS 2 ml. Repita este passo duas vezes. Este procedimento irá remover os restos da matriz. </li><li> Passe o celular através de um filtro solução suspensão celular (tamanho dos poros 70 mm) para remover agregados e recolher as células em meio de cultura celular. As células obtidas podem ser semeados novamente por exemplo, sobre lamínulas para estudos funcionais como patch clamp ou medições fluometric. Para processar as células para citometria de fluxo, as células corrigir imediatamente (ver 4.1). </li></ol> 4. Parte 4: Quantificação de βIII-tubulina células positivas por citometria de fluxo <ol><li> Fixar as células lançado obtida no passo 3.7 com PFA 1% por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 3000 xg e remove o sobrenadante. Se necessário, as células podem estar preparado para ser armazenado a 4 ° C para posterior análise. Portanto, as células ressuspender em tampão de lavagem (PBS suplementado com BSA 0,5% e 0,02% Na-azida). </li><li> Para prosseguir com a preparação para a citometria de fluxo, centrifugar a suspensão celular por 10 minutos a 350 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 25 mL da solução de anticorpos. Portanto, o primeiro anticorpo é misturado com tampão de saponina na concentração 1:100 por exemplo βIII-tubulina. O buffer de saponina consiste em PBS com uma concentração de 0,5% saponina, uma concentração de BSA de 0,5% e uma concentração de Na-azida de 0,02%. </li><li> Incubar a suspensão de células com o primeiro anticorpo para 2 h à temperatura ambiente em um agitador. Como controle negativo preparar uma amostra sem o primeiro anticorpo. </li><li> Para a etapa primeira lavagem adicionar 300 mL de buffer saponina diretamente para as células. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 350 x g. Para a segunda lavagem, descartaro sobrenadante, adicionar 300 mL de buffer e centrifugar a suspensão de células por 5 min a 350 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 25 mL de solução contendo o anticorpo secundário (por exemplo Alexa Fluor 647, 1:1000, dissolvido em tampão saponina). Incubar as células com o anticorpo secundário 1h à temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Para a etapa primeira lavagem adicionar 300 mL de buffer saponina diretamente para as células. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 350 x g. Para a segunda lavagem, descartar o sobrenadante, adicionar 300 mL de buffer e centrifugar a suspensão de células por 5 min a 350 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 mL de tampão de lavagem para a análise de citometria de fluxo. </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de hNPCs cultivadas em auto-montagem de andaime PuraMatrix hidrogel é mostrado na figura 1. O hNPCs crescer em estruturas esféricas como na PM não modificado. Nesta condição culturas, as células dificilmente pode ser reconhecido em uma transmissão de luz, apesar de feixes de processos entre as esferas são visíveis (fig. 1A). Dependendo das condições de cultura do tipo de célula utilizada, a matriz pode ser modificado por exemplo, pela adição de laminina. Para a linha de células hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina é necessário para induzir um padrão de crescimento com agregados menos densos, mas uma distribuição mais homogênea das células (Fig 1b). Independente das modificações, a matriz pode ser usado para estudar a diferenciação neuronal, por exemplo. Figura 1C apresenta uma coloração do hNPCs para o marcador neuronal βIII-tubulina. Neste exemplo as células foram cultivadas por 7 dias na matriz e, posteriormente, diferenciada por 4 dias, onde a diferenciação foi induzida pela retirada do EGF e fatores de crescimento. BFGF 13 corpos celulares e uma densa rede de processos construída pelas células pode ser reconhecidos facilmente. No entanto, é óbvio que uma quantificação do número de células é demorado, como um grande número deimagens de diferentes regiões da matriz tem de ser analisada, para se obter uma base de dados confiável para uma análise estatística. Em 1D fig pode-se ver um exemplo de células libertada da matriz e, posteriormente, tecendo sobre lamínulas. Essas células poderiam ser usadas para estudos funcionais. A liberação das células do scaffolds 3D oferece a possibilidade de analisar diferentes parâmetros, como expressão de proteínas marcadoras ou a taxa de sobrevivência das células por AnnexinV / PI coloração ou um ensaio de TUNEL. A Figura 2 mostra um exemplo de uma análise de citometria de fluxo da percentagem de células βIII-tubulina +. O controle negativo (células não marcadas para βIII-tubulina) é mostrado na Figura 2a. Esses controles são usados ​​para determinar o portão para a detecção mais recente do βIII-tubulina + células (fig. 2B). Uma comparação de uma contagem manual de células e uma análise por citometria de fluxo é mostrado na figura 2C. A porcentagem de células βIII-tubulina + foi determINED pela contagem do número total de células (por meio de uma coloração DAPI nuclear) eo número de células βIII-tubulina + nas fotos de fluorescência. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figura 1. hNPCs cultivadas em PuraMatrix hidrogel de auto-montagem de peptídeos. A hNPCs) encapsulado em PuraMatrix (PM) crescer em spheric, densas estruturas lotado, onde o diâmetro das esferas pode ser até várias centenas de M. Entre as esferas pode-se reconhecer pacotes de processos construída pelas células (setas). B) As células encapsuladas em PuraMatrix suplementado com laminina (PML) crescem em estruturas menos denso, mais homogeneamente distribuída. Na laminina complementada matriz pode-se reconhecer células individuais em áreas menos densas (setas), no entanto, é quase impossível quantificar o número de células. C) hNPCs diferenciados para 4 dias em PML marcador neuronal expressar como βIII-tubulina (verde). Para avaliaçãote a porcentagem de células positivas é preciso determinar o número total de células por uma coloração núcleos como o DAPI (azul). A microfotografia apresenta a projeção total de um z pilha de fotos tiradas com Biozero-8000 microscópio. D) Células lançado a partir da matriz podem ser semeadas em lamínulas por exemplo, para estudos funcionais. A microfotografia mostra células cultivadas por 3d, posteriormente, ao processo de libertação. A coloração para βIII-tubulina (vermelho) revela uma morfologia semelhante às células hospedado no andaime 3D. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figura 2. Células de fluxo citometria liberado PuraMatrix. Para superar a quantificação demorada de microfotografias foi utilizado um protocolo para liberação de células cultivadas em PuraMatrix que dá acesso a uma análise mais rápida por citometria de fluxo. Um células) Unstained foram usados ​​como controle negativo, para definir o portão (moldura preta) para a análise posteriormentede, por exemplo βIII-tubulina células. B) Para quantificar o percentual de βIII-tubulina + células mesma porta, situado no controle negativo, foi utilizado. Células positivas aparecem na parte direita do eixo x, onde também uma população intermediária foi observado (frame pontilhada), restos celulares mais provável que representam. C) A comparação do manual células contadas e células contadas por citometria de fluxo revelou uma proporção muito maior de células positivas, onde a dependência temporal do número de βIII-tubulina + foi comparável, o que indica a confiabilidade do protocolo de citometria de fluxo.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O uso do 3D-scaffolds oferece a oportunidade de estudar o desenvolvimento de diferentes tipos de células em uma situação de cultura de células mais perto a situação in vivo. No entanto, quanto à análise da diferenciação neuronal por exemplo, ou estudos funcionais é preciso superar alguns obstáculos para obtenção de dados confiáveis ​​para quantificação por exemplo, de tipos de células. Aqui descrevemos a cultura de hNPCs no hidrogel baseada peptídeo scaffold PuraMatrix e po...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> PuraMatrix hidrogel peptídeo </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Rato laminina I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Solução de Hanks salina balanceada 1X </td></tr><tr><td&gt; Anticorpo βIII-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mouse, monoclonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.029 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.031 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21.235 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol Reagente 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98% </td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 mM tamanho dos poros </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / mL </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> A albumina humana-Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel peptide 3-dimensional de auto-montagem

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A influência de três dimensões (3D) andaimes em diferenciação, proliferação, crescimento e finalmente neuronal é de grande interesse, a fim de encontrar novos métodos de terapias baseadas em células e padronizado em distúrbios neurológicos ou doenças neurodegenerativas. Estruturas 3D são esperados para proporcionar um ambiente muito mais próximo da situação in vivo do que as culturas 2D. No contexto da medicina regenerativa, a combinação de andaimes biomaterial com tronco neurais e células progenitoras é uma grande promessa como uma ferramenta terapêutica. 1-5 sistemas Cultura emular um ambiente tridimensional foram mostrados para influenciar a proliferação e diferenciação em diferentes tipos de caule e células progenitoras. Aqui, a formação e funcionalização do 3D microenviroment é importante para determinar a sobrevivência e destino das células incorporado. 6-8 Aqui usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), um peptídeo com base hidrogel andaime,que é bem descrito e utilizado para estudar a influência de um ambiente 3D sobre diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix podem ser facilmente personalizados ea fabricação sintética do nano-fibras fornece um sistema de cultura 3D de alta confiabilidade, que é, além xeno-free. Recentemente, têm estudado a influência da concentração de PM-sobre a formação do andaime. 13 Neste estudo as concentrações utilizadas da PM teve um impacto direto sobre a formação da estrutura em 3D, que foi demonstrada por microscopia de força atômica. Uma análise posterior da sobrevivência e diferenciação dos hNPCs revelou uma influência das concentrações utilizadas da PM sobre o destino das células incorporado. No entanto, a análise de sobrevida ou diferenciação neuronal por meio de técnicas de imunofluorescência possuir alguns obstáculos. Para obter dados confiáveis, é preciso determinar o número total de células dentro de uma matriz para obter o número relativo de exemplo. células neuronais marcados por βIII-tubulina. Este pré-requisitos de uma técnica para analisar os andaimes em todas as dimensões de 3 por um microscópio confocal ou uma técnica comparável como microscópios de fluorescência capaz de tomar z-stacks da amostra. Além disso, este tipo de análise é extremamente demorado. Aqui demonstramos um método para liberar as células dos andaimes 3D para a análise posterior por exemplo, por citometria de fluxo. Neste protocolo células progenitoras neurais (hNPCs) da linha celular ReNcell VM (Millipore EUA) foram cultivadas e diferenciadas em 3D-scaffolds consistindo de PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix suplementado com laminina (PML). Em nossas mãos um PM-concentração de 0,25% foi ideal para o cultivo das 13 células, no entanto, a concentração pode ser adaptado para outros tipos celulares. 12 As células liberado pode ser usado para, por exemplo estudos imunocitoquímicos e posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Isso acelera a análise e more mais, o resto os dados obtidos sobre uma base mais ampla, melhorando a confiabilidade dos dados.

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

A influência de scaffolds tridimensionais (3D) no crescimento, proliferação e, finalmente, na diferenciação neuronal é de grande interesse para encontrar novos...

O objetivo geral deste procedimento é acelerar a análise da diferenciação neuronal de células progenitoras neurais humanas cultivadas em um ambiente tridimensional. Isso é realizado primeiramente cultivando as células na matriz pura de hidrogel baseado em peptídeos autoagregáveis. Em seguida, as células são liberadas dos suportes tridimensionais.No terceiro passo, a coloração imunofitiquímica das células é realizada na etapa final. As células são enumeradas por meio de análise citométrica de fluxo. Em última instância, a taxa de diferenciação neuronal ou a taxa de apoptose pode ser determinada por meio da análise citométrica de fluxo para marcadores neuronais ou apoptóticos, respectivamente.Com esta técnica, a quantificação da diferenciação neural é muito mais rápida e os dados Optane west são ampliados em uma base mais ampla e em técnicas de microfotografia. Para a incorporação de células na matriz pura, coloque primeiro uma lamínula de vidro esterilizada com diâmetro de 13 milímetros em cada um dos dois poços de uma placa de cultura celular de quatro poços. Em seguida, armazene a placa em uma bancada limpa para uso posterior. A seguir, desprenda as células progenitoras neurais humanas ou H NPCs adicionando 2,5 mililitros de tripsina recém-preparada.Adicione benzon à solução na placa de cultura e incube a suspensão celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após cinco minutos, interrompa a reação com inibidor de tripsina benzon em solução. Em seguida, após centrifugar as células destacadas a 3000 × g à temperatura ambiente por cinco minutos, ressuspenda o pellet resultante com cinco mililitros de uma solução de sacarose a 10%, e então lave a suspensão celular nas mesmas condições de centrifugação.Após descartar o sobrenadante de ressuspensão, suspenda o pellet na solução de sacarose até uma concentração final de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Agora, o mais rapidamente possível, misture 60 microlitros da suspensão celular com a solução um, transfira 120 microlitros dessa suspensão para o tubo cônico com a solução dois e misture cuidadosamente; em seguida, imediatamente, sobreponha 100 microlitros da mistura sobre cada lamínula na placa de quatro poços. Por fim, adicione lentamente 200 microlitros de meio de cultura celular a cada poço.Após dois a três minutos, adicione mais 200 microlitros de meio de cultura celular aos poços, iniciando a autoagregação da matriz. Incube as células a 37 graus Celsius por uma hora na área aquecida da sua bancada limpa. Evitando mover a placa de cultura celular o máximo possível após a montagem das matrizes, utilize uma pipeta de 1000 microlitros para remover a maior parte, mas não todo, o meio, a fim de evitar o ressecamento das matrizes.Em seguida, lave as matrizes com 500 microlitros de meio fresco durante 10 minutos. Por fim, remova o meio de lavagem. Adicione mais 500 microlitros de meio e coloque a placa de cultura em uma incubadora.Se possível, armazene as matrizes em seu próprio incubador para evitar agitação acidental das estruturas no primeiro dia do experimento de coloração. Remova o meio das matrizes com uma pipeta de 1000 microlitros e, em seguida, lave as estruturas com PBS uma vez por cinco minutos.Em seguida, remova o PBS e adicione 400 microlitros de paraformaldeído em cada poço para fixar as matrizes e incube-as por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação dos suportes, lave-os com 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. Em seguida, incube as estruturas com o tampão bloqueador por seis a nove horas, trocando o tampão a cada duas a três horas, com uma incubação final durante a noite em tampão bloqueador fresco a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova o tampão bloqueador.Adicione a solução de anticorpo aos poços e incube as matrizes novamente a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, remova a solução de anticorpo primário e lave as estruturas em 500 microlitros de PBS por oito horas, trocando o PBS a cada duas horas e, em seguida, mantenha em repouso durante a noite a quatro graus Celsius com PBS fresco. Após a lavagem noturna, remova o PBS e incube as estruturas com a solução de anticorpo secundário por quatro horas à temperatura ambiente, no escuro.Em seguida, lave as amostras com PBS de quatro a seis vezes, durante uma hora cada vez, e então incube as estruturas com PBS fresco a quatro graus Celsius, no escuro, durante a noite. Agora, adicione 50 microlitros de MOE all dab co sobre as lâminas de microscopia para prepará-las para a montagem das matrizes. Em seguida, monte cuidadosamente uma lamínula sobre cada lâmina.Por fim, utilize um microscópio fluorescente para obter micrografias individuais e Zacks semelhantes à coloração verde dos H NPCs para a expressão do marcador neuronal beta três tubulina mostrada aqui. Após lavar as estruturas com 500 microlitros de HBSS durante um minuto, use uma pipeta de 1000 microlitros para transferir as estruturas para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, ressuspenda a solução celular várias vezes com uma pipeta de 1000 microlitros para romper mecanicamente as matrizes e, posteriormente, centrifugue a solução das estruturas a 3000 vezes G, à temperatura ambiente, por cinco minutos, remova o sobrenadante com uma pipeta e, então, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de tripsina benzina pipetando para cima e para baixo várias vezes.Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius. Interromper a reação após cinco minutos com um mililitro de inibidor de tripsina. Pipetar para cima e para baixo várias vezes a solução de benzase após centrifugar a suspensão celular nas mesmas condições de centrifugação.Remova qualquer detrito da matriz lavando as células com dois mililitros de tampão HBSS duas vezes. Por fim, remova os agregados passando a solução de suspensão celular através de uma centrífuga com peneira celular de 70 mícrons nas mesmas condições e colete as células em meio de cultura celular. Comece fixando as células dissociadas em paraformaldeído 1% por 15 minutos à temperatura ambiente em agitador.Em seguida, após centrifugar as células, ressuspenda o pellet no tampão de lavagem. Agora, após centrifugar as células por 10 minutos a 350 × g a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet resultante em 25 microlitros da solução de anticorpo. Incube a suspensão celular por duas horas à temperatura ambiente em agitador.Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão pon diretamente às amostras e, depois, lave as suspensões celulares duas vezes nas mesmas condições de centrífuga. Após a segunda lavagem, adicione 25 microlitros do anticorpo secundário e incube as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, após lavar as células mais duas vezes com tampão saponina, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lavagem para análise por citometria de fluxo.Nesta figura, H NPCs encapsuladas e matriz pura mostram que as células crescem em estruturas esféricas, densamente empacotadas, nas quais o diâmetro das esferas pode atingir várias centenas de mícrons entre as esferas. Feixes de prolongamentos formados pelas células podem ser observados, conforme indicado pelas setas brancas. Embora células individuais mal possam ser reconhecidas, células encapsuladas em matriz pura suplementada com laminina crescem em estruturas menos densas e são mais homogeneamente distribuídas, como visto nesta figura; células individuais podem até ser reconhecidas em áreas menos densas, conforme indicado pelas setas pretas. Aqui, H NPCs diferenciadas por quatro dias em matriz pura suplementada com laminina coradas em verde para a expressão do marcador neuronal.A tubulina beta três é mostrada para avaliar a porcentagem de células positivas. O número total de células pode ser determinado pela contagem dos núcleos celulares corados aqui em azul com DAPI. Esta microfotografia representa a projeção completa de um empilhamento Z de imagens obtidas com um microscópio fluorescente.Células liberadas da matriz podem ser recultivadas novamente, por exemplo, sobre lamínulas, conforme mostrado nesta figura para estudos funcionais adicionais. Esta microfotografia mostra células cultivadas em 3D após terem sido submetidas ao procedimento de liberação previamente mencionado e cultivadas por três dias. A coloração para tubulina beta três em vermelho revela uma morfologia comparável à das células mantidas no andarilho 3D, utilizando células não coradas como controle negativo.O GA representado aqui como o quadro preto foi definido para a análise subsequente de células positivas para beta três tubulina neste gráfico de dispersão, as células positivas aparecem dentro do quadro preto na parte direita do eixo x e uma população intermediária no quadro tracejado, que muito provavelmente representa detritos celulares, também pode ser observada. Uma comparação entre a contagem celular manual e a enumeração por citometria de fluxo é mostrada nesta figura final. Uma proporção muito maior de células positivas pode ser detectada pela análise por citometria de fluxo, conforme indicado pelos quadrados pretos abertos, do que pode ser tipicamente enumerada pela contagem manual, conforme indicado pelos triângulos pretos sólidos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar métricas inadequadas para o cultivo de MPCs da borda em um suporte tridimensional e de como liberar as células do suporte para analisadores citométricos de fluxo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Este protocolo demonstra métodos utilizados para estabelecer ambientes 2D e 3D em câmaras de design personalizado electrotactic, que pode acompanhar...

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

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Diferenciando células-tronco neuronais humanas em cultura 3D usando um andaime poroso

Este vídeo demonstra uma técnica para estabelecer uma cultura tridimensional de células gliais. As células gliais derivadas do cérebro de rato são encapsuladas em uma matriz polimérica fotoreticulável contendo componentes da matriz extracelular. Ao incubar em um meio de crescimento, as células gliais proliferam dentro da matriz de suporte para criar uma cultura tridimensional.

Estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais derivadas do cérebro de rato

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir coculturas bioimpressas em 3D de neurônios e astrócitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultura, gerado dentro de um arcabouço de hidrogel em formatos de 96 ou 384 poços, demonstra alta viabilidade pós-impressão e crescimento de neuritos em 7 dias e mostra a expressão de marcadores de maturidade para ambos os tipos celulares.

Bioimpressão Tridimensional de Coculturas Neurônio-Astrócitos Derivadas de iPSC Humanas para Aplicações de Triagem

Aprenda a cultivar células progenitoras neurais humanas em hidrogel de peptídeo 3D para análise de diferenciação neuronal. Este método utiliza citometria de fluxo para quantificar marcadores de diferenciação e apoptose.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

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