Name: Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a quantificar microRNAs em tumores de próstata por qPCR em tempo real. Este método permite analisar múltiplos microRNAs simultaneamente com alta sensibilidade e precisão para pesquisa em oncologia.

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Este trabalho foi financiado pela Canadian Cancer Society Research Institute, conceder nenhuma. 019038.

<html> 1. Coleta de Amostras de próstata <ol><li> Recolher as amostras da próstata, no momento da prostatectomia. A amostra é orientada usando marcos anatômicos. A próstata e as vesículas seminais são pintadas como segue: verde do lado direito, azul lado esquerdo. </li><li> Um midsection aleatória transversal da próstata é tomada perpendicularmente à superfície rectal, congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C 9. </li><li> Bancados fatias de espécimes são fotocopiadas, orientado (anterior, posterior, direita e esquerda), quadrisected. As secções são cortadas utilizando o criostato. </li><li> As seções são corados com H &amp; E e revisadas por um patologista para determinar e delinear áreas de tumor versus normal nas lâminas coradas e uma imagem correspondente. As áreas marcadas são usadas como um guia para indicar as áreas a partir da qual para extrair o tecido do tumor a partir do qual o RNA será extraído nos passos subsequentes. </li></ol>quebrar &quot;&gt; 2. Isolando RNA totais, incluindo miRNA, a partir de amostras <ol><li> Colocar as amostras congeladas de próstata em gelo seco e referindo-se à fotocópia delineada, cortada uma pequena porção do tumor da próstata (entre 50 a 100 mg). </li><li> Homogeneizar o tecido do tumor da próstata em 1 mL de reagente Trizol. As quantidades em os seguintes passos são baseadas no uso de 1 mL de reagente Trizol. </li></ol> Nota: Aqui temos utilizado reagente Trizol para RNA de extracção, no entanto outros kits que isolam pequenos ARN contendo RNA total pode também ser usado. <ol start="3"><li> Incubar as amostras homogeneizadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 0,2 mL de clorofórmio às amostras e agitar vigorosamente por 15 segundos. Incubar as amostras durante 3 minutos a temperatura ambiente, em seguida, centrifugar a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase superior incolor aquosa para tubos frescos e adicionar 0,5 mL de álcool isopropílico.Incubar as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente, em seguida, centrifugar a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento contendo o RNA. Lava-se a pelete de RNA com 1 mL de etanol a 75%. Vórtice a amostra e re-sedimento por centrifugação durante 5 minutos a 7500 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e secar o pellet de RNA por 5-10 minutos, certificando-se o pellet de RNA não está completamente seca. Dissolver em água livre de nuclease adequada ao tamanho da pelota. Medir a concentração de RNA usando o espectrofotómetro 1000 NanoDrop (absorvância medida a 260 nm e 280 nm). </li><li> Verifique a qualidade ea integridade das amostras de RNA usando Agilent Bioanalyzer. </li></ol> 3. Transcrição Reversa de RNA <ol><li> A transcrição reversa do RNA foi realizada utilizando Kit de Transcrição Reversa miScript de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Este kit inclui umtranscriptase reversa e um poli-polimerase (A). O miScript tampão RT inclui Mg 2 +, dNTPs, primers oligo-dT, e iniciadores aleatórios. </li><li> Use entre 10 pg e 1 ug de RNA para sintetizar cDNA. Se utilizar mais do que 1 ug de RNA, dimensionar-se a reacção linearmente para o volume apropriado. </li><li> Prepara-se uma mistura mestra que contém 5X tampão RT miScript (4 ul), miScript Mix Transcrição Reversa (1 uL), e livre de RNase água para trazer reacções volume final de 20 uL. Também incluem RNA modelo (até 1 mg) na mistura principal. </li><li> Incubar as amostras durante 60 minutos a 37 ° C, seguida imediatamente por uma incubação durante 5 minutos a 95 ° C. Este passo pode ser realizado numa máquina de PCR, o aquecimento de banho de bloco, ou água. Termocicladores são o método mais adequado e preciso. Armazenar o ADNc em gelo durante curto prazo, e -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 4. Gerando uma curva padrão <ol><li> Antes de experiment com miRNAs alvo, uma curva padrão é gerada usando cDNAs de concentrações conhecidas contra os seus pontos de cruzamento (CP) (Figura 2). </li><li> Prepara-se uma série de diluições de 2 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 250 vezes, e 1250 vezes o ADNc original é de uma amostra que é conhecido por ter uma expressão substancial do seu gene de interesse. </li><li> Execute o PCR, conforme especificado na Seção 5 &quot;Real-time PCR para a detecção de miRNA&quot;, com a modificação que é cDNA em diluições seriadas não diluição estática 40x. </li><li> Realizar a análise utilizando o software RelQuant (Roche) para gerar a curva padrão. </li></ol> Nota: uma nova curva padrão devem ser gerados para cada gene de interesse. 5. Real-time PCR para a detecção de miRNA <ol><li> PCR em tempo real para miRNAs foi realizada utilizando miScript SYBR Green PCR Kit e miScript Assay Primer de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Prepare uma mistura master contendo2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, Primer Universal miScript 10x, 10x Ensaio Primer miScript, e RNase água. Preparar um master mix para uma reação volume de 20 l. </li><li> O Ensaio Primer é específico para o miRNA de interesse. Para reconstituir Assay 10x miScript Primer, centrifugar o frasco de forma breve, e adicionar 550 uL de tampão TE, pH 8,0. Frasco Vortex brevemente para misturar, primers alíquotas para volumes menores, e armazenar a -20 ° C. Dois iniciadores são necessários:. Iniciadores para o gene alvo eo gene de referência RNU6B é usedas o gene de referência. </li><li> Diluir o cDNA 40x e armazenamento de alíquotas adicionais a -20 ° C. </li><li> ADNc serve como molde para a PCR. Use 2 ul de cDNA 40x diluída e dispensar para o reciclador 20 uL de luz capilares (Roche). </li><li> Adicionar 18 ul da mistura principal para cada capilar, e centrífuga, usando um adaptador capilar. </li><li> Coloque os vasos capilares no capilar termociclador em tempo real baseado, como LightCycler 3.5 Real-Time PCR System com um formato de carrossel 32-capilar. </li><li> Executar o programa de ciclos de PCR como se segue: Para activar Polimerase HotStarTaq que está no 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, pré-incubar a 95 ° C durante 15 minutos. Seguido por 50 ciclos de: Desnaturação, 15 s, 94 ° C; Recozimento, 30 s, 55 ° C; Extensão, 30 s, 70 ° C. </li><li> Selecione uma amostra para ser o calibrador, e definir seu valor alvo normalizado para 1. Comparar a expressão relativa da miRNA em todas as outras amostras para o calibrador. </li></ol> Nota: Dentro de um estudo, a mesma amostra de calibração deve ser usado para manter a consistência dos resultados. 6. Análise de Dados <ol><li> As curvas de amplificação para as reacções de PCR são representados graficamente e numericamente por Molecular Software versão Biochemicals LightCycler 3,5 (Roche). Quantificar reações na &quot;quantificação&quot; guia, umnd exportar os dados para um arquivo de texto. </li><li> Importe os dados para o software de análise RelQuant (Roche) para gerar resultados de quantificação. Importar ficheiros separados para o gene alvo, o gene de referência, e os dados da curva padrão. </li><li> Especifique a posição do calibrador para ambos alvo e gene de referência. Também indicar as posições das amostras. Os dados são expressos como o alvo para fazer referência a proporção de diferentes amostras dividido pelo alvo para relação de referência do calibrador. A curva padrão gerada anteriormente para um miRNA particular e do gene de limpeza é utilizado como um padrão de referência para extrapolação dos dados quantitativos para alvos miRNA de concentrações desconhecidas. </li><li> Três repetições de amostras são analisadas como um grupo e as concentrações médias e desvios-padrão da triplicata é calculado. Se um dos triplicados é inconsistente com o resto do conjunto, ele irá ser excluídos pelo programa. </li></ol> 7. Os resultados representativos &lt;p = classe &quot;jove_content&quot;&gt; Um exemplo de qPCR análise de amostras da próstata é mostrado na Figura 3. Os resultados são representados numericamente, bem como graficamente. Os gráficos que mostram os níveis de expressão do gene de referência, U6, começam a amplificação exponencial menos cerca de ciclo 20, enquanto que a expressão do gene alvo, miR-98, mostrou amplificação retardada aproximadamente no ciclo 25. Os dados deste experimento foi exportado como arquivo de texto e analisados ​​pelo software de análise RelQuant. Posições dos capilares que contêm o calibrador e as amostras são especificados. Figura 4 ilustra a forma como o calibrador é ajustado para ser 1, ea expressão de outras amostras em relação ao calibrador. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. Várias etapas miScript transcrição reversa e PCR em tempo real. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. Uma curva padrão é gerada por meio de uma série de diluições de 2 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 250 vezes, e 1250 vezes amostra original de cDNA. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Roche Molecular Software LightCycler Biochemicals mostra toda a informação do experimento graficamente e pelo texto. Quantitativas em tempo real parcelas de amplificação por PCR mostram aumento na fluorescência a partir de amostras diferentes. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig4.jpg" alt="A Figura 4"/> Dados Figura 4. Foram quantificados utilizando o software de análise RelQuant LightCycler. Normalmente, três repetições de amostras são analisadas como um grupo e amostras que produzem resultados claramente inconsistentes são excluídos e as concentrações médias e desvios-padrão da triplicata é calculado.

<ol><li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li>
<li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790(2003).</li>
<li>Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li>
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<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).</li>
<li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li>
<li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2%3AERG+fusion-positive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li>
<li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+TMPRSS2%3AERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).</li>
<li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162(2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Expressões aberrantes de alguns miRNAs foram consistentemente encontrados em tumores de próstata quando comparado com o tecido normal 10, e alguns destes miRNAs foram nomeados como potenciais novos agentes terapêuticos contra o cancro da próstata 11. Assim, os níveis de expressão aberrante de miRNAs podem ser úteis biomarcadores de diagnóstico e / ou prognóstico. A metodologia qPCR Real-Time aqui apresentado proporciona um ensaio para a quantificação precisa dos níveis de miRNA em tecidos tumorais ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do o reagente de </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Reagente de TRIzol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Kit de Transcrição em reverssa </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScript Assays Primer </td><td> Qiagen </td><td> Experiment específico </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3,5 Real-Time Sistema de PCR </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Luz Cycler Capilares </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 espectrofotômetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção microrna em tumores de próstata por quantitative pcr em tempo real (qpcr)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) são de cadeia simples, 18-24 nucleótidos de comprimento, moléculas de RNA não codificantes. Eles estão envolvidos em praticamente todos os processos celulares, incluindo o desenvolvimento 1, 2 apoptose e regulação do ciclo celular 3. MiRNAs Estima-se que regulam a expressão de 30% a 90% de genes humanos 4 por ligação aos seus RNAs alvo mensageiro (ARNm) 5. Desregulação generalizada de miRNAs tem sido relatada em várias doenças cancerosas e subtipos 6. Devido à sua prevalência e estrutura única, estas moléculas pequenas são susceptíveis de ser a próxima geração de biomarcadores, agentes terapêuticos e / ou alvos. Os métodos utilizados para investigar a expressão de miRNA incluem SYBR green eu à base de corantes, bem como Taqman-sonda qPCR base. Se miRNAs estão a ser efetivamente utilizado na prática clínica, é imperativo que a sua detecção, frescos e / ou arquivados amostras clínicas ser preciso, reprodutível e specific. qPCR tem sido amplamente utilizado para validar a expressão de miRNAs em análises do genoma inteiro, tais como estudos microarray 7. As amostras utilizadas neste protocolo eram de pacientes que foram submetidos a prostatectomia radical para o cancro da próstata clinicamente localizado, no entanto outros tecidos e linhas celulares pode ser substituído pol espécimes de próstata foram snap-congelado em azoto líquido após a ressecção. As variáveis ​​clínicas e follow-up de informação para cada paciente foram coletadas para análise posterior 8. Quantificação dos níveis de miRNA em amostras de tumores de próstata. As etapas principais da análise qPCR de tumores são: a extracção de RNA total a síntese de cDNA, e detecção de produtos de qPCR usando miRNA primers específicos. O RNA total, que inclui mRNA, miRNA, e outros pequenos RNAs foram extraídos a partir de amostras utilizando reagente Trizol. Sistema da QIAGEN miScript foi utilizado para sintetizar ADNc e realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos não são polyadenylated, portanto, durante o processo de transcrição reversa, uma polimerase de (A) poli polyadenylates o miRNA. O miRNA é utilizado como um modelo para sintetizar ADNc utilizando oligo-dT e transcriptase reversa. Uma sequência de etiqueta universal sobre a extremidade 5 &#39;de oligo-dT iniciadores facilita a amplificação de cDNA no passo de PCR. A amplificação por PCR do produto é detectado pelo nível de fluorescência emitida pelo SYBR Green, um corante que intercala em DNA de cadeia dupla. Primers específicos miRNA, juntamente com um Primer Universal que se liga à seqüência tag universal irá amplificar sequências específicas de miRNA. Os ensaios Primer miScript estão disponíveis para mais de mil humano miRNAs específicos e centenas de murino específicos miRNAs. Método de quantificação relativa foi usado aqui para quantificar a expressão de miRNAs. Para corrigir para a variabilidade entre diferentes amostras, níveis de expressão de um miRNA alvo é normalizado para os níveis de expressão de um gene de referência. A escolha de um geem que ne para normalizar a expressão de alvos é crítica na método de quantificação relativa de análise. Exemplos de genes de referência tipicamente usados ​​nesta capacidade são o RNU6B pequenos RNAs, RNU44, e RNU48 como eles são considerados ser estavelmente expressos na maior parte dos exemplos. Neste protocolo, RNU6B é usado como o gene de referência.

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

Os microRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificantes, de fita simples, com 18–24 nucleotídeos de comprimento. Eles estão envolvidos em praticamente todos os processos celulares...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar os níveis de expressão de moléculas de micro-RNA em câncer de próstata e tecido prostático normal utilizando PCR quantitativa em tempo real. Isso é alcançado primeiramente pela extração de RNA total de tecidos prostáticos. Isso inclui micro-RNA e outros RNAs pequenos.Em seguida, o RNA é transcrito reversamente para gerar cDNA. Então, é realizada uma PCR em tempo real com verde ciber utilizando o cDNA como molde para amplificar e quantificar a expressão de microRNAs em tempo real. São obtidos resultados que mostram a expressão relativa de microRNAs em diversas amostras de próstata com base na PCR quantitativa em tempo real.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos é que ela oferece alta sensibilidade, precisão, reprodutibilidade, além de ser rápida e economicamente eficaz. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área da biologia do câncer, já que a expressão de microRNAs frequentemente está correlacionada com genes fortemente envolvidos no processo cancerígeno. Podemos, portanto, utilizar a QPCR para avaliar a expressão de microRNAs e verificar como essa expressão se correlaciona com variáveis clínicas.Esses biomarcadores podem potencialmente ser utilizados como ferramentas diagnósticas e prognósticas. Eles podem nos ajudar a diagnosticar o câncer de próstata, bem como a determinar quais cânceres de próstata são agressivos. Além disso, há potencial para que esses biomarcadores atuem como agentes terapêuticos.Não apenas este método pode fornecer informações sobre a gênese do tumor de próstata, como também pode ser aplicado a outros cânceres e doenças. Colete amostras da próstata no momento da ectomia e oriente o espécime utilizando marcos anatômicos. Pinte a próstata e as vesículas seminais da seguinte maneira: lado direito verde, lado esquerdo azul.Obtenha uma seção transversal média aleatória do tecido perpendicular à superfície retal, congele a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Faça uma cópia e oriente as fatias dos espécimes, dividindo-as em quatro partes iguais. Consulte um patologista para determinar as áreas tumorais versus normais na imagem correspondente.Use as áreas marcadas como guia para identificar o tecido tumoral para extração de RNA para isolamento de RNA. Comece colocando amostras congeladas de próstata sobre gelo seco e consulte a fotocópia delimitada. Corte uma pequena porção do tumor de próstata.Homogeneíze o tecido do tumor de próstata em um mililitro do reagente triol. Incube as amostras homogeneizadas por cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione 0,2 mililitros de clorofórmio às amostras e agite vigorosamente por 15 segundos.Incube as amostras por três minutos à temperatura ambiente, em seguida, centrifugue a 12.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a fase aquosa superior incolora para tubos novos e adicione 0,5 mililitros de álcool isopropílico. Incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente, depois centrifugue a 12.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet contendo o RNA. Adicione um mililitro de etanol a 75% ao pellet de RNA, vortexe a amostra e sedimete por centrifugação durante cinco minutos a 7.500 × g a quatro graus Celsius. Novamente, aspire o SNAT e seque o pellet de RNA por cinco a dez minutos, certificando-se de que não fique completamente seco.Na cor vermelha, dissolva o pellet em água livre de nucleases e utilize um espectrofotômetro para medir a concentração do RNA. Utilize um bioanalisador para verificar a qualidade e integridade das amostras de RNA. Transcreva reversamente o RNA em CDNA utilizando um kit de transcrição reversa conforme as instruções do fabricante.Para gerar uma curva padrão, prepare uma série de diluições do CD NA original a partir de uma amostra que se sabe ter uma expressão significativa do gene de interesse. Realize a PCR em tempo real preparando uma mistura-mestra com base em um volume de reação de 20 microlitros de quant dois x. Detecte a mistura-mestra de PCR com verde ciber, 10 x primers universais microscript, 10 x ensaio de primers microscript e água livre de RN a's.Inclua dois conjuntos de primers, um para o gene alvo e outro para o gene de referência, neste caso, RNU6B. Pipete dois microlitros de cada diluição de cDNA em tubos capilares individuais para o light cycler e adicione 18 microlitros da mistura mestra. Utilize um adaptador de capilar para centrifugar. Coloque os capilares em um termociclador em tempo real baseado em capilares e execute o programa de PCR da seguinte forma: 95 graus Celsius por 15 minutos, seguido por 50 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos.55 graus Celsius por 30 segundos e 70 graus Celsius. Por 30 segundos, selecione uma amostra para ser o calibrador e defina sua quantidade normalizada de alvo como um. Compare a expressão relativa do micro RNA em todas as outras amostras com o calibrador para gerar curvas de amplificação.Para as reações de PCR, utilize o software Light Cycler versão 3.5 na aba de quantificação. Quantifique as reações e exporte os dados para um arquivo de texto. Importe os dados para o software de análise REL quant para gerar os resultados de quantificação.Importe arquivos separados para o gene alvo, gene de referência e dados da curva padrão. Especifique a posição do calibrador para o gene alvo e o gene de referência, bem como as posições das amostras. Os dados são expressos como a razão entre o alvo e a referência de diferentes amostras dividida pela razão entre o alvo e a referência do calibrador.Utilize a curva padrão previamente gerada para um microRNA específico e um gene de referência como padrão de referência para extrapolar dados quantitativos de microRNA. Alvos de concentrações desconhecidas. Analise três amostras como um grupo e calcule as concentrações médias e os desvios-padrão das triplicatas.Se um dos triplicados for inconsistente com o restante do conjunto, o programa o excluirá. Aqui é mostrado um exemplo da análise A-Q-P-C-R de amostras de próstata. Os gráficos mostram os níveis de expressão do gene de referência U seis, que inicia a amplificação exponencial por volta do ciclo 20, enquanto a expressão do gene alvo, MIR 98, apresentou amplificação retardada por volta do ciclo 25.Os dados deste experimento foram exportados como um arquivo de texto e analisados pelo software de análise requ, em que as posições dos capilares contendo o calibrador e as amostras são especificadas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia, quando executada corretamente. A confiabilidade desta técnica depende da qualidade do RNA.Portanto, é importante ter cuidado extra no manuseio de RNA porque ele pode degradar-se com muita facilidade.

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Vamos demonstrar a configuração e análise de microRNA pré-96 também matrizes para QPCR usando um robô, bem como à mão com uma pipeta multicanal Thermo Scientific Matrix.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Aqui descrevemos um protocolo simplificado para análises de expressão de microRNA (miRNA) em tecidos clínicos arquivados de câncer de próstata (CaP) fixados em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou frescos congelados empregando PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridização in situ (ISH).

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

O objetivo deste protocolo é usar a microdissecção por captura a laser como um método eficaz para isolar populações puras de tipos de células de tecidos heterogêneos da próstata para análise de RNA a jusante.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.

Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

A resistência terapêutica muitas vezes se desenvolve em pacientes com câncer de próstata avançado e, em alguns casos, o câncer progride para um subtipo letal chamado câncer de próstata neuroendócrino. Avaliar as pequenas alterações moleculares mediadas por RNA não codificadoras que facilitam essa transição permitiria uma melhor estratificação e identificação de mecanismos causais que levam ao desenvolvimento de câncer de próstata neuroendócrino.

Sequenciamento de RNA não codificador de tecidos reparados em formalina e exossomos derivados do soro de pacientes com câncer de próstata resistentes à castração

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a quantificar microRNAs em tumores de próstata por qPCR em tempo real. Este método permite analisar múltiplos microRNAs simultaneamente com alta sensibilidade e precisão para pesquisa em oncologia.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

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