Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar os níveis de expressão de moléculas de micro-RNA em câncer de próstata e tecido prostático normal utilizando PCR quantitativa em tempo real. Isso é alcançado primeiramente pela extração de RNA total de tecidos prostáticos. Isso inclui micro-RNA e outros RNAs pequenos.

Em seguida, o RNA é transcrito reversamente para gerar cDNA. Então, é realizada uma PCR em tempo real com verde ciber utilizando o cDNA como molde para amplificar e quantificar a expressão de microRNAs em tempo real. São obtidos resultados que mostram a expressão relativa de microRNAs em diversas amostras de próstata com base na PCR quantitativa em tempo real.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos é que ela oferece alta sensibilidade, precisão, reprodutibilidade, além de ser rápida e economicamente eficaz. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área da biologia do câncer, já que a expressão de microRNAs frequentemente está correlacionada com genes fortemente envolvidos no processo cancerígeno. Podemos, portanto, utilizar a QPCR para avaliar a expressão de microRNAs e verificar como essa expressão se correlaciona com variáveis clínicas.

Esses biomarcadores podem potencialmente ser utilizados como ferramentas diagnósticas e prognósticas. Eles podem nos ajudar a diagnosticar o câncer de próstata, bem como a determinar quais cânceres de próstata são agressivos. Além disso, há potencial para que esses biomarcadores atuem como agentes terapêuticos.

Não apenas este método pode fornecer informações sobre a gênese do tumor de próstata, como também pode ser aplicado a outros cânceres e doenças. Colete amostras da próstata no momento da ectomia e oriente o espécime utilizando marcos anatômicos. Pinte a próstata e as vesículas seminais da seguinte maneira: lado direito verde, lado esquerdo azul.

Obtenha uma seção transversal média aleatória do tecido perpendicular à superfície retal, congele a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Faça uma cópia e oriente as fatias dos espécimes, dividindo-as em quatro partes iguais. Consulte um patologista para determinar as áreas tumorais versus normais na imagem correspondente.

Use as áreas marcadas como guia para identificar o tecido tumoral para extração de RNA para isolamento de RNA. Comece colocando amostras congeladas de próstata sobre gelo seco e consulte a fotocópia delimitada. Corte uma pequena porção do tumor de próstata.

Homogeneíze o tecido do tumor de próstata em um mililitro do reagente triol. Incube as amostras homogeneizadas por cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione 0,2 mililitros de clorofórmio às amostras e agite vigorosamente por 15 segundos.

Incube as amostras por três minutos à temperatura ambiente, em seguida, centrifugue a 12.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a fase aquosa superior incolora para tubos novos e adicione 0,5 mililitros de álcool isopropílico. Incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente, depois centrifugue a 12.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet contendo o RNA. Adicione um mililitro de etanol a 75% ao pellet de RNA, vortexe a amostra e sedimete por centrifugação durante cinco minutos a 7.500 × g a quatro graus Celsius. Novamente, aspire o SNAT e seque o pellet de RNA por cinco a dez minutos, certificando-se de que não fique completamente seco.

Na cor vermelha, dissolva o pellet em água livre de nucleases e utilize um espectrofotômetro para medir a concentração do RNA. Utilize um bioanalisador para verificar a qualidade e integridade das amostras de RNA. Transcreva reversamente o RNA em CDNA utilizando um kit de transcrição reversa conforme as instruções do fabricante.

Para gerar uma curva padrão, prepare uma série de diluições do CD NA original a partir de uma amostra que se sabe ter uma expressão significativa do gene de interesse. Realize a PCR em tempo real preparando uma mistura-mestra com base em um volume de reação de 20 microlitros de quant dois x. Detecte a mistura-mestra de PCR com verde ciber, 10 x primers universais microscript, 10 x ensaio de primers microscript e água livre de RN a's.

Inclua dois conjuntos de primers, um para o gene alvo e outro para o gene de referência, neste caso, RNU6B. Pipete dois microlitros de cada diluição de cDNA em tubos capilares individuais para o light cycler e adicione 18 microlitros da mistura mestra. Utilize um adaptador de capilar para centrifugar. Coloque os capilares em um termociclador em tempo real baseado em capilares e execute o programa de PCR da seguinte forma: 95 graus Celsius por 15 minutos, seguido por 50 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos.

55 graus Celsius por 30 segundos e 70 graus Celsius. Por 30 segundos, selecione uma amostra para ser o calibrador e defina sua quantidade normalizada de alvo como um. Compare a expressão relativa do micro RNA em todas as outras amostras com o calibrador para gerar curvas de amplificação.

Para as reações de PCR, utilize o software Light Cycler versão 3.5 na aba de quantificação. Quantifique as reações e exporte os dados para um arquivo de texto. Importe os dados para o software de análise REL quant para gerar os resultados de quantificação.

Importe arquivos separados para o gene alvo, gene de referência e dados da curva padrão. Especifique a posição do calibrador para o gene alvo e o gene de referência, bem como as posições das amostras. Os dados são expressos como a razão entre o alvo e a referência de diferentes amostras dividida pela razão entre o alvo e a referência do calibrador.

Utilize a curva padrão previamente gerada para um microRNA específico e um gene de referência como padrão de referência para extrapolar dados quantitativos de microRNA. Alvos de concentrações desconhecidas. Analise três amostras como um grupo e calcule as concentrações médias e os desvios-padrão das triplicatas.

Se um dos triplicados for inconsistente com o restante do conjunto, o programa o excluirá. Aqui é mostrado um exemplo da análise A-Q-P-C-R de amostras de próstata. Os gráficos mostram os níveis de expressão do gene de referência U seis, que inicia a amplificação exponencial por volta do ciclo 20, enquanto a expressão do gene alvo, MIR 98, apresentou amplificação retardada por volta do ciclo 25.

Os dados deste experimento foram exportados como um arquivo de texto e analisados pelo software de análise requ, em que as posições dos capilares contendo o calibrador e as amostras são especificadas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia, quando executada corretamente. A confiabilidade desta técnica depende da qualidade do RNA.

Portanto, é importante ter cuidado extra no manuseio de RNA porque ele pode degradar-se com muita facilidade.