Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra
5 de junho de 2012
Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.
O objetivo deste experimento é avaliar a eficácia de antibióticos contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, em condições representativas de infecções crônicas no pulmão de pacientes com fibrose cística, utilizando um meio artificial de escarro definido. Os biofilmes bacterianos são cultivados em placas de microtitulação de 24 poços.
Os biofilmes são então expostos a antibióticos. Em seguida, os cultivos tratados com antibióticos são rompidos usando celulase e incubados com um corante metabólico srin, que é reduzido de azul para rosa por células viáveis. Ao medir a absorbância das cavidades, pode-se determinar a concentração inibitória mínima de células do biofilme, denominada B-S-M-I-C, para quantificar a suscetibilidade aos antibióticos em condições próximas às fisiológicas.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a determinação das concentrações inibitórias mínimas com base em culturas planctônicas, é que as bactérias são cultivadas em um meio especializado contendo todos os componentes do escarro, promovendo assim a formação de biofilmes. Esses biofilmes são muito mais resistentes a antibióticos. Para preparar o meio, prepare primeiro dois frascos contendo 250 mililitros de água estéril no primeiro frasco.
Adicione gradualmente o agente agitador e, em seguida, adicione quatro gramas de DNA de esperma de peixe a 250 mililitros de água estéril. Agite a solução à temperatura ambiente e deixe o DNA dissolver no segundo frasco. Adicione gradualmente cinco gramas de mucina tipo dois proveniente do estômago suíno e agite.
Uma vez que as soluções de DNA e mucina estejam prontas, dissolva os aminoácidos em 100 mililitros de água estéril, com exceção da L-tirosina e da L-cisteína, que devem ser dissolvidas em 25 mililitros de água ou em 25 mililitros de hidróxido de potássio 0,5 molar, respectivamente. Em seguida, dissolva 5,9 miligramas de DTPA, cinco gramas de cloreto de sódio e 2,2 gramas de cloreto de potássio em 100 mililitros de água. Combine todas as soluções diferentes em um frasco de um litro, adicione cinco mililitros de emulsão de gema de ovo e complete a mistura até 850 mililitros com água.
Usando triss um molar, ajuste o pH para 6,9 e complete o volume final até um litro com água. Para esterilizar o meio, filtre-o utilizando uma bomba de vácuo marca ME dois, com diafragma duplo, e um sistema de filtração Millipore Stereo Top com pescoço de 45 milímetros e tamanho de poro de 0,2 mícron. O processo de filtração pode ser realizado ao longo de dois dias. O meio ASM pode ser armazenado a quatro graus Celsius por até um mês.
Inicie diluindo culturas de pseudomona arosa mantidas durante a noite em meio LB para obter uma DO de 0,05. Em seguida, dilua as bactérias em uma proporção de 1 para 100 em uma placa de meio SM, adicionando 1,8 mililitro por poço de cultura bacteriana diluída em 21 poços de uma placa de cultura tecidual de 24 poços; alíquotas do mesmo volume de meio SM nos três poços restantes, que servirão como controles negativos em branco. Feche a placa de 24 poços com biofilme e, para permitir a formação de biofilmes, coloque-a em condições de microaerofilia, que podem ser obtidas utilizando pacotes geradores de gás Campy Gen em frascos anaeróbicos grandes.
Incube a cultura em um agitador ajustado a 75 RPM por três dias a 37 graus Celsius. Após três dias, os biofilmes aparecerão como uma massa gelatinosa contendo células bacterianas e não poderão ser disruptados por pipetagem. Uma vez formados os biofilmes, adicione 200 microlitros por poço de antibiótico em concentrações diluídas em série. Certifique-se de preparar pelo menos quatro réplicas para cada concentração do fármaco a ser testada e deixe quatro poços contendo biofilmes sem tratamento, para que possam ser usados como controles negativos.
Em seguida, incubar as placas previamente por mais 24 horas após a incubação com antibióticos. Utilizar 100 microlitros por poço de celulase diluída a 100 miligramas por mililitro em tampão citrato para romper os biofilmes, incubando as placas em agitador ajustado a 150 RPM sob condições aeróbicas a 37 graus Celsius por uma hora. Após esta incubação, pode-se utilizar pipetagem manual para desagregar ainda mais os biofilmes, caso sejam visíveis agregados de células no meio.
Em seguida, adicione 100 microlitros de rezina por poço para quantificar a viabilidade das células liberadas dos biofilmes e incube as células por uma a duas horas. A 37 graus Celsius, apenas as células viáveis são capazes de metabolizar o corante azul zarin em sua forma fluorescente rosa. Após a incubação, transfira as amostras para uma placa de 96 poços e meça a fluorescência dos poços utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 590 nanômetros.
Para quantificar a viabilidade bacteriana e a suscetibilidade a medicamentos, primeiro subtraia a fluorescência de fundo do controle em branco dos demais poços. Em seguida, calcule a porcentagem de inibição dividindo a fluorescência média de cada concentração pela fluorescência média dos controles não tratados e multiplicando por 100. O B-S-M-Y-C é definido como a concentração do antibiótico que causa 90% de inibição da atividade metabólica, conforme mostrado nestas micrografias eletrônicas: células cultivadas em biofilmes diferem consideravelmente de bactérias cultivadas em culturas planctônicas.
Em particular, grandes quantidades de matriz extracelular, mostradas em amarelo, envolvem as células no biofilme em verde, mas não nas colônias planctônicas. Além disso, as bactérias em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos neste experimento. A concentração inibitória mínima de tobramicina para cultura planctônica de pseudomonas aeruginosa em azul foi determinada como sendo aproximadamente quatro microgramas por mililitro.
Em contraste, conforme mostrado em vermelho, 100% das bactérias em biofilmes sobreviveram até 512 microgramas por mililitro de antibiótico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar bactérias em um meio artificial definido de expectoração. Você também deverá ser capaz de realizar um teste de suscetibilidade a antibióticos para determinar a concentração inibitória mínima necessária para inibir o crescimento bacteriano em um ambiente mais realista do pulmão de pacientes com fibrose cística.
Visão Geral
Este estudo investiga a suscetibilidade a antibióticos de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa utilizando um meio artificial de expectoração que imita as condições presentes no pulmão de pacientes com fibrose cística. A pesquisa destaca as diferenças na resistência a antibióticos entre culturas em biofilme e culturas planctônicas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Resistência antimicrobiana
- Pesquisa em biofilmes
Contexto
- Os métodos atuais para testar a suscetibilidade a antibióticos concentram-se em bactérias planctônicas.
- Pseudomonas aeruginosa é um patógeno comum em pacientes com fibrose cística.
- Sabe-se que biofilmes apresentam maior resistência aos antibióticos.
- O meio de expectoração artificial pode simular melhor o ambiente pulmonar da fibrose cística.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a eficácia de antibióticos contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa.
- Utilizar um meio artificial definido de escarro para condições de teste mais precisas.
- Comparar a concentração inibitória mínima (MIC) de antibióticos em culturas de biofilme e planctônicas.
Métodos Utilizados
- Os biofilmes foram cultivados em placas de microtitulação de 24 poços sob condições aeróbicas e microaerofílicas.
- Antibióticos foram aplicados aos biofilmes, seguidos pela disruptura utilizando celulase.
- A viabilidade celular foi avaliada usando um corante metabólico que indica células vivas.
- Medições de fluorescência foram realizadas para determinar a suscetibilidade aos antibióticos.
Resultados Principais
- Os biofilmes apresentaram resistência significativamente maior aos antibióticos em comparação com culturas planctônicas.
- A concentração inibitória mínima para tobramicina foi muito mais alta nos biofilmes.
- Observou-se a presença de matriz extracelular nos biofilmes, o que contribui para a resistência.
- O estudo fornece um método confiável para testar a eficácia de antibióticos em condições de biofilme.
Conclusões
- O meio de escarro artificial é eficaz para estudar a suscetibilidade de biofilmes a antibióticos.
- Os biofilmes representam um desafio único no tratamento de infecções crônicas na fibrose cística.
- A pesquisa futura deve focar na superação da resistência a antibióticos associada aos biofilmes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os testes atuais de suscetibilidade antimicrobiana muitas vezes falham em prever os resultados clínicos na fibrose cística devido a discrepâncias entre ensaios planctônicos padrão e as condições de infecções pulmonares crônicas, que envolvem biofilmes e microaerofilicidade. Essa lacuna aumenta o risco de avançar com antibióticos ineficazes no desenvolvimento pré-clínico, levando a falhas dispendiosas em estágios avançados. Ao incorporar meio de expectoração artificial e modelos de biofilme sob níveis fisiologicamente relevantes de oxigênio, as equipes de P&D podem aprimorar a validação de alvos e reduzir os riscos na seleção de fármacos promissores por meio de triagem de eficácia mais preditiva.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a eficácia de antibióticos contra P. aeruginosa em biofilmes sob condições que simulam o pulmão de pacientes com fibrose cística, apoiando a validação de alvos em modelos de infecção persistente.
- Valor Operacional: Oferece um formato reprodutível em microplacas para avaliação de alta produtividade da concentração inibitória mínima de células sésseis (SMIC) em múltiplos isolados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas em fluorescência para medir a desagregação de biofilmes e a inibição metabólica, permitindo análise de resposta à dose em condições próximas às fisiológicas.
- Valor Operacional: Utiliza reagentes padronizados (resazurina, celulase) e meio artificial de escarro definido para garantir a consistência do ensaio e reduzir a variabilidade no perfil de suscetibilidade a antibióticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Detecta o aumento da resistência a antibióticos em biofilmes—com SMIC até >128 vezes maior para tobramicina em condições microaerofílicas—destacando as limitações dos limiares de MIC planctônicos.
- Valor Operacional: Apoia a seleção de modelos pré-clínicos ao identificar compostos com atividade mantida contra patógenos incorporados em biofilmes, orientando decisões de avançar ou não em programas anti-infecciosos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de biofilme ASM insere-se no continuum de descoberta de agentes antibacterianos, especialmente após a identificação inicial de hits e antes da otimização de compostos líderes, onde a compreensão do engajamento do alvo em ambientes fisiológicos complexos orienta a priorização.
- Biologia da Descoberta: Testa a hipótese de que a eficácia dos antibióticos é significativamente reduzida em estados de biofilme e microaerofílicos, esclarecendo a vulnerabilidade do alvo em nichos de infecção crônica.
- Triagem: Fornece dados SMIC quantitativos e reprodutíveis, permitindo a comparação da potência de antibióticos entre isolados e condições, apoiando a padronização de ensaios.
- Análises: Gera curvas de inibição e valores de SMIC que permitem comparação entre condições e avaliação estatística de alterações na suscetibilidade a antibióticos.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à fisiopatologia relevante para fibrose cística, modelando o crescimento de biofilmes e a tensão de oxigênio observadas no escarro de pacientes.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma pronta para uso na avaliação de múltiplas classes de antibióticos contra patógenos formadores de biofilme, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança preditiva ao revelar mecanismos de resistência dependentes de condições que não são detectados em testes-padrão de suscetibilidade.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade por meio da composição definida do meio, do tempo padronizado de formação de biofilme e da leitura automatizada de fluorescência.
- Valor Estratégico: Reduz a incerteza na desconsideração biológica em pipelines de agentes anti-infecciosos ao identificar compostos com alta probabilidade de falhar em modelos de infecção contendo biofilme.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na eficácia em modelos de infecção fisiologicamente relevantes, melhorando a alocação de capital.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microbiologia, cultivo de biofilmes e técnicas de cultivo anaeróbico/microaerofílico.
- Depende do acesso a equipamentos de fluorescência microfluídicos ou leitores de placas com capacidade de detecção de resazurina (Exc/Ems ~540/590 nm).
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de disruptura de biofilmes (por exemplo, tratamento com celulase) para garantir leituras consistentes de viabilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o modelo a outros patógenos ou classes de antibióticos além da tobramicina e P. aeruginosa.
- As limitações práticas incluem o período de 3 dias para formação do biofilme e a necessidade de controle rigoroso de oxigênio para manter condições microaerofílicas, o que pode aumentar a duração e a complexidade do ensaio.
