Name: Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a funcionalizar ressonadores ópticos de sílica com biotina por acoplamento covalente usando agentes de silano. Este método preserva a sensibilidade do sensor e permite armazenamento prolongado.

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Os autores agradecem o Prof Andrea Armani na University of Southern California para apoio durante o tempo este protocolo foi desenvolvido. Financiamento para o desenvolvimento inicial deste trabalho foi fornecido pelo National Science Foundation [085281 e 1028440] e do Instituto Nacional de Saúde através do Programa Nova NIH Director do Innovator Award [1DP2OD007391-01]. Informações adicionais estão disponíveis em <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Fundo A biotina é ligada à superfície destes dispositivos por meio de um processo simples de três passos (Figura 1). Primeiro, nós limpar a superfície e preenchê-lo com grupos hidroxilo, expondo os dispositivos para o plasma de oxigénio ou de solução piranha. Em segundo lugar, usar deposição de vapor para prender o agente de acoplamento de silano terminada com uma amina primária para os grupos hidroxilo através de hidrólise e reacção de condensação. Em terceiro lugar, damos biotina para a superfície através de N-hidroxissuccinimida (NHS) Química éster. Nós dirigimos o leitor interessado em nosso trabalho anterior para obter mais informações sobre o desenvolvimento dessas técnicas, bem como uma explicação de nossa motivação para a escolha destas técnicas 8. O sucesso destas reacções pode ser avaliada através de microscopia óptica e de fluorescência após a adição da amina primária, assim como após a adição da biotina. Enquanto m ópticaicroscopy pode ser usado para determinar se os protocolos de funcionalização da superfície resultou em danos para a superfície de microesferas, ou mesmo a contaminação, a microscopia de fluorescência é utilizado para verificar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície da molécula de biotina, bem como a capacidade da biotina no a superfície a ligar com (strept) avidina. Para avaliar a cobertura de aminas na superfície, utilizou-se o isotiocianato de fluoresceína (FITC) corante fluorescente, que reage com aminas primárias para formar estável, a ligação covalente de tioureia para a microesfera. Texas Red corante fluorescente que tem sido conjugado com avidina é usado para identificar os grupos de biotina na superfície através da interacção biotina-avidina. Em ambos os casos, foram escolhidos corantes que podem interagir (quer através de interacções receptor-ligando ou ligação covalente) com os grupos funcionais sobre a superfície. Aqui, o agente de acoplamento de silano, que tem três grupos de saída e um grupo funcional, fornece a aposta pontetre a superfície inorgânica e orgânica molécula de sonda. A funcionalidade amina primária reage quantitativamente com ésteres de NHS para formar ligações amida estáveis. Neste caso, usamos uma molécula sonda de biotina, cuja cadeia lateral valérico foi modificado com um grupo éster NHS. Realisticamente, qualquer molécula de sonda para o qual um grupo éster NHS pode ser adicionado à superfície utilizando os protocolos que se seguem. Além disso, esses protocolos são em geral, e pode ser usado para funcionalizar qualquer superfície dispositivo de sílica com biotina. O desafio primária com esses protocolos não é na verdade na química si, mas sim no tratamento da sílica microesferas. Por favor note que, ao longo dos protocolos, as microesferas devem ser manuseados por grapsing suas hastes levemente com uma pinça de ponta aguçada. Isto mantém as pinças bem longe da microesferas si, e permite o transporte fácil entre os passos. Muitos passos do protocolo abaixo são projetados especificamente para abordar este fatoou. 2. Fabricação de microesferas <ol><li> Construir o invólucro de armazenamento para as microesferas. <ol><li> Usando um estilete, corte um pedaço de espessura em ¼ de papelão em um 1 x 1 no quadrado; esta fita numa lâmina de vidro de tamanho normal, e anexar a 1 na seção de fita adesiva, com suas extremidades reunidos para formar um rolo , para o papelão. </li><li> Isto cria uma plataforma sobre a qual a microsfera pode ser elevada e isolado a partir do ambiente circundante, e evita danos à sua superfície. </li></ol></li><li> Utilizando uma tesoura, cortar uma secção de 3 polegadas de fibra óptica a partir de um carretel de fibra óptica. </li><li> Usando um n-Nik fibra-stripper, tira o revestimento protector polimérico a partir dos últimos 0,5 cm de distância da extremidade da peça cortada de fibra, deixando apenas o núcleo de sílica. Limpar a superfície de qualquer polímero restante com uma Kimwipe humedecido com metanol por suavemente limpando a fibra com o Kimwipe. </li><li> Usando uma simples fibra cutelo, corte a extremidade descascada tão them apenas cerca de 1 milímetro de fibra despojado permanece na extremidade da fibra. </li><li> Coloque a extremidade descarnada da fibra óptica no caminho de um laser de CO 2, tendo o cuidado de alinhar verticalmente a fibra tal que a sua extremidade descarnada está voltada para baixo. </li><li> Ligue o laser de CO 2, e dirigi-lo para a superfície da extremidade descarnada da fibra óptica. O laser vai derreter a extremidade descascada da fibra em uma esfera com cerca de 3,5% de poder em 2 segundos. </li><li> Com uma pinça, cuidadosamente agarrar da haste (a porção não-descascada da fibra óptica) da microesfera. Fixe a haste com o rolo de fita na caixa de microesferas. A lâmina de vidro pode ser em si armazenado numa placa de Petri. Isto permite a armazenagem segura da microesfera. </li></ol> 3. Preenchendo a superfície com grupos hidroxila <ol><li> Usando solução piranha: <ol><li> Em um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada, preparar uma solução piranha (70:30 em volume fumegante H <sub&gt; 2 SO 4: H2O 2 (30% em peso)) pela adição de 5 ml de peróxido de hidrogénio para o frasco, seguido por 11,6 mL de ácido sulfúrico fumante. CUIDADO: usar ácido-resistentes luvas. </li><li> Transferir a lâmina de vidro, que possuem pelo menos uma microesfera, ao frasco. A microesfera deve estar em contacto com o líquido, mas o líquido não deve tocar o papelão. Ajustar o volume da solução, se necessário. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e inseri-lo em outro frasco plástico contendo DDI H 2 O. Deixe as amostras sentar-se na solução durante 5 minutos. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos para secar a superfície. </li></ol></li><li> Usando o tratamento de plasma de oxigênio: <ol><li> Transferir a lâmina de vidro contendo pelo menos uma microesfera para a câmara de plasma de oxigénio. </li><li> Ajustar a pressão de oxigénio para 200 mTorr, eo poder de 120 W. Expor a amostra para o plasma de oxigénio durante 2 minutos. </li><li> Remover a lâmina de vidro a partir da câmara de plasma. </li></ol></li></ol> 4. Colocar agentes de acoplamento de silano à superfície <ol><li> Coloque a lâmina de vidro, contendo pelo menos uma microesfera, em um exsicador de vácuo numa hotte. </li><li> Também no exaustor, abrir a garrafa agente silano de engate (neste caso, aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) foi utilizado), e colocar a garrafa aberta no exsicador. </li><li> Colocar a tampa sobre o exsicador de vácuo, e anexar a porta de saída para um aspirador ou uma linha de vácuo casa. </li><li> Ligue o vácuo casa ou a linha de água, e evacuar o exsicador de vácuo. Uma vez que um selo de vácuo é formado entre a tampa ea base, começar a cronometragem a reacção. Isto irá depositar o agente de acoplamento de silano sobre a superfície como uma película fina. </li><li> Após 15 minutos, desligar a vácuo, e, lentamente, abrir a porta para permitir que o ar no exsicador. Para este agente de acoplamento, a 15 minutos é suficiente para formar um unifomonocamada rm sobre a superfície. Para outros agentes de acoplamento, o tempo pode necessitar de ser ajustada. </li></ol> 5. Colocar Biotina à superfície <ol><li> Aproximadamente uma hora antes de prender a biotina, preparar uma solução 10 mM de N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada. <ol><li> Se o NHS-biotina foi armazenado frio, deixe-o atingir a temperatura ambiente antes juntando-lo. </li><li> Sonicar a solução durante 1 hora para dissolver completamente o pó NHS-biotina no solvente. </li></ol></li><li> Transferir a lâmina de vidro contendo a microesfera em outro frasco de plástico, com as microesferas no fundo, e as hastes na parte superior do frasco. </li><li> De transferência, usando uma pipeta de plástico, um volume apropriado da solução NHS-biotina para o lado do frasco, por trás da lâmina de vidro (para que a solução não toca a microesfera como está sendo adicionada ao frasco). Add solução suficiente para cobrir a superfície de microesferas. </li><li> Colocar os tubos que contêm agora as microesferas e NHS-biotina em solução de DMSO numa incubadora de balanço (bandeja de inclinação) durante 30 minutos à temperatura ambiente, com a velocidade e ângulo de inclinação a 5 rpm e 5 graus, respectivamente. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de DMSO a partir da superfície, e remove qualquer biotina fisicamente adsorvido que não chegou a enxerto à superfície. </li><li> Remover a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos, ou até que todas as gotas de água são removidos da superfície. </li></ol> 6. Marcação fluorescente de amina terminada sílica <ol><li> Para identificar os grupos amina presentes após tratament com APTMS, preparar a solução de FITC num quarto escurecido por dissolução de 1 mg em 1 mL de FITC DMSO anidro. </li><li> Dilui-se a solução em 6,1 pela adição de 50 uL da solução de FITC a 1 mL de 0,1 M tampão de bicarbonato de sódio. </li><li> Coloque a solução num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a microesferas de amina terminada, alojados novamente sobre a lâmina de vidro, para dentro do frasco. </li><li> Colocar o frasco num banho de gelo, e deixar a amostra reagir com a solução de FITC durante um mínimo de 4 horas no escuro. </li><li> Remover o excesso fluoróforo através de duas lavagens, 10 minutos de microsferas em tampão de carbonato de sódio. Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão. Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem. </li></ol> 7. Marcação fluorescente da biotina terminada sílica <ol><li> Preparar uma solução de 10 ug / mL de Texas Red-avidina em tampão fosfato salino. </li><li> Adicionar a solução para um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a lâmina de vidro contendo uma microesfera biotina terminada dentro da solução, de modo que a microesfera está coberto pela solução. </li><li> Reagir durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover fluoróforo excesso através de dois, 10 minutos enxaguars de microsferas em tampão PBS. <ol><li> Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão. </li><li> Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente. </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem. </li></ol> 8. Os resultados representativos Microesfera corretamente funcionalizados podem ser identificados através de microscopia óptica e de fluorescência. Se a funcionalização da superfície é feito correctamente, deve resultar em uma cobertura uniforme densa de moléculas de biotina na superfície, ea superfície deve permanecer defeito e contaminante-livre após a funcionalização, a fim de manter as suas sensibilidades elevadas durante as experiências de detecção. A microscopia óptica pode ser usado para sondar a esta última, enquanto fluorescente microscopia pode sondar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície. Na Figura 2, que mostram exemplos de microesferas correctamente funcionalizado. Estas imagens mostram que não há danos na superfície ou contaminação devida a funcionalização (Fig. 2a), e que as microesferas mostram uma cobertura uniforme e consistente de grupos tanto de amina (Fig. 2b) ou grupos de biotina (Fig. 2c) sobre a superfície . Se as microesferas não foram funcionalizados correctamente, a microsferas óptico de imagens will exibem a contaminação da superfície, a cobertura de aglutinação ou não-uniforme, e defeitos óbvias na superfície, como fissuras de superfície (Figura 3). Aqui, vemos um exemplo comum de contaminação da superfície, resultante da aglomeração dos reagentes na superfície. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figura 1. 3-passo esquema de reacção para a fixação de moléculas de sonda para a superfície de sílica microesferas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figura 2. Sílica microesferas. uma micrografia) óptico de microesfera de sílica preenchida com grupos hidroxilo através da exposição ao plasma de oxigénio; b) micrografia fluorescente de microesfera de sílica preenchida com aminas primárias e marcadas com FITC corante; c) micrografia fluorescente de sílica microsphere preenchida com biotina e rotuladas com Texas Red-avidina conjugada. Reproduzido com permissão da Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Determinação da cinética de ligação usando microcavidades modo sussurrando galeria. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, a American Institute of Physics 17. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografia óptica de esfera impropriamente funcionalizado. Aqui, pode ver pó sobre a superfície superior direito, bem como a contaminação se estende para fora da superfície. Além disso, o lado direito da microesfera óptico mostra um torrão pequeno sobre a superfície.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Tal como descrito nos protocolos, foi criada uma plataforma de habitação, através da qual a transportar o microesferas de sílica por suas hastes durante todo o processo de funcionalização. Esta plataforma habitação foi criado como uma solução para a contaminação da superfície e danos que resultou da microesfera que entram em contacto com as paredes dos recipientes diferentes usados ​​em todo o processo de funcionalização. Percebemos que a principal dificuldade surgiu constantemente anexação e desanexação microesferas in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Pescador </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS grau </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Pescador </td><td> 8014-95-7 </td><td> Irritado </td></tr><tr><td> Peróxido de Hidrogênio </td><td> Pescador </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30% em peso </td></tr><tr><td> Aminopropiltrimetoxisilano </td><td> Pescador </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotina linker EZ </td><td> Perfurar </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Pescador </td><td> 67-68-5 </td><td> Anidro </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína </td><td> Perfurar </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Pescador </td><td> 7647-14-5 </td><td> Concentrado em pó </td></tr><tr><td> Tampão de bicarbonato de sódio </td><td> Pescador </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - Avidina Conjugado </td><td> Perfurar </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ótica </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Stripper Fibra </td><td> Instrumento de Vendas Fibra </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik Stripper hum 175 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pescador </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Nua Fibra Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscopia de vidro </td><td> Pescador </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Os frascos de polipropileno </td><td> Pescador </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 mL, tampa articulada </td></tr><tr><td> A incubação de Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> Pescador </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

colocar sondas biológicas para biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

A fim de interface com ambientes biológicos, plataformas de biossensor, tais como o sistema BIAcore popular (com base na ressonância plasmon de superfície técnica (SPR)), fazer uso de técnicas de superfície várias alterações, que podem, por exemplo, evitar a contaminação da superfície, ajustar o hidrofobicidade / hidrofilicidade da superfície, se adaptar a uma variedade de ambientes eletrônicos, e mais frequentemente, induzir especificidade em direção a um alvo de interesse. 1-5 Estas técnicas estender a funcionalidade de biossensores de outra forma altamente sensíveis para aplicações do mundo real em ambientes complexos, tais como sangue, urina, e análise de águas residuais. 2,6-7 Enquanto plataformas biosensoriamento comerciais, tais como BIAcore, têm bem entendido, as técnicas padrão para a realização de modificações de superfície tais, estas técnicas não foram traduzidos em uma forma padronizada para outro rótulo plataformas livres biosensoriamento, como Whispering Gallery modo (WGM) ressonadores ópticos. 8-9 &lt;<html> / P&gt; Ressonadores WGM ópticos representam uma tecnologia promissor para a realização de rótulo livre detecção de uma grande variedade de espécies de ultra-baixas concentrações 6,10-12 A elevada sensibilidade destas plataformas é um resultado dos seus únicos óptica geométrica:. WGM óptico ressonadores confine circulante . luz em momentos específicos, as frequências de ressonância integrais 13 como as plataformas SPR, o campo óptico não está totalmente confinada ao dispositivo sensor, mas evanesces; este &quot;cauda evanescente&quot; pode então interagir com as espécies no ambiente circundante. Esta interacção faz com que o índice de refracção efectivo do campo óptico para alterar, resultando em um ligeiro, mas detectáveis, deslocar na frequência de ressonância do dispositivo. Como o campo óptico circula, pode interagir muitas vezes com o meio ambiente, resultando numa amplificação inerente do sinal, e sensibilidades muito elevados a pequenas alterações no ambiente. 2,14-15 tenda &quot;&gt; Para realizar a detecção de alvo em ambientes complexos, estas plataformas devem ser emparelhado com uma sonda molecular (geralmente a metade de um par de ligação, por exemplo, anticorpos / antígenos) por meio de modificação da superfície. 2 Embora ressonadores WGM ópticos podem ser fabricados em diversas geometrias de uma variedade de sistemas de materiais, a microesfera de sílica é o mais comum. Estas microesferas são geralmente fabricadas na extremidade de uma fibra óptica, o que proporciona uma &quot;haste&quot;, através da qual as microesferas podem ser manipulados durante as experiências de funcionalização e de detecção. químicas superfície da sílica pode ser aplicado para anexar moléculas de sonda para as suas superfícies, no entanto, as técnicas tradicionais gerados para substratos planares muitas vezes não são adequados para estas estruturas tridimensionais, como quaisquer alterações na superfície das microesferas (contaminação, pó, defeitos de superfície, e revestimentos irregulares) pode ter graves consequências negativas sobre as suas capacidades de detecção. Aqui, nós demonstrar uma abordagem fácilpara a funcionalização da superfície de ressoadores de sílica de microsferas WGM ópticos usando agentes de acoplamento de silano para colmatar a superfície inorgânico e para o ambiente biológico, anexando biotina para a superfície de sílica. 8,16 Embora usamos ressoadores de sílica WGM de microsferas como o sistema de sensor no presente relatório, os protocolos são geral e pode ser usado para funcionalizar a superfície de qualquer dispositivo de sílica com biotina.

Biossensores interface com ambientes complexos e biológicas e realizar a detecção de alvo, combinando sensores altamente sensíveis com sondas altamente específicos ligados ao sensor através de modificação da superfície. Aqui, nós demonstrar a funcionalização da superfície de sensores ópticos de sílica com biotina, utilizando agentes de acoplamento de silano para colmatar o sensor eo ambiente biológico.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

Para fazer a interface com ambientes biológicos, as plataformas de biossensores, como o popular sistema Biacore (baseado na Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)...

O objetivo geral deste procedimento é revestir a superfície do ressonador óptico de microesferas de sílica com biotina por meio de um processo de ligação covalente, sem degradar a sensibilidade do dispositivo. Isso é realizado por um processo em três etapas, começando com a hidroxilação utilizando plasma de oxigênio ou ataque com piha; a hidroxilação é seguida por silanização por meio da deposição em vapor de um agente de acoplamento silano. Em seguida, a biotinilação é realizada utilizando a química do éster NHS para ligar a cadeia lateral valérica da biotina às aminas primárias na superfície do ressonador.Em última análise, este método cria um biossensor óptico altamente sensível e específico para uma molécula de interesse, que poderia ser modificado ainda mais por meio da marcação fluorescente de uma sílica com terminação média, bem como pelo método de complexação biotina-Ava tin, para criar uma plataforma de biossensor para uma ampla variedade de alvos potenciais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de funcionalização de superfície, como absorção física, é que nossa molécula sonda é ligada covalentemente, o que torna nossos sensores mais robustos e confiáveis. Isso significa que eles podem ser armazenados por períodos mais longos e ainda manter sua utilidade, além de permanecerem altamente sensíveis após a funcionalização.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à complexidade de manipular dispositivos em escala microscópica durante todo o processo de funcionalização. A técnica inadequada de manipulação é a forma mais fácil de degradar o desempenho óptico do sensor e de gerar contaminação na superfície do sensor. Usando tesoura, corte um pedaço de papelão com um quarto de polegada de espessura em um quadrado de uma polegada por uma polegada.Fixe isso em uma lâmina de vidro padrão e prenda um pedaço de fita adesiva transparente enrolada de um polegada de comprimento ao papelão. Isso cria uma plataforma na qual a microesfera pode ser elevada e isolada do ambiente circundante, evitando danos à sua superfície ao usar tesoura. Corte um pedaço de três polegadas de fibra óptica da bobina.Em seguida, utilize um descascador de fibra sem corte para remover o revestimento polimérico protetor dos últimos 0,5 polegadas na extremidade do pedaço cortado de fibra, deixando apenas o núcleo de sílica; limpe a superfície de qualquer polímero remanescente com um lenço Kim umedecido com metanol, limpando suavemente a fibra. Com um cleaver de fibra nua, corte a extremidade descascada de modo que apenas cerca de um milímetro de fibra descascada permaneça na ponta da fibra. Posicione a extremidade descascada da fibra óptica no trajeto de um laser de dióxido de carbono, tomando cuidado com a orientação vertical. Alinhe a fibra de forma que sua extremidade descascada fique voltada para baixo.Ligue o laser de dióxido de carbono e direcione-o à superfície da extremidade descascada da fibra óptica. O laser derreterá a extremidade descascada da fibra em uma esfera, utilizando aproximadamente 3,5% da potência em dois segundos. Com pinças, segure cuidadosamente o talo da microesfera.Fixe o suporte ao rolo de fita na carcaça da microesfera. A lâmina de vidro pode ser armazenada em uma placa de Petri, permitindo o armazenamento seguro da microesfera em um frasco de polipropileno de 60 mililitros com tampa articulada. Prepare uma solução de piranha adicionando três mililitros de peróxido de hidrogênio ao frasco, seguidos por sete mililitros de ácido sulfúrico fumegante.Transfira a lâmina de vidro contendo pelo menos uma microesfera para o frasco. A microesfera deve estar em contato com o líquido, mas o líquido não deve tocar o papelão. Ajuste o volume da solução, se necessário.Após as esferas terem sido imersas na solução de piranha por 15 minutos, remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco e insira-a em outro frasco plástico contendo água destilada desionizada. Coloque o frasco na bandeja inclinada por cinco minutos com um ângulo de cinco graus e velocidade de inclinação de cinco RPM. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco e coloque-a em uma estufa a 80 graus Celsius por 10 minutos.Para secar a superfície, coloque a lâmina de vidro contendo pelo menos uma microesfera em um vácuo. Desseque. Abra o frasco do agente de acoplamento, como A-P-T-M-S, e coloque o frasco aberto no dessecador. Substitua a tampa do dessecador a vácuo e conecte a saída a um aspirador ou à linha de vácuo central.Ligue a casa, o vácuo ou a linha de água e evacue o dessecador a vácuo. Uma vez formado o selo a vácuo entre a tampa e a base, inicie a contagem do tempo da reação. Isso depositará o agente de acoplamento silano na superfície como um filme fino.Após 15 minutos, desligue o vácuo e abra lentamente a válvula para permitir a entrada de ar no dessecador. Para este agente de acoplamento, 15 minutos são suficientes para formar uma monocamada uniforme na superfície; para outros agentes de acoplamento, o tempo pode precisar ser ajustado. Aproximadamente uma hora antes de ligar a biotina, prepare uma solução 10 milimolar de hidroxilamina biotinilada em dimetilsulfóxido anidro em um frasco de polipropileno de 60 mililitros com tampa articulada.A parte mais difícil deste protocolo é o manuseio das microesferas e a prevenção da contaminação da superfície das esferas, a fim de garantir o sucesso. Além de montar o dispositivo de lâmina para segurar as esferas, a solução de biotina é submetida à ultrassonicação previamente para quebrar as partículas que permanecem na superfície. Submeta a solução à ultrassonicação por uma hora para dissolver completamente o pó de biotina NHS no solvente.Transfira a lâmina de vidro contendo a microesfera para outro frasco plástico com a microesfera na parte inferior e a haste na parte superior do frasco. Usando uma pipeta plástica, transfira um volume apropriado da solução de NHS biotina pela lateral do frasco, por trás da lâmina de vidro, de modo que a solução não entre em contato com a microesfera enquanto é adicionada ao frasco. Adicione quantidade suficiente de solução para cobrir a superfície da microesfera.Coloque o frasco agora contendo a MICROESFERA e a solução de biotina NHS e DMSO em um incubador com movimento oscilante por 30 minutos à temperatura ambiente, com velocidade e ângulo de inclinação de cinco RPM e cinco graus, respectivamente. Remova suavemente a lâmina de vidro do frasco e deslize-a suavemente para outro frasco preenchido com água destilada desionizada. Coloque o frasco na bandeja inclinada por mais 10 minutos, na mesma velocidade e ângulo de inclinação.Como antes, repita este passo duas vezes com água fresca a cada vez. Isso ajuda a remover o excesso de DMSO da superfície e elimina qualquer biotina fisicamente absorvida que não tenha sido efetivamente ligada à superfície. Remova a lâmina de vidro do frasco e coloque-a em uma estufa a 80 graus Celsius por 10 minutos ou até que todas as gotas de água sejam removidas da superfície.Prossiga para realizar a marcação fluorescente de uma sílica com terminação média, conforme discutido no protocolo para marcação fluorescente. Marque a sílica com terminação biotina. Primeiro, prepare uma solução de 10 microgramas por mililitro de Texas Red Aden em solução salina tamponada com fosfato.Adicione a solução a um frasco de polipropileno de 60 mililitros com tampa articulada e deslize suavemente a lâmina de vidro contendo um microesfera terminada em biotina para dentro da solução, de modo que a microesfera fique apenas coberta pela solução. Em seguida, envolva o frasco com papel alumínio após uma reação de 30 minutos. Incube à temperatura ambiente no escuro. O excesso de fluoroquatro é removido por meio de duas lavagens da microesfera com tampão PBS, cada uma com duração de 10 minutos.Como antes, preencha um frasco de polipropileno de 60 mililitros com o tampão e transfira suavemente a lâmina de vidro para a solução. Tenha cuidado com isso. A solução cobre apenas a microesfera e não o invólucro de papelão.Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em uma bandeja inclinada ajustada para cinco graus e cinco RPM durante 10 minutos. Remova suavemente a lâmina de vidro do frasco e deslize-a cuidadosamente para outro frasco cheio com água destilada desionizada e coberto com papel alumínio. Coloque o frasco na bandeja inclinada por mais 10 minutos, na mesma velocidade e ângulo de inclinação.Repita este passo duas vezes com água fresca a cada vez. Isso ajuda a remover o excesso de corante da superfície. Como etapa final, retire geralmente a lâmina de vidro do frasco e seque em uma estufa ajustada a 80 graus Celsius por 10 minutos antes da obtenção de imagens.Se a funcionalização da superfície for realizada corretamente, deve resultar em uma cobertura uniformemente densa de moléculas de biotina na superfície, conforme verificado por microscopia fluorescente. Além disso, a superfície deve permanecer livre de defeitos e contaminantes após a funcionalização, a fim de manter sua alta sensibilidade. Durante experimentos de detecção, conforme visualizado por microscopia óptica, os exemplos mostrados aqui são de microesferas corretamente funcionalizadas.Essas imagens mostram que não há danos ou contaminação na superfície devido à funcionalização e que as microesferas apresentam uma cobertura uniforme e consistente de grupos amina ou grupos biotina. Na superfície, se as microesferas não tiverem sido funcionalizadas corretamente, as imagens das microesferas ópticas exibirão contaminação superficial, aglomeração ou cobertura não uniforme e defeitos evidentes na superfície, como trincas superficiais; aqui, um exemplo comum de contaminação superficial resultante da aglomeração de reagentes na superfície. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar a superfície de qualquer ressonador óptico de sílica com biotina.Como este é um método geral para dispositivos de sílica, você deverá ser capaz de aplicá-lo amplamente a muitos tipos diferentes de plataformas de sensores de sílica. Por meio do desenvolvimento desta técnica, pesquisadores na área de biofotônica poderão explorar mais facilmente novos métodos e novas combinações de sensores de sonda para criar plataformas de biossensores altamente sensíveis e específicas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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