Name: Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a registrar respostas induzidas por odorantes em neurônios receptores olfativos de camundongos utilizando a técnica de pipeta de sucção. Este método permite capturar correntes de receptor e potenciais de ação simultaneamente.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH DC009613, o Programa de Ciências Humanas Fronteiras e um Morley Cuidados Fellowship (a JR).

1. A configuração de gravação A câmara de gravação é montada num microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U com óptica de contraste de fase, que é montado em uma mesa de ar e electricamente blindado utilizando uma gaiola de Faraday. A câmara de Plexiglass gravação é composto por duas secções parcialmente separados por uma barreira e coladas sobre uma lâmina de vidro silanizado. Uma secção da câmara é usado para resolver as células, enquanto o outro é usado para o estímulo-exposição, durante a gravação de minimizar a exposição do prematuro resolvido, mas ainda não utilizadas células de odorante. A configuração de gravação é composto por uma pipeta de aspiração (ver abaixo) montado num suporte de pipeta sedimentadas e um eléctrodo de terra. A pipeta de sucção está posicionada usando um micromanipulador. Soluções de estímulo são aplicadas usando um triplo-barril tubo quadrado de vidro, com cada tubo quadrado de 0,7 mm x 0,7 mm. O vidro triplo tambor foi ligado a um sistema de perfusão rápida motorizada passo montado num manipulador (Sutter SF-77B, Warner Instruments) e entrou na câmara de registo com um ângulo de 45 °. A extremidade do cano de vidro triplo foi biselado com um ângulo de 45 °, novamente de tal forma que a face final (abertura) do vidro triplo barril era vertical para permitir o posicionamento final da pipeta. O eléctrodo da pipeta de aspiração cheia com solução de Ringer de mamífero padrão e do eléctrodo de terra estão ligados ao andar de entrada GΩ 1 de um amplificador de patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) no modo de fixação de tensão. O sinal analógico do amplificador (de baixa passagem filtrada a 5 kHz) é mostrado em um osciloscópio digital para controlar o sinal em tempo real e também ligado a um 8 pólos do filtro de Bessel (Krohn-Hite), onde o sinal é filtrado passa baixo a 50 Hz. Ambos os sinais de baixa passagem (filtrado a 5 kHz e 50 Hz) são transmitidos a um conversor A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401), que está ligado a um computador de aquisição de dados. Os dados são gravados usando Sinal 3 ACQuisition software (Cambridge Electronic Design) a uma frequência de amostragem de 10 kHz. O sinal é registado nas duas diferentes larguras de banda para gravar primeiro o receptor actual, juntamente com os potenciais de acção sobrepostas e em seguida o receptor actual sozinho (ver Fig. 2.). O sistema de perfusão é usada para comutar rapidamente entre solução de Ringer (controle) e estímulos olfativos ou qualquer solução de composição desejada e é controlado por um PC e software de sinal 3. As soluções estão contidos em seringas de 60 ml e a taxa de fluxo é controlado pelo médico de grau de regulação de caudal intravenosos. Tipicamente, a taxa de fluxo é definida como 1 ml / min. A sucção na pipeta de gravação é controlada da seguinte maneira: A porta lateral do suporte da pipeta está ligado a uma linha de óleo, o qual por sua vez está ligado a um reservatório de óleo de altura ajustável. Elevando ou baixando o reservatório assegura que a pressão e, portanto, o fluxo de pipeta Ringer através da ponta do pipette é mínima e ligeiramente positivo. Sucção adicional ou a pressão pode ser aplicada por meio de um tubo ligado ao espaço aéreo de o reservatório, com um bocal na outra extremidade para sugar o corpo celular de um ORN isolado dentro da ponta da pipeta a gravação. Os experimentos são realizados a 37 ° C, a fim de simular de perto o estado nativo fisiológico da célula. A temperatura é controlada por passagem das soluções através de uma unidade de aquecimento feito por medida, que consiste em resistências de cerâmica através dos quais os tubos de aço inoxidável, contendo as soluções são passados ​​10. A temperatura é monitorizada utilizando um termómetro de termopar (Fluke). 2. Soluções Solução de Ringer de mamífero de (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 de EDTA, 10 mM de HEPES, 10 glucose. O pH foi ajustado para 7,5 com NaOH. A 10% de solução de Ringer diluída foi usado para medir a corrente de junção. Odorant soluções: acetofenona e eugenol foram preparados diariamente em solução de Ringer a partir de 20 mM stocks em DMSO. 3. Fazendo Eletrodos <ol><li> Coloque um vidro de borosilicato unfilamented capilar em um P-97 Sutter extrator micropipeta e puxe uma micropipeta com uma vela longa. </li><li> Transfira a pipeta a um detentor micropipeta feito por medida montado num microscópio Nikon Eclipse E200, que é, por sua vez equipado com um retículo na ocular e uma faca de diamante montado móvel no palco. </li><li> Observar a ponta da pipeta com a objectiva de 20x e utilizando o retículo de guia; escriba suavemente a pipeta com um ângulo de 90 ° com a faca de diamante feito à medida em que a pipeta é de 10 um de largura (diâmetro externo). </li><li> Mover a faca de diamante mais em direcção à ponta e gradualmente aplicar pressão sobre a ponta da faca de diamante. A ponta de pipeta deve quebrar limpa no ponto em que foi descrito. </li></ol> Alternativamente os passos 3.1 a3,4 podem ser combinados e pode ser puxada para pipetas com as dimensões desejadas directamente sem ter de cortar a ponta da pipeta, embora possa revelar difícil de puxar de modo fiável com pipetas de tal diâmetro da ponta de uma grande e arestas cortadas de forma limpa. <ol start="5"><li> Sob uma objectiva de 40x, o fogo polir a ponta da pipeta para um diâmetro interno de 5 mm, utilizando um filamento de aquecimento eléctrico. Uma vez terminado, a micropipeta está pronto a ser utilizado para a gravação de correntes de ORNs rato. A resistência pipeta aberto deve ser em torno de 1 M quando cheio de Ringer. </li></ol> 4. Isolamento de neurônios receptores olfativos <ol><li> Sacrificar um mouse seguindo diretrizes institucionais e regulamentos. Retire a cabeça, retire a pele que cobre o crânio e medialmente bisect a cabeça ao longo da linha média. </li><li> Coloque os dois hemi-cabeças sob um estereomicroscópio de dissecação, retirar o septo nasal e remover os cornetos olfativos. Coloque todos os tecidos em uma caixa de Petri com c glucoseontaining solução de Ringer de mamífero. </li><li> Descascar o epitélio olfactivo fora a cartilagem subjacente, a partir de duas conchas e transferir o tecido para dentro de um tubo de Eppendorf contendo 250 uL de Ringer. Usamos o tecido a partir de duas conchas para obter a densidade de células para a direita para o tamanho da nossa câmara de gravação. Armazenar o tecido restante a 4 ° C para uso posterior. </li><li> Vortex tubo Eppendorf contendo o epitélio olfactivo brevemente duas vezes durante 1 segundo a uma velocidade média. Esta etapa conduz à dissociação mecânica dos ORNs do epitélio. </li><li> Colocar a solução de Ringer que contém os ORNs dissociados na câmara de gravação. Remover grandes pedaços de tecido, também presentes na suspensão utilizando fórceps finos. </li><li> Deixe os ORNs contentar com 20 min antes de começar superfusão contínua com campainha e avançar para as gravações. </li></ol> 5. Gravações <ol><li> Reduzir o eléctrodo de sucção ligada à linha de óleo para a câmara de registo e regulComeram a altura do reservatório de óleo para estabelecer uma pressão ligeiramente positiva na ponta da pipeta. Isto pode ser feito por meio da observação restos celulares por exemplo, afastando-se (pressão positiva), ou no sentido (pressão negativa) da pipeta. Tente não contaminar a ponta da pipeta com restos celulares. </li><li> Digitalizar a câmara de registo para uma ORN isolado que pode ser reconhecido pela sua morfologia bipolar típica utilizando uma ampliação de 20-40x. Mova o eletrodo de registro na proximidade do corpo celular ORN. Começar a chupar suavemente, de modo que o corpo da célula entra na ponta da pipeta. Cuidadosa e lentamente continuar a aplicar sucção enquanto o corpo da célula inteira é arrastado para a ponta da pipeta de aspiração, saindo da dendrite e cílios exposta à solução do banho. Para imagens de ORNs sugado e formas de pipetas ver 7,11. Certifique-se de que uma vez que não é aplicada sucção, o ORN não se move dentro ou para fora da pipeta. Se for assim, ajustar a altura do reservatório de óleo de acordo. </li><li> Usando omicromanipuladores, mover a pipeta de aspiração a partir da secção que contém os ORNs estabeleceram para a secção de gravação da câmara. Coloque cuidadosamente a pipeta de aspiração em frente do tubo 3 de cano para a troca da solução. A pipeta de aspiração deve ser colocada suficientemente próxima da abertura do tubo 3 de cano, de modo que a ORN está exposto a um fluxo laminar, evitando assim a turbulência de mistura e para alcançar permuta solução rápida. A troca solução é conseguida através de um reforço da interface entre correntes paralelas de solução que flui através da ponta da pipeta de aspiração. O curso de tempo da troca solução é, tipicamente, de cerca de 20 ms, a corrente medida a partir da junção evocada por pisar a célula entre as soluções de composição iónica diferente (ver Fig. 2.). As soluções são fornecidas por gravidade. </li></ol> &lt;classe span = "pdflinebreak"&gt; 6. Resultados representativos <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg"> Figura 1.) A neurônios receptores bipolares no bulbo olfativo. B) As máquinas de sinal de transdução, em última análise, os cílios excitatórios conduz a corrente de influxo. A despolarização provoca consequente geração do potencial de acção no corpo celular. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg"> A Figura 2 mostra a velocidade e a fiabilidade da troca da solução. A pipeta foi em degraus do normal em 10% Ringer diluída para 100 ms e a corrente de junção resultante da concentração do ião dissimilar foi gravado. Traço preto é a averaiva de cinco ensaios, vermelho traçar seu SD. A pequena alteração em SD durante a troca de solução demonstra a fiabilidade de troca de solução de teste para teste e a falta de excesso de ruído em qualquer fluxo de solução. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg"> A Figura 3 mostra uma resposta eugenol induzida a partir de um ORN usando a técnica da pipeta de aspiração. A ORN foi exposto a 100 uM eugenol durante 1 segundo, como indicado pela barra acima do gravação. Na fig. 3A (preto traço) a corrente do receptor foi filtrada a uma largura de banda de 0-50 Hz para exibir apenas o receptor actual Fig.. 3B mostra a mesma gravação, filtrado agora no grande largura de banda de 0 - 5000 Hz (vermelho traço) também exibem potenciais de acção (APs, indicada por setas). A inserção mostra o traçado de uma mesma escala de tempo expandida para visualizar os APs de forma mais clara no início da resposta. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg"> Figura 4. Família Dose-resposta de um ORN eugenol-responsive (A). Eugenol foi utilizada em concentrações variando desde 0,3 uM a 100 uM, a duração do estímulo foi de 1 s e vestígios foram filtradas a 0 - 50 Hz. Um aumento progressivo da concentração odorante conduziu a uma resposta maior e mais rápido, que também mais lentamente uma vez terminada a exposição odorante foi terminada. ORNs pode exibir um padrão de resposta oscilatória durante estimulações longas, em concentrações odorant intermédios (Fig. 4B). Aqui um acetephenone ORN (3 uM) responsivo foi estimulado durante 8 segundos. Depois de uma resposta rápida e transiente de pico no início da estimulação de uma série de pequenas, as respostas recorrentes são observados. A largura de banda de gravação foi de 0 - 50 Hz.

<ol><li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology%3A+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li>
<li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects%3A+differences+and+commonalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+retinal+rods+to+single+photons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li>
<li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).</li>
<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+Ca2%2B+extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li>
<li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13(1999).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2%2B+concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<p class="jove_content"&gt; A técnica da pipeta de aspiração é um método eletrofisiológico que é utilizado para registar o odor da corrente induzida do receptor lento e os potenciais de acção rápida a partir de um bifásicos ORN simultaneamente. Desde que a membrana plasmática da célula não seja ultrapassado, este método deixa o meio intracelular imperturbado assegurar que as respostas odorant não são alterados devido a alterações da concentração de iões no citoplasma ou de diluição de factores intracelulares. As células podem ser registados a p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número do modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Mesa de ar </td><td> equipamento </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bomba de ar </td><td> equipamento </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Puller </td><td> equipamento </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato </td><td> equipamento </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse microscópio invertido </td><td> equipamento </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Equipado com lâmpada Hg, filtro GFP e objectivos 20X e 5X pelo menos </td></tr><tr><td> Amplificador PC 501A- </td><td> equipamento </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Andar de entrada uma GΩ </td></tr><tr><td> Faca de diamante </td><td> Equipamento </td><td> Sob medida </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitador Mikro1401 A / D </td><td> equipamento </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtrar unidade 3382 </td><td> equipamento </td><td> Krohn Hite corporação </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalizar </td><td> software </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldado Ag / AgCl Pellet </td><td> equipamento </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Titular da pipeta </td><td> equipamento </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Personalizado modificado para atender andar de entrada </td></tr><tr><td> Câmara de gravação </td><td> Equipamento </td><td> Sob medida </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador MP85-1028 </td><td> equipamento </td><td> Instrumento Sutter </td><td> Micromanipulador MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Solução </td><td> Sigma </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> TDS osciloscópio 1001 </td><td> equipamento </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Três canos tubo de vidro quadrado </td><td> Equipamento </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm ID, 5 cm de comprimento </td></tr><tr><td> Válvula </td><td> equipamento </td><td> A Companhia Lee </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> equipamento </td><td> Automatize Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B etapa de perfusão rápida </td><td> equipamento </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animais provar o ambiente à sua volta odorous através dos sistemas chemosensory localizados na cavidade nasal. Sinais chemosensory afetar comportamentos complexos como a escolha alimentar, predador, conspecific e reconhecimento mate e outras pistas socialmente relevantes. Neurônios receptores olfativos (ORNs) estão localizados na parte dorsal da cavidade nasal embutido no epitélio olfativo. Esses neurônios bipolares enviar um axônio para o bulbo olfatório (ver fig. 1, Reisert &amp; Zhao 1, publicada originalmente no Jornal de Fisiologia Geral) e estender um único dendrito da fronteira epitelial de onde irradiam os cílios no muco que cobre o olfativo epitélio. Os cílios contêm o mecanismo de transdução de sinal que conduz finalmente à excitatórios influxo de corrente através dos canais de transdução ciliares, um nucleotídeo cíclico-gated canal (CNG) e um Ca 2 +-activated Cl - canal (Fig. 1). O que se seguiu depolarization desencadeia geração do potencial de ação no corpo celular 2-4. Neste vídeo, descrevemos o uso da &quot;técnica da pipeta de aspiração&quot; para gravar odorante respostas induzidas a partir de ORNs. Este método foi desenvolvido originalmente para gravar de bastonetes 5 e uma variante deste método pode ser encontrado em jove.com modificado para gravar a partir de fotorreceptores de rato cone 6. A técnica da pipeta de sucção foi mais tarde adaptado para gravar também a partir ORNs 7,8. Resumidamente, após a dissociação do epitélio olfactivo e isolamento de células, o corpo de célula inteira de um ORN é sugado para dentro da ponta de uma pipeta de gravação. O dendrite e dos cílios permanecer exposta à solução do banho e, portanto, acessível a solução muda para permitir, por exemplo odorante ou bloqueador aplicação farmacológica. Nesta configuração, não têm acesso ao ambiente intracelular é obtida (sem fixador de tensão de célula inteira) e a tensão intracelular é livre de variar. Isso tudouxos a gravação simultânea do atual receptor lento que se origina na cílios e potenciais de ação rápidos disparados pelo corpo celular 9. A diferença na cinética entre estes dois sinais permite que eles sejam separados utilizando diferentes configurações de filtro. Esta técnica pode ser utilizada em qualquer tipo selvagem ou de rato knockout ou para gravar selectivamente a partir de ORNs que também expressam GFP para rotular subconjuntos específicos de ORNs, por exemplo, expressando um receptor de odorante dado ou canal iónico.

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Os animais amostram o ambiente odorífero ao seu redor através dos sistemas quimiossensoriais localizados na cavidade nasal. Os sinais quimiossensoriais afetam processos complexos...

O objetivo geral deste procedimento é registrar respostas induzidas por odorantes em neurônios sensoriais olfativos de camundongo. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do epitélio olfativo e isolamento dos neurônios sensoriais olfativos de camundongo. O segundo passo consiste em colocar os neurônios sensoriais olfativos isolados em uma câmara de gravação montada sobre um microscópio invertido.Micro manipuladores sustentam o eletrodo de registro e um trocador de solução. Em seguida, aspire um neurônio receptor olfativo identificado para dentro da ponta de um eletrodo de pipeta de sucção. O passo final é posicionar a pipeta com a célula aspirada em sua ponta diante de um trocador de solução para expor o neurônio a odorizantes.Por fim, o método de gravação com pipeta de sucção é utilizado para investigar a função de neurônios receptores olfativos. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a técnica de fixação de potencial em célula inteira, é que ela permite durações prolongadas de gravação com mudanças rápidas e precisas da solução. A demonstração visual deste método é essencial, pois o formato da pipeta de gravação é importante, e posicionar de forma estável as células do soquete na ponta da pipeta é difícil de aprender.Inicie este procedimento puxando uma micropipeta com um capilar de vidro borossilicato com filamento UNFI em um puxador de micropipetas com uma ponta longa e cônica. Em seguida, transfira a pipeta para um suporte de micropipeta personalizado montado em um microscópio ereto. O microscópio possui uma retícula no ocular e uma lâmina de diamante móvel montada na platina.Em seguida, observe a ponta da pipeta sob a objetiva de 20 x. Utilize o redle como guia. Risque suavemente a pipeta em um ângulo de 90 graus usando a faca de diamante personalizada no diâmetro externo da pipeta de 10 micrômetros.Mova a lâmina de diamante mais em direção à ponta. Aplique pressão gradualmente sobre ela. A ponta da pipeta deve quebrar limpidamente no ponto onde foi marcada.Em seguida, sob uma objetiva de 40 x, polir a ponta da pipeta até um diâmetro interno de cinco micrômetros utilizando um filamento aquecido eletricamente. Uma vez concluído, o microeletrodo está pronto para ser usado no registro de correntes dos ORNs de camundongo. Na próxima etapa, sacrificar um camundongo e remover sua cabeça.Em seguida, retire a pele que recobre o crânio e, posteriormente, divida a cabeça ao longo da linha média. A seguir, transfira as duas hemiciências para um microscópio estereoscópico de dissecação. Remova o septo nasal e retire as conchas nasais.Coloque o tecido em uma placa de Petri com solução de Ringer para mamíferos contendo glicose. Em seguida, retire o epitélio olfatório da cartilagem subjacente de dois cornetos. Transfira o tecido para um tubo einor contendo 250 microlitros de solução de Ringer.Em seguida, armazene o tecido remanescente a quatro graus Celsius para uso posterior. Vortexe o tubo EOR contendo o epitélio olfativo duas vezes brevemente por um segundo em velocidade média. Esta etapa promove a dissociação mecânica do NS do epitélio.Em seguida, coloque a solução de Ringer contendo os ORNs dissociados na câmara de gravação montada no microscópio e remova os pedaços maiores de tecido na suspensão usando uma pinça fina. Deixe o ORN sedimentar por 20 minutos antes de iniciar a perfusão contínua com solução de Ringer e prosseguir com as gravações neste procedimento; preencha o pipeta com solução de Ringer. Coloque a pipeta no suporte de pipeta e fixe o suporte ao estágio de cabeça do amplificador de patch clamp.Em seguida, conecte a linha de óleo à porta lateral do suporte da pipeta. Então, abaixe a pipeta na câmara de gravação. Regule a altura do reservatório de óleo para estabelecer uma pressão levemente positiva na ponta da pipeta.Isso pode ser feito observando os detritos celulares se movendo para longe ou em direção à pipeta. Evite contaminar a ponta da pipeta com detritos celulares. Em seguida, examine a câmara de gravação em busca de um ORN isolado, que pode ser reconhecido pela sua morfologia bipolar típica, utilizando uma ampliação de 20 a 40 x.Em seguida, mova o eletrodo de registro para perto do corpo celular da ORN. Aspire suavemente pelo tubo conectado ao reservatório de óleo, de modo que o corpo celular entre na ponta da pipeta. Continue aplicando sucção com cuidado e lentamente até que todo o corpo celular seja puxado para dentro da ponta da pipeta de sucção, deixando o dendrito e os cílios expostos à solução do banho.Mova a pipeta de sucção da seção contendo os ORNs sedimentados até a seção de gravação da câmara. Coloque cuidadosamente a pipeta de sucção em frente ao tubo de três canais para a troca de solução. A pipeta de sucção deve ser posicionada suficientemente próxima à abertura do tubo de três canais, de modo que o ORN seja exposto a um fluxo laminar, evitando assim turbulência de mistura. Para realizar a troca de solução, mova o limite entre os fluxos paralelos de solução provenientes do tubo de três compartimentos do trocador de solução através da extremidade da pipeta de sucção, a fim de monitorar a qualidade e a confiabilidade da troca de solução.A corrente da junção provocada pelo movimento da célula entre soluções de composição iônica diferente pode ser medida. O curso temporal da troca de solução é tipicamente de cerca de 20 milissegundos. Quando o neurônio receptor olfativo é transferido para uma solução de odorizante, uma resposta provocada pelo odorizante pode ser elicitada aqui.Um ORN foi exposto a cem micromolares de eugenol por um segundo, conforme indicado pela barra acima da gravação. No painel superior, a corrente do receptor foi filtrada em uma largura de banda de zero a 50 hertz para exibir apenas a corrente do receptor. Apenas o painel inferior mostra a mesma gravação filtrada em uma largura de banda ampla de zero a 5.000 hertz, para também exibir os potenciais de ação. Abaixo estão as respostas à dose de um ORN responsivo ao eugenol. O eugenol foi utilizado nas concentrações variando de 0,3 micromolar a cem micromolares.A duração do estímulo foi de um segundo, e os traçados foram filtrados de zero a 50 hertz. Um aumento progressivo na concentração do odorante levou a uma resposta com maior amplitude e tempo de subida mais rápido, que também terminou mais lentamente. Uma vez encerrada a exposição ao odorante, os ORNS podem exibir um padrão de resposta oscilatório durante estimulações prolongadas em concentrações intermediárias de odorante.Aqui, um ORN sensível à acetofenona foi estimulado durante oito segundos. Após um pico de resposta rápido e transitório no início da estimulação, uma série de respostas recorrentes menores é observada enquanto se tenta este procedimento. É importante lembrar-se de manipular os neurônios receptores olfativos com cuidado e ter muita paciência.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Neste vídeo, uma mosca Drosophila viva é montada em um tubo para estudos eletrofisiológicos. Os eletrodos são posicionados na base do sensillum para registrar respostas neuronais específicas aos feromônios com os neurônios receptores olfativos da mosca.

Registros eletrofisiológicos de Drosophila Sensilla em resposta a odores voláteis

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Os percevejos dependem de neurônios receptores olfativos alojados em sua sensila olfatória antenal para detectar semioquímicos no ambiente. Utilizando a gravação de um único sensor, demonstramos um método para avaliar a resposta dos percevejos aos semioquímicos e explorar o processo de codificação envolvido.

Usando Individual Sensillum Gravação para detectar respostas Olfativo Neurônio de percevejos para Semioquímicos

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Fisiologicamente, odorante receptores são ativados por moléculas odorant inaladas na fase de vapor. No entanto, mais sistemas in vitro utilizam o stimulation de odorante de fase líquida. Aqui, apresentamos um método que permite o monitoramento em tempo real e in vitro da ativação de receptores odorant após estimulação odorant em fase vapor.

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

O registro multi-unitular extracelular do nervo olfativo é um método sensível, robusto e reprodutível para avaliar a sensibilidade olfativa em peixes marinhos. Registra entrada sensorial primária e é independente da salinidade externa.

Gravação multi-unitular extracelular do nervo olfativo dos teleóstos

Aprenda a registrar respostas induzidas por odorantes em neurônios receptores olfativos de camundongos utilizando a técnica de pipeta de sucção. Este método permite capturar correntes de receptor e potenciais de ação simultaneamente.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

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