Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

A microscopia multifotônica de tecido fixo é normalmente limitada a profundidades de penetração rasas de apenas algumas centenas de mícrons. Recentemente, demonstramos o primeiro uso de microscopia multifotônica com profundidade de vários milímetros em órgãos fixos de camundongos usando limpeza óptica com a solução de álcool benzo e benzoato de benzoíla. Nossa demonstração inicial, a técnica imaginou a fluorescência intrínseca do tecido.

No entanto, há um interesse crescente no uso de métodos de limpeza óptica com tecidos que expressam proteínas fluorescentes, como GFP. Aqui apresentamos um protocolo para microscopia multifotônica de tecido cerebral limpo com a mesma solução de álcool benzo que preserva a fluorescência da proteína fluorescente amarela expressa pela coxa. Um promotor no cérebro de camundongo A imagem de órgão de camundongo inteiro de alta resolução usando microscopia multifotônica é possível limpando opticamente o órgão antes da imagem sem limpeza. Multifotônico.

A imagem do cérebro é limitada a 300 mícrons abaixo da superfície do tecido devido aos efeitos de dispersão criados pelas diferenças nos índices de refração da água e das proteínas que compõem o tecido cerebral. Para superar essa limitação, o órgão é desidratado e a água é substituída por um fluido que tem um índice de refração semelhante ao das proteínas que compõem o tecido. Esse processo de limpeza óptica ajuda a reduzir bastante a dispersão da luz para oferecer uma melhor imagem mais abaixo da superfície do tecido.

Imagens de Batta et al demonstram como essa técnica pode ser aplicada para visualizar a histologia de diferentes órgãos de camundongos usando fluorescência intrínseca e geração de segundo harmônico. Esta primeira imagem é do testículo do camundongo, tirada 1,4 milímetros abaixo da superfície do tecido. A propriedade de alta resolução da microscopia multifotônica nos permite ampliar e obter uma visão clara dos espermatozoides individuais que se formam nos tubulares seminíferos.

Como visto na extrema direita aqui, mostramos uma imagem do pulmão do camundongo, que também foi tirada 1,4 milímetros abaixo da superfície do tecido. Esta imagem é uma demonstração de imagens multifotônicas de dois canais em que os componentes da elastina são marcados em vermelho enquanto o colágeno é rotulado em verde, o zoom em oli individuais é facilmente distinguível. Finalmente, mostramos imagens de alta resolução das regiões internas do cérebro do camundongo tomando 850 mícrons abaixo da superfície do tecido Ao ampliar o neocórtex e o hipocampo do cérebro, astrócitos individuais e corpos celulares de neurônios podem ser vistos claramente.

No entanto, quando órgãos opticamente limpos que podem conter proteínas fluorescentes, como YFP, o protocolo de limpeza óptica de badra não preserva o sinal fluorescente dessas proteínas fluorescentes. O protocolo apresentado aqui é uma nova maneira de realizar a limpeza óptica de órgãos inteiros e imagens de entorse de camundongo, preservando o sinal fluorescente de YFP e neurônios, desidratando o cérebro usando uma série graduada de etanol e limpando com uma solução de um a dois de benzoato de álcool benzo, também conhecido como BAB, reduz os danos às proteínas fluorescentes e preserva seu sinal fluorescente. Para imagens multifotônicas, os camundongos YFP são primeiro pesados e depois anestesiados com uma injeção intraperitoneal de cetamina xilazina.

Uma placa cirúrgica de anestesia deve ser confirmada antes de prosseguir para a cirurgia. O animal deve ser verificado a cada cinco minutos para ver se reage a um beliscão firme no dedo do pé ou na cauda. Se o animal reagir, é necessária uma dose suplementar de cetamina xilazina.

Uma vez anestesiados, os camundongos ficam aderindo cada membro a um leito cirúrgico usando fita adesiva para que o camundongo fique em decúbito dorsal expondo seu tórax para cirurgia Para começar, é feita uma incisão abaixo do processo xifóide para fazer um corte ao longo da base da caixa torácica usando tesouras e pinças para puxar a pele para trás enquanto o corte está sendo feito, Dois cortes são então feitos de cada lado do esterno do camundongo para criar um retalho de tecido que é mantido longe da cavidade torácica usando um hemostático para deixar o coração exposto. Em seguida, uma agulha de calibre 23 é inserida no ventrículo esquerdo do coração e uma pequena incisão é feita na parede muscular do átrio direito para permitir que o sangue escape. Imediatamente após o corte do átrio direito, uma perfusão com solução salina tamponada com fosfato de quatro graus Celsius é iniciada até que não haja mais sangue drenando do átrio direito.

Durante a perfusão, uma bomba epistolar é usada e ajustada para uma potência de bombeamento que ejeta o fluido de 1,5 a duas polegadas de distância da ponta da agulha. Uma vez que todo o sangue tenha sido drenado, o meio de perfusão é trocado para uma solução de aldeído paraforme a 4% a quatro graus Celsius até que o corpo do camundongo se torne visivelmente rígido e rígido. Após a perfusão, o camundongo é retirado do leito cirúrgico e decapitado para iniciar a excisão do cérebro com pinça e tesoura de íris.

O crânio é removido em pequenas seções, começando na parte de trás do crânio e avançando. Pequenos cortes são feitos a cada dois a quatro milímetros com a tesoura no crânio, enquanto a pinça é usada para puxar cuidadosamente o osso para longe do cérebro em pequenas seções, isso é feito até que toda a superfície superior do cérebro seja exposta. O cérebro é então excisado do crânio usando uma espátula cirúrgica e colocado para tomar um frasco de vidro de aldeído paraforme a 4% para fixar por seis horas.

Embora estejamos nos concentrando principalmente na imagem do cérebro de camundongo expressando YFP para esta demonstração, também estaremos limpando opticamente um camundongo, perna traseira e seccionando um intestino delgado para melhor mostrar as capacidades de limpeza deste procedimento. Após a pós-fixação, o cérebro e outros tecidos são lavados duas vezes em PBS. As amostras de tecido são então desidratadas à temperatura ambiente por uma série de incubações de etanol em concentrações de 50%, 70%, 90% e 100% de etanol.

Cada incubação dura duas horas e depois uma segunda. A incubação de 100% de etanol de 12 horas é realizada para extrair eficientemente a água do tecido fixado. Após a desidratação, a última solução de etanol a 100% é derramada e as amostras de tecido são submersas em uma solução um-para-um de etanol para BAB por duas horas antes de serem imersas em solução de limpeza de BAB a 100%.

Uma vez no bab, o cérebro e outras amostras de tecido se tornarão visivelmente transparentes dentro de quatro a cinco horas. Aqui mostramos um vídeo de lapso de tempo das primeiras seis horas do processo de limpeza óptica. O salto marca o momento em que a solução um-para-um de etanol para BAB foi substituída por solução de 100% BAB.

Ao final de seis horas, todos os órgãos mostram sinais de transparência, por exemplo, o osso da perna traseira do camundongo agora é claramente visível para melhores resultados de limpeza. O cérebro deve ser deixado para limpar por seis dias em temperatura ambiente, protegido da luz forte. Uma vez que o cérebro está limpo e pronto para a imagem, ele é afixado no fundo de sua placa de Petri usando acrílico Sano ou super cola.

Depois que a cola seca, o cérebro é emergido em BAB e a placa de Petri é colocada sob a objetiva para imagem. Para a imagem, usamos um microscópio multifotônico que incorpora um laser de safira de titânio MI ajustável entre um comprimento de onda de excitação de 710 a 990 nanômetros. O comprimento de onda de excitação que usamos para gerar sinais YFP é de 886 nanômetros.

O sinal fluorescente reflexivo é então capturado usando uma objetiva NIK icon five x que permite imagens de grande campo de visão. O sinal fluorescente reflexivo é filtrado usando um filtro passa-banda 5 35 50 e coletado usando uma pasta de alta eficiência quântica. As imagens multiplicadoras dois do OMA Matsu são processadas usando software de imagem de varredura com uma resolução de 2048 por 2048 pixels usando uma taxa de varredura de dois milissegundos por linha para gerar imagens YFP de alta resolução.

Uma vez concluída a imagem, o cérebro é removido da placa P dois e armazenado em BAB e protegido da luz para imagens futuras. As imagens e vídeos representativos mostrados aqui demonstram a capacidade de imagem multifóton de alta resolução possibilitada pela limpeza óptica. A imagem do cérebro inteiro permite que os neurônios marcadores YFP nas diferentes camadas do hipocampo e do neocórtex sejam claramente visíveis a uma profundidade de até dois milímetros abaixo da superfície do tecido.

Aqui mostramos um vídeo de uma pilha de imagens de 1,2 milímetro de entorse de boca inteira, tirada de 0,8 a dois milímetros no cérebro para revelar as diferentes camadas anatômicas do hipocampo. A seguir está uma imagem representativa de uma seção coronal de 1,94 milímetros chamada Bergman, tirada da imagem de dois milímetros de profundidade presa na qual as diferentes camadas do hipocampo foram rotuladas. Ao ampliar o neocórtex, os axônios individuais e os corpos celulares dos neurônios perais da camada cinco do neocórtex são claramente distinguíveis até 1,02 milímetros abaixo da superfície do tecido.

Aqui mostramos uma imagem presa de neurônios da camada cinco tirada entre 700 e 1020 mícrons abaixo da superfície do tecido. A seguir está uma imagem representativa dessa pilha tirada 774 mícrons no cérebro. Usando essa mesma pilha de imagens, uma reconstrução 3D da região do neurônio foi feita usando o software Image J.

A capacidade de alta resolução da microscopia multi-bot também nos permite apresentar imagens de neurônios individuais inteiros. Aqui mostramos uma reconstrução de um neurônio da camada cinco do neocórtex no qual os processos genéticos D são claramente visíveis. Isso conclui nossa apresentação de limpeza óptica, entorse de camundongo inteiro expressando YFP.

A execução dessa técnica é relativamente simples e, como mostramos, pode ser usada para visualizar e visualizar muitas regiões e estruturas diferentes da entorse do camundongo. Obrigado por assistir e boa sorte.