Name: Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra Pseudomonas aeruginosa Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a testar a eficácia de antibióticos contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa usando meio de escarro artificial. Este método simula condições pulmonares de fibrose cística para avaliar resistência antimicrobiana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos o apoio do Reino Unido National Institute for Health Research, o Dr. Hadwen confiança para Pesquisa Humana, o financiamento do Reino Unido caridade líder investigação médica exclusivamente técnicas de pesquisa sem animais para substituir a experimentação animal, eo Wellcome Trust (Grant 089.215). Reconhecemos também a Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educacional irrestrita de subvenção).

<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li>
<li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration%3A+lack+of+association+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li>
<li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcolony+formation%3A+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li>
<li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+JG024%2C+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301(2010).</li>
<li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526(2011).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li>
<li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li>
<li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li>
<li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic%2C+anaerobic%2C+and+biofilm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li>
<li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li>
<li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li>
<li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li>
<li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li>
<li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li>
<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
<li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo foi utilizado um novo modelo in vitro com base em ASM para replicar P. aeruginosa condições de biofilme dentro do pulmão 4 CF. O modelo foi modificado com sucesso em pequena escala, o teste de alto rendimento de agentes antimicrobianos. Os passos críticos deste ensaio são: <ol><li> Preparação consistente dos meios de comunicação ASM e esterilidade manutenção. Temos dedicado longas horas para optimizar a forma em que cada componente é adicionado para obter resultados reprodutíveis de cada vez. A filtração do ASM é lento, mas é preferível a autoclavagem, o que pode danificar o componente de mucina. Isso não se recomenda a adição de antibióticos, como sugerido por outros 11 porque este pode impor consideráveis ​​pressões selectivas, mutações de unidade, induzem a lise profago 16 e alterar significativamente a expressão de vários genes bacterianos. </li><li> O ensaio deve ser optimizada de acordo com o volume of ASM utilizado. Velocidades de agitação são aumentadas para volumes menores e menor biofilme ciclo de vida é observado. </li></ol> Uma aplicação óbvia do modelo de biofilme em pequena escala ASM é a determinação mais realista do biofilme susceptibilidades antimicrobianas (BSMIC 90). Nichos anaeróbios e microaerófilos estão presentes no pulmão CF e há evidências de que o oxigénio é limitada no fundo de biofilmes madura 2, 17. Aqui demonstramos que 10/14 P. clínica aeruginosa de paciente com FC apresentam um escarro (4 - ≥ vezes 128) considerável diminuição na sensibilidade à tobramicina em condições de microaerofilia em ASM. Os resultados deste estudo sugerem que os antibióticos, tais como a tobramicina, pode ser menos eficaz contra P. infecções aeruginosa no pulmão CF do que os indicados por métodos de ensaio convencionais susceptibilidade. Estes resultados refletem estudos anteriores sobre a susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes 10. Pequeno-escala ensaios ASM, assim, proporcionar uma plataforma de transferência simples de alta para gerar dados significativos de susceptibilidade aos antimicrobianos para informar melhor as decisões terapêuticas. O ensaio é limitada da mesma maneira como os testes de susceptibilidade aos antibióticos convencionais em que as colónias únicas são escolhidas para o rastreio que não pode ser representativa de toda a população. No entanto, acreditamos que uma abordagem (i) utilizando superfície não-crescimento do biofilme em anexo e (ii) aplicáveis ​​a condições microaerofílicas, representa uma alternativa clara e uma melhoria potencial aos métodos existentes. Concluímos que este ensaio é de um modelo adequado para estudar p biofilme populações aeruginosa. Mais testes em ambientes clínicos seria verificar se as suscetibilidades aos antibióticos baseado em biofilme cresceu P. aeruginosa pode levar a diferentes opções de antibióticos com potencial melhora nos resultados microbiológicos e clínicos. Estudos similares com modelos clássicos de biofilme demonstraram que valores BSMIC levarpara diferentes recomendações para o tratamento antibiótico 5,17. Além dos testes para a eficácia dos agentes anti-bacterianos, o sistema ASM representa uma alternativa barata, simples e reprodutível de modelos animais para estudos como os que visam a compreensão da diversificação de P. populações aeruginosa. Observamos grande heterogeneidade em populações naturais de P. aeruginosa recuperado de paciente com FC escarros 18, 19. Diversificação fenotípica e genotípica semelhante pode ser observada durante o crescimento em ASM 4 (e os nossos dados não publicados), tornando-se uma atraente modelo in vitro das condições pulmonares FC. A relativa simplicidade do modelo ASM torna mais fácil para conceber experiências de longo prazo de adaptação como objectivo, por exemplo, no controlo dos efeitos dos antibióticos ou outras tensões sobre P. divergência população aeruginosa. Além disso, outros agentes patogénicos bacterianos podem ser cultivadas emASM. Por exemplo, Fouhy et al. Usaram ASM 2007 para estudar a formação de biofilme por S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNA de esperma de peixe </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucina de porco estômago, do tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L mono-hidrato de (+)-Asparagina </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L de ácido (+)-aspártico </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-ácido glutâmico </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Histidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L monocloridrato (+)-lisina </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-Prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-Treonina </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Triptofano </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Ácido dietileno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> A gema de ovo emulsão </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 bomba de vácuo do diafragma </td><td> VACUUBRAND </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Filtros Steritop (tamanho de poro: 0,22, tamanho do pescoço: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani médio </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços de microtítulo </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> De 24 poços de cultura de tecidos tratados placas </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> Geração CampyGen pacotes de gás </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Câmara de microaerofilia </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramicina sulfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Celulase, a partir de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> 2 0 Citrate.H </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega leitor de microplacas </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

uso de meio de escarro artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; em condições mais relevantes para o pulmão fibrose cística

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Há uma crescente preocupação com a relevância do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos in vitro quando aplicado a amostras de P. aeruginosa de fibrose cística (FC) dos pacientes. Os métodos existentes dependem única ou a poucas isolados cresceram em aerobiose e planktonically. Predeterminados cut-off são usados ​​para definir se as bactérias são sensíveis ou resistentes a qualquer antibiótico administrado 1. No entanto, durante infecções pulmonares crônicas na CF, P. populações aeruginosa existir em biofilmes e há evidências de que o ambiente é em grande parte microaerofílica 2. A diferença gritante em condições entre bactérias no pulmão e os que durante os testes de diagnóstico foi posta em causa a relevância, fiabilidade e até mesmo de estes 3 ​​testes. Médio de expectoração artificial (ASM) é um meio de cultura contendo os componentes da CF expectoração paciente, incluindo aminoácidos, a mucina e DNA livre. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; crescimento no crescimento imita ASM durante infecções CF, com a formação de estruturas auto-agregação de biofilme e divergência população 4,5,6. O objetivo deste estudo foi desenvolver um teste de microtitulação placa para estudar a susceptibilidade antimicrobiana de P. aeruginosa com base no crescimento em ASM, que é aplicável a ambas as condições microaerofílicas e aeróbicas. Um ensaio de ASM foi desenvolvido em um formato de placa de microtitulação. P. biofilmes aeruginosa foram autorizados a desenvolver durante 3 dias antes da incubação com agentes antimicrobianos em diferentes concentrações de 24 horas. Após interrupção do biofilme, a viabilidade das células foi medida por coloração com resazurina. Este ensaio foi utilizado para determinar a concentração mínima inibitória séssil célula (SMIC) de tobramicina para 15 p diferente aeruginosa em condições aeróbias e microaerófilos e valores SMIC foram comparados com aqueles obtidos com o crescimento em caldo padrão. Embora se verifiquealguma evidência de aumento de valores de CIM para isolados cultivados em ASM, quando comparados a suas contrapartes planctônicas, as maiores diferenças foram encontradas com bactérias testadas em condições de microaerofilia, que mostraram uma resistência muito aumentada até um&gt; 128 vezes, para tobramicina no sistema ASM quando em comparação com os ensaios realizados em condições aeróbias. A falta de associação entre os métodos atuais de testes de suscetibilidade e evolução clínica tem questionado a validade dos métodos atuais 3. Vários modelos in vitro têm sido utilizados previamente para estudar p biofilmes aeruginosa 7, 8. No entanto, estes métodos dependem biofilmes de superfície em anexo, enquanto que os biofilmes ASM assemelham aos observados no pulmão CF 9. Além disso, a concentração de oxigénio reduzido no muco foi mostrado para alterar o comportamento de P. aeruginosa 2 e afetar a susceptibilidade a antibióticos 10. Portanto using ASM em condições de microaerofilia pode proporcionar um ambiente mais realista para se estudar a susceptibilidade antimicrobiana.

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

Há uma preocupação crescente sobre a relevância dos testes de suscetibilidade antimicrobiana in vitro quando aplicados a isolados de P. aeruginosa de fibrose cística...

O objetivo deste experimento é avaliar a eficácia de antibióticos contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, em condições representativas de infecções crônicas no pulmão de pacientes com fibrose cística, utilizando um meio artificial de escarro definido. Os biofilmes bacterianos são cultivados em placas de microtitulação de 24 poços.Os biofilmes são então expostos a antibióticos. Em seguida, os cultivos tratados com antibióticos são rompidos usando celulase e incubados com um corante metabólico srin, que é reduzido de azul para rosa por células viáveis. Ao medir a absorbância das cavidades, pode-se determinar a concentração inibitória mínima de células do biofilme, denominada B-S-M-I-C, para quantificar a suscetibilidade aos antibióticos em condições próximas às fisiológicas.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a determinação das concentrações inibitórias mínimas com base em culturas planctônicas, é que as bactérias são cultivadas em um meio especializado contendo todos os componentes do escarro, promovendo assim a formação de biofilmes. Esses biofilmes são muito mais resistentes a antibióticos. Para preparar o meio, prepare primeiro dois frascos contendo 250 mililitros de água estéril no primeiro frasco.Adicione gradualmente o agente agitador e, em seguida, adicione quatro gramas de DNA de esperma de peixe a 250 mililitros de água estéril. Agite a solução à temperatura ambiente e deixe o DNA dissolver no segundo frasco. Adicione gradualmente cinco gramas de mucina tipo dois proveniente do estômago suíno e agite.Uma vez que as soluções de DNA e mucina estejam prontas, dissolva os aminoácidos em 100 mililitros de água estéril, com exceção da L-tirosina e da L-cisteína, que devem ser dissolvidas em 25 mililitros de água ou em 25 mililitros de hidróxido de potássio 0,5 molar, respectivamente. Em seguida, dissolva 5,9 miligramas de DTPA, cinco gramas de cloreto de sódio e 2,2 gramas de cloreto de potássio em 100 mililitros de água. Combine todas as soluções diferentes em um frasco de um litro, adicione cinco mililitros de emulsão de gema de ovo e complete a mistura até 850 mililitros com água.Usando triss um molar, ajuste o pH para 6,9 e complete o volume final até um litro com água. Para esterilizar o meio, filtre-o utilizando uma bomba de vácuo marca ME dois, com diafragma duplo, e um sistema de filtração Millipore Stereo Top com pescoço de 45 milímetros e tamanho de poro de 0,2 mícron. O processo de filtração pode ser realizado ao longo de dois dias. O meio ASM pode ser armazenado a quatro graus Celsius por até um mês.Inicie diluindo culturas de pseudomona arosa mantidas durante a noite em meio LB para obter uma DO de 0,05. Em seguida, dilua as bactérias em uma proporção de 1 para 100 em uma placa de meio SM, adicionando 1,8 mililitro por poço de cultura bacteriana diluída em 21 poços de uma placa de cultura tecidual de 24 poços; alíquotas do mesmo volume de meio SM nos três poços restantes, que servirão como controles negativos em branco. Feche a placa de 24 poços com biofilme e, para permitir a formação de biofilmes, coloque-a em condições de microaerofilia, que podem ser obtidas utilizando pacotes geradores de gás Campy Gen em frascos anaeróbicos grandes.Incube a cultura em um agitador ajustado a 75 RPM por três dias a 37 graus Celsius. Após três dias, os biofilmes aparecerão como uma massa gelatinosa contendo células bacterianas e não poderão ser disruptados por pipetagem. Uma vez formados os biofilmes, adicione 200 microlitros por poço de antibiótico em concentrações diluídas em série. Certifique-se de preparar pelo menos quatro réplicas para cada concentração do fármaco a ser testada e deixe quatro poços contendo biofilmes sem tratamento, para que possam ser usados como controles negativos.Em seguida, incubar as placas previamente por mais 24 horas após a incubação com antibióticos. Utilizar 100 microlitros por poço de celulase diluída a 100 miligramas por mililitro em tampão citrato para romper os biofilmes, incubando as placas em agitador ajustado a 150 RPM sob condições aeróbicas a 37 graus Celsius por uma hora. Após esta incubação, pode-se utilizar pipetagem manual para desagregar ainda mais os biofilmes, caso sejam visíveis agregados de células no meio.Em seguida, adicione 100 microlitros de rezina por poço para quantificar a viabilidade das células liberadas dos biofilmes e incube as células por uma a duas horas. A 37 graus Celsius, apenas as células viáveis são capazes de metabolizar o corante azul zarin em sua forma fluorescente rosa. Após a incubação, transfira as amostras para uma placa de 96 poços e meça a fluorescência dos poços utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 590 nanômetros.Para quantificar a viabilidade bacteriana e a suscetibilidade a medicamentos, primeiro subtraia a fluorescência de fundo do controle em branco dos demais poços. Em seguida, calcule a porcentagem de inibição dividindo a fluorescência média de cada concentração pela fluorescência média dos controles não tratados e multiplicando por 100. O B-S-M-Y-C é definido como a concentração do antibiótico que causa 90% de inibição da atividade metabólica, conforme mostrado nestas micrografias eletrônicas: células cultivadas em biofilmes diferem consideravelmente de bactérias cultivadas em culturas planctônicas.Em particular, grandes quantidades de matriz extracelular, mostradas em amarelo, envolvem as células no biofilme em verde, mas não nas colônias planctônicas. Além disso, as bactérias em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos neste experimento. A concentração inibitória mínima de tobramicina para cultura planctônica de pseudomonas aeruginosa em azul foi determinada como sendo aproximadamente quatro microgramas por mililitro.Em contraste, conforme mostrado em vermelho, 100% das bactérias em biofilmes sobreviveram até 512 microgramas por mililitro de antibiótico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar bactérias em um meio artificial definido de expectoração. Você também deverá ser capaz de realizar um teste de suscetibilidade a antibióticos para determinar a concentração inibitória mínima necessária para inibir o crescimento bacteriano em um ambiente mais realista do pulmão de pacientes com fibrose cística.

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Vieira, J., et al. Desenho e desenvolvimento de um modelo para estudar o efeito do oxigênio suplementar no microbioma das vias aéreas da fibrose cística.  J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a preparação de um meio de escarro artificial que imita a viscosidade, a composição de nutrientes e o pH do escarro pulmonar com fibrose cística. O meio resultante fornece uma plataforma fisiologicamente relevante para estudos ex vivo.

Preparação de Meio de Escarro Artificial para Emular Escarro de Pulmão com Fibrose Cística Ex Vivo

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas.

O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Este protocolo fornece métodos para visualização de células bacterianas e polissacarídeos do lócus de síntese de polissacarídeos (Psl) no escarro de pacientes com fibrose cística.

Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística

Este fluxo de trabalho pode ser usado para realizar testes de suscetibilidade a antibióticos usando um modelo ex vivo estabelecido de biofilme bacteriano nos pulmões de indivíduos com fibrose cística. O uso deste modelo poderia aumentar a validade clínica dos ensaios de IMC (concentração mínima de erradicação de biofilmes).

Teste de Eficácia de Antibióticos em um Modelo Ex vivo de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms no Pulmão da Fibrose Cística

O meio de escarro de fibrose cística sintética (SCFM2) pode ser utilizado em combinação com microscopia de varredura a laser confocal e classificação celular ativada por fluorescência para observar agregados bacterianos em alta resolução. Este artigo detalha métodos para avaliar populações agregadas durante o tratamento antimicrobiano como uma plataforma para estudos futuros.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

O objetivo deste protocolo é desenvolver um sistema modelo para o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas da fibrose cística.  O meio de escarro artificial emula a composição da escarro, e as condições de cultura hiperóxica modelam os efeitos do oxigênio suplementar nas comunidades microbianas pulmonares.

Projeto e Desenvolvimento de um Modelo para Estudar o Efeito do Oxigênio Suplementar no Microbioma da Fibrose Cística

Este protocolo descreve um modelo de biofilme polimicrobiano de quatro espécies relevante para o pulmão de fibrose cística (FC) que pode ser usado para explorar o impacto das interações bacterianas entre espécies.

Cultivo de um biofilme polimicrobiano relevante para fibrose cística para sondar fenótipos da comunidade

Essa metodologia permite o estabelecimento de um modelo de biofilme polimicrobiano na fibrose cística para testes de sensibilidade antimicrobiana em pesquisa e laboratórios clínicos. Este modelo fornece resultados precisos e confiáveis em uma variedade de saídas.

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

Este estudo descreve uma estrutura para o desenvolvimento de um modelo de biofilme polimicrobiano agregado e otimização de um protocolo de extração de RNA para avaliar a expressão gênica de Pseudomonas aeruginosa refletindo o ambiente pulmonar de fibrose cística. As aplicações incluem a avaliação dos efeitos antimicrobianos e o estudo de alternativas antibióticas em condições relevantes para a fibrose cística.

Modelo de biofilme agregado de fibrose cística para estudar a expressão gênica relevante para infecção

Aprenda a testar a eficácia de antibióticos contra biofilmes de Pseudomonas aeruginosa usando meio de escarro artificial. Este método simula condições pulmonares de fibrose cística para avaliar resistência antimicrobiana.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra Pseudomonas aeruginosa Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística (Vídeo) | JoVE Journal

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra

Explorar mais vídeos