Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

O objetivo geral deste procedimento é acelerar a análise da diferenciação neuronal de células progenitoras neurais humanas cultivadas em um ambiente tridimensional. Isso é realizado primeiramente cultivando as células na matriz pura de hidrogel baseado em peptídeos autoagregáveis. Em seguida, as células são liberadas dos suportes tridimensionais.

No terceiro passo, a coloração imunofitiquímica das células é realizada na etapa final. As células são enumeradas por meio de análise citométrica de fluxo. Em última instância, a taxa de diferenciação neuronal ou a taxa de apoptose pode ser determinada por meio da análise citométrica de fluxo para marcadores neuronais ou apoptóticos, respectivamente.

Com esta técnica, a quantificação da diferenciação neural é muito mais rápida e os dados Optane west são ampliados em uma base mais ampla e em técnicas de microfotografia. Para a incorporação de células na matriz pura, coloque primeiro uma lamínula de vidro esterilizada com diâmetro de 13 milímetros em cada um dos dois poços de uma placa de cultura celular de quatro poços. Em seguida, armazene a placa em uma bancada limpa para uso posterior. A seguir, desprenda as células progenitoras neurais humanas ou H NPCs adicionando 2,5 mililitros de tripsina recém-preparada.

Adicione benzon à solução na placa de cultura e incube a suspensão celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após cinco minutos, interrompa a reação com inibidor de tripsina benzon em solução. Em seguida, após centrifugar as células destacadas a 3000 × g à temperatura ambiente por cinco minutos, ressuspenda o pellet resultante com cinco mililitros de uma solução de sacarose a 10%, e então lave a suspensão celular nas mesmas condições de centrifugação.

Após descartar o sobrenadante de ressuspensão, suspenda o pellet na solução de sacarose até uma concentração final de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Agora, o mais rapidamente possível, misture 60 microlitros da suspensão celular com a solução um, transfira 120 microlitros dessa suspensão para o tubo cônico com a solução dois e misture cuidadosamente; em seguida, imediatamente, sobreponha 100 microlitros da mistura sobre cada lamínula na placa de quatro poços. Por fim, adicione lentamente 200 microlitros de meio de cultura celular a cada poço.

Após dois a três minutos, adicione mais 200 microlitros de meio de cultura celular aos poços, iniciando a autoagregação da matriz. Incube as células a 37 graus Celsius por uma hora na área aquecida da sua bancada limpa. Evitando mover a placa de cultura celular o máximo possível após a montagem das matrizes, utilize uma pipeta de 1000 microlitros para remover a maior parte, mas não todo, o meio, a fim de evitar o ressecamento das matrizes.

Em seguida, lave as matrizes com 500 microlitros de meio fresco durante 10 minutos. Por fim, remova o meio de lavagem. Adicione mais 500 microlitros de meio e coloque a placa de cultura em uma incubadora.

Se possível, armazene as matrizes em seu próprio incubador para evitar agitação acidental das estruturas no primeiro dia do experimento de coloração. Remova o meio das matrizes com uma pipeta de 1000 microlitros e, em seguida, lave as estruturas com PBS uma vez por cinco minutos.

Em seguida, remova o PBS e adicione 400 microlitros de paraformaldeído em cada poço para fixar as matrizes e incube-as por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação dos suportes, lave-os com 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. Em seguida, incube as estruturas com o tampão bloqueador por seis a nove horas, trocando o tampão a cada duas a três horas, com uma incubação final durante a noite em tampão bloqueador fresco a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova o tampão bloqueador.

Adicione a solução de anticorpo aos poços e incube as matrizes novamente a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, remova a solução de anticorpo primário e lave as estruturas em 500 microlitros de PBS por oito horas, trocando o PBS a cada duas horas e, em seguida, mantenha em repouso durante a noite a quatro graus Celsius com PBS fresco. Após a lavagem noturna, remova o PBS e incube as estruturas com a solução de anticorpo secundário por quatro horas à temperatura ambiente, no escuro.

Em seguida, lave as amostras com PBS de quatro a seis vezes, durante uma hora cada vez, e então incube as estruturas com PBS fresco a quatro graus Celsius, no escuro, durante a noite. Agora, adicione 50 microlitros de MOE all dab co sobre as lâminas de microscopia para prepará-las para a montagem das matrizes. Em seguida, monte cuidadosamente uma lamínula sobre cada lâmina.

Por fim, utilize um microscópio fluorescente para obter micrografias individuais e Zacks semelhantes à coloração verde dos H NPCs para a expressão do marcador neuronal beta três tubulina mostrada aqui. Após lavar as estruturas com 500 microlitros de HBSS durante um minuto, use uma pipeta de 1000 microlitros para transferir as estruturas para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, ressuspenda a solução celular várias vezes com uma pipeta de 1000 microlitros para romper mecanicamente as matrizes e, posteriormente, centrifugue a solução das estruturas a 3000 vezes G, à temperatura ambiente, por cinco minutos, remova o sobrenadante com uma pipeta e, então, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de tripsina benzina pipetando para cima e para baixo várias vezes.

Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius. Interromper a reação após cinco minutos com um mililitro de inibidor de tripsina. Pipetar para cima e para baixo várias vezes a solução de benzase após centrifugar a suspensão celular nas mesmas condições de centrifugação.

Remova qualquer detrito da matriz lavando as células com dois mililitros de tampão HBSS duas vezes. Por fim, remova os agregados passando a solução de suspensão celular através de uma centrífuga com peneira celular de 70 mícrons nas mesmas condições e colete as células em meio de cultura celular. Comece fixando as células dissociadas em paraformaldeído 1% por 15 minutos à temperatura ambiente em agitador.

Em seguida, após centrifugar as células, ressuspenda o pellet no tampão de lavagem. Agora, após centrifugar as células por 10 minutos a 350 × g a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet resultante em 25 microlitros da solução de anticorpo. Incube a suspensão celular por duas horas à temperatura ambiente em agitador.

Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão pon diretamente às amostras e, depois, lave as suspensões celulares duas vezes nas mesmas condições de centrífuga. Após a segunda lavagem, adicione 25 microlitros do anticorpo secundário e incube as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, após lavar as células mais duas vezes com tampão saponina, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lavagem para análise por citometria de fluxo.

Nesta figura, H NPCs encapsuladas e matriz pura mostram que as células crescem em estruturas esféricas, densamente empacotadas, nas quais o diâmetro das esferas pode atingir várias centenas de mícrons entre as esferas. Feixes de prolongamentos formados pelas células podem ser observados, conforme indicado pelas setas brancas. Embora células individuais mal possam ser reconhecidas, células encapsuladas em matriz pura suplementada com laminina crescem em estruturas menos densas e são mais homogeneamente distribuídas, como visto nesta figura; células individuais podem até ser reconhecidas em áreas menos densas, conforme indicado pelas setas pretas. Aqui, H NPCs diferenciadas por quatro dias em matriz pura suplementada com laminina coradas em verde para a expressão do marcador neuronal.

A tubulina beta três é mostrada para avaliar a porcentagem de células positivas. O número total de células pode ser determinado pela contagem dos núcleos celulares corados aqui em azul com DAPI. Esta microfotografia representa a projeção completa de um empilhamento Z de imagens obtidas com um microscópio fluorescente.

Células liberadas da matriz podem ser recultivadas novamente, por exemplo, sobre lamínulas, conforme mostrado nesta figura para estudos funcionais adicionais. Esta microfotografia mostra células cultivadas em 3D após terem sido submetidas ao procedimento de liberação previamente mencionado e cultivadas por três dias. A coloração para tubulina beta três em vermelho revela uma morfologia comparável à das células mantidas no andarilho 3D, utilizando células não coradas como controle negativo.

O GA representado aqui como o quadro preto foi definido para a análise subsequente de células positivas para beta três tubulina neste gráfico de dispersão, as células positivas aparecem dentro do quadro preto na parte direita do eixo x e uma população intermediária no quadro tracejado, que muito provavelmente representa detritos celulares, também pode ser observada. Uma comparação entre a contagem celular manual e a enumeração por citometria de fluxo é mostrada nesta figura final. Uma proporção muito maior de células positivas pode ser detectada pela análise por citometria de fluxo, conforme indicado pelos quadrados pretos abertos, do que pode ser tipicamente enumerada pela contagem manual, conforme indicado pelos triângulos pretos sólidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar métricas inadequadas para o cultivo de MPCs da borda em um suporte tridimensional e de como liberar as células do suporte para analisadores citométricos de fluxo.