Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

A microscopia de múltiplos fótons de tecidos fixados normalmente é limitada a profundidades de penetração rasas, de apenas algumas centenas de mícrons. Recentemente, demonstramos o primeiro uso da microscopia de múltiplos fótons a profundidades de vários milímetros em órgãos de camundongos fixados, utilizando clareamento óptico com a solução de álcool benzílico e benzoato de benzila. Na nossa demonstração inicial, a técnica imageou a fluorescência intrínseca do tecido.

No entanto, há um interesse crescente no uso de métodos de clareamento óptico com tecidos que expressam proteínas fluorescentes, como a GFP. Aqui apresentamos um protocolo para microscopia multiphoton de tecido cerebral clareado com a mesma solução de álcool benzílico que preserva a fluorescência da proteína fluorescente amarela expressa pelo músculo. Um promotor no cérebro de camundongo permite a obtenção de imagens de órgão inteiro de camundongo em alta resolução usando microscopia multiphoton, o que é possível mediante o clareamento óptico do órgão antes da aquisição de imagens sem clareamento. Multiphoton.

A imagem do cérebro é limitada a 300 mícrons abaixo da superfície do tecido devido aos efeitos de dispersão da luz causados pelas diferenças nos índices de refração da água e das proteínas que compõem o tecido cerebral. Para superar essa limitação, o órgão é desidratado e a água é substituída por um fluido que possui um índice de refração semelhante ao das proteínas que compõem o tecido. Esse processo de clareamento óptico ajuda a reduzir significativamente a dispersão da luz, permitindo uma melhor imagem a maiores profundidades abaixo da superfície do tecido.

As imagens de Batta et al. demonstram como esta técnica pode ser aplicada para visualizar a histologia de diferentes órgãos de camundongos utilizando fluorescência intrínseca e geração de segundo harmônico. Esta primeira imagem é do testículo de camundongo, obtida a 1,4 milímetro abaixo da superfície do tecido. A propriedade de alta resolução da microscopia multiphoton permite-nos ampliar e obter uma visão clara das células espermáticas individuais em formação nos túbulos seminíferos.

Como visto mais à direita aqui, mostramos uma imagem do pulmão de camundongo, também obtida a 1,4 milímetro abaixo da superfície do tecido. Esta imagem demonstra uma aquisição multiphoton de dois canais na qual os componentes de elastina são marcados em vermelho, enquanto o colágeno é marcado em verde, e ao aumentar o zoom, os alvéolos individuais são facilmente distinguíveis. Por fim, mostramos imagens de alta resolução das regiões internas do cérebro de camundongo obtidas a 850 mícrons abaixo da superfície do tecido. Ao aumentar o zoom sobre o neocórtex e o hipocampo do cérebro, astrócitos individuais e corpos celulares neuronais podem ser claramente visualizados.

No entanto, ao se utilizar órgãos opticamente clareados que possam conter proteínas fluorescentes como a YFP, o protocolo de clareamento óptico de Badra não preserva o sinal fluorescente dessas proteínas fluorescentes. O protocolo apresentado aqui é uma nova abordagem para realizar o clareamento óptico e a imagem de órgãos inteiros de camundongos, preservando o sinal fluorescente da YFP e das neurônios, desidratando o cérebro por meio de uma série graduada de etanol e realizando o clareamento com uma solução de um para dois de álcool benzílico e benzoato de benzila, conhecida como BAB, o que tem demonstrado reduzir os danos às proteínas fluorescentes e preservar seu sinal fluorescente. Para a imagem multiphotônica, camundongos YFP são primeiramente pesados e, em seguida, anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina.

Deve-se confirmar um plano cirúrgico de anestesia antes de prosseguir para a cirurgia. O animal deve ser verificado a cada cinco minutos para verificar se reage a um aperto firme no dedo do pé ou na cauda. Se o animal reagir, é necessária uma dose suplementar de ketamina xilazina.

Uma vez anestesiados, os camundongos são mantidos em posição aderindo cada membro a uma mesa cirúrgica usando fita laboratorial, de modo que o camundongo fique em posição supina, expondo o tórax para a cirurgia. Para começar, é feita uma incisão abaixo do processo xifoide, a fim de cortar ao longo da base da caixa torácica usando tesoura e pinça para puxar a pele para trás enquanto o corte é realizado; em seguida, dois cortes são feitos em ambos os lados do esterno do camundongo para criar uma aba de tecido, que é mantida afastada da cavidade torácica usando um hemostato, deixando o coração exposto. Em seguida, uma agulha de 23 graus é inserida no ventrículo esquerdo do coração, e uma pequena incisão é feita na parede muscular do átrio direito para permitir a saída do sangue. Imediatamente após o corte no átrio direito, inicia-se uma perfusão com solução salina tamponada com fosfato a quatro graus Celsius até que não mais sangue drenado do átrio direito.

Durante a perfusão, utiliza-se uma bomba peristáltica ajustada a uma potência de bombeamento que ejete o fluido a uma distância de 1,5 a dois polegados da ponta da agulha. Uma vez que todo o sangue tenha sido drenado, o meio de perfusão é substituído por uma solução de paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius, até que o corpo do camundongo fique notavelmente rígido e duro. Após a perfusão, o camundongo é removido da mesa cirúrgica e decapitado para iniciar a excisão do cérebro utilizando pinças e tesoura de íris.

O crânio é removido em pequenas seções, começando pela parte posterior e avançando para a frente. Pequenos cortes são feitos a cada dois a quatro milímetros com a tesoura sobre o crânio, enquanto a pinça é usada para cuidadosamente puxar o osso longe do cérebro em pequenas seções; esse procedimento é realizado até que toda a superfície superior do cérebro seja exposta. Em seguida, o cérebro é excisado do crânio utilizando uma espátula cirúrgica e colocado em um frasco de vidro contendo paraformaldeído a 4% para fixação durante seis horas.

Embora estejamos focando principalmente na imagem do cérebro de camundongo expressando YFP para esta demonstração, também realizaremos a clareação óptica de um camundongo, de uma pata traseira e de um segmento do intestino delgado para melhor demonstrar as capacidades de clareação deste procedimento. Após a pós-fixação, o cérebro e os demais tecidos são lavados duas vezes em PBS. As amostras de tecido são então desidratadas à temperatura ambiente por meio de uma série de incubações em etanol nas concentrações de 50%, 70%, 90% e 100% de etanol.

Cada incubação dura duas horas e, em seguida, uma segunda incubação com etanol a 100% por 12 horas é realizada para extrair eficientemente a água do tecido fixado. Após a desidratação, a última solução de etanol a 100% é descartada e as amostras de tecido são submersas em uma solução na proporção de um para um de etanol para BAB por duas horas antes de serem imersas na solução clareadora a 100% de BAB.

Uma vez em bab, o cérebro e outras amostras de tecido tornar-se-ão visivelmente transparentes dentro de quatro a cinco horas. Aqui mostramos um vídeo com lapso de tempo das primeiras seis horas do processo de clareamento óptico. A marcação de salto indica o momento em que a solução na proporção um para um de etanol para BAB foi substituída por solução de BAB a 100%.

Após seis horas, todos os órgãos apresentam sinais de transparência; por exemplo, o osso da pata traseira do camundongo agora está claramente visível, o que indica os melhores resultados de clareamento. O cérebro deve permanecer em clareamento por seis dias à temperatura ambiente, protegido da luz intensa. Uma vez que o cérebro esteja transparente e pronto para imageamento, ele é fixado no fundo da sua placa de Petri utilizando acrílico Sano ou cola instantânea.

Após a cola secar, o cérebro é imerso no BAB e a placa de Petri é colocada sob a objetiva para a aquisição de imagens. Para a aquisição, utilizamos um microscópio de múltiplos fótons que incorpora um laser de titânio-safira MI tie, ajustável entre um comprimento de onda de excitação de 710 a 990 nanômetros. O comprimento de onda de excitação utilizado para gerar os sinais de YFP é de 886 nanômetros.

O sinal fluorescente refletido é então capturado usando uma objetiva NIK icon five x, que permite a obtenção de imagens com amplo campo de visão. O sinal fluorescente refletido é filtrado utilizando um filtro passa-banda de 535/50 e coletado com um multiplicador de alta eficiência quântica. As imagens OMA Matsu Multiplier two são processadas usando o software Scan Image, com uma resolução de 2048 por 2048 pixels e uma taxa de varredura de dois milissegundos por linha, para gerar imagens de YFP de alta resolução.

Após a conclusão da aquisição de imagens, o cérebro é removido do prato P dois e armazenado em BAB, protegido da luz, para futuras imagens. As imagens e vídeos representativos mostrados aqui demonstram a capacidade de imagem multiphoton de alta resolução possibilitada pela clareza óptica. A imagem de cérebro inteiro permite que neurônios marcados com YFP nas diferentes camadas do hipocampo e neocórtex sejam claramente visíveis a uma profundidade de até dois milímetros abaixo da superfície do tecido.

Aqui apresentamos um vídeo de uma pilha de imagens de 1,2 milímetro de um espécime completo da boca, obtida entre 0,8 e dois milímetros dentro do cérebro, para revelar as diferentes camadas anatômicas do hipocampo. A seguir, há uma imagem representativa de uma seção coronal a 1,94 milímetro chamada de Bergman, obtida a partir da pilha de imagens a dois milímetros de profundidade, na qual as diferentes camadas do hipocampo foram identificadas. Ao ampliar o neocórtex, os axônios individuais e os corpos celulares neuronais dos neurônios piramidais da camada cinco do neocórtex são claramente distinguíveis até 1,02 milímetro abaixo da superfície do tecido.

Aqui apresentamos uma pilha de imagens de neurônios da camada cinco obtidas entre 700 e 1020 mícrons abaixo da superfície do tecido. A seguir, há uma imagem representativa dessa pilha, capturada a 774 mícrons de profundidade no cérebro. Utilizando essa mesma pilha de imagens, foi realizada uma reconstrução tridimensional da região neuronal com o software Image J.

A capacidade de alta resolução da microscopia multibot também nos permite apresentar imagens de neurônios individuais inteiros. Aqui mostramos uma reconstrução de um neurônio da camada cinco da neocórtex no qual os processos dendríticos são claramente visíveis. Isso conclui nossa apresentação da clareza óptica, espécime inteiro de camundongo expressando YFP.

Realizar esta técnica é relativamente simples e, como demonstramos, pode ser usada para visualizar e imaginar diversas regiões e estruturas da distensão do camundongo. Obrigado por assistir e boa sorte.