Name: Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Aprenda a isolar células supressoras derivadas de mieloides (MDSC) de baços de camundongos usando citometria de fluxo e separação magnética automatizada AutoMACS. Este método rápido enriquece leucócitos Gr-1+ viáveis para estudos imunológicos in vivo e in vitro.

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Reconhecemos o fluxo USF Facilidade Núcleo Citometria. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Denise Cooper para a partilha de recursos. Gostaríamos também de agradecer a Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour por sua assistência na criação e filmagens deste vídeo. NN suportado pela NSF FG-LSAMP Ponte para o Doutorado Fellowship HRD # 0929435. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional # 93-032-13/Moffitt Cancer Center, atribuído ao TG.

Antes da partida, preparar as seguintes soluções: 3% de coloração Media (SM): -3% De soro fetal bovino (FBS) em 1X tampão fosfato salino (PBS) MACS buffer (MB): - 0,5% de albumina de Soro Bovino (BSA) em 1XPBS 1. Os baços de colheita de Ratos <ol><li> Por via subcutânea injectar 6-8 semanas de idade C57BL / 6 machos (Harlan) com 1,5 x 10 5 murinos Panc02 células em suspensão em 100 uL de PBS 1x (tumor de rolamento; TB). Camundongos controle (Naïve) recebem 100 1XPBS ul. </li><li> Cerca de 4 semanas pós-injeção, eutanásia ratos por asfixia dióxido de carbono. </li><li> Colheita baços de camundongos por dissecção romba com pinça e tesoura, em seguida, pesar com uma balança. Baços Coloque em separado, chamado tubos de 50 ml cônicos contendo 1 x PBS. </li></ol> 2. Gerar um suspensio de uma única célulan de leucócitos de baços Todos os procedimentos devem ser realizadas em um ambiente estéril sob uma capa de segurança biológica e as células e os anticorpos mantidos em gelo. <ol><li> Montar a célula de dissociação peneira, inserindo a tela de malha para dentro da abertura da taça para o fundo. Em seguida, insira o anel de retenção para a área de rosca com o lado da fenda e usar o anel de chave para apertar o anel de retenção, mantendo desta forma a tela no lugar. Coloque a peneira montado numa placa de Petri contendo 10 ml de 1 x PBS. </li><li> Baços de piscina e pilão de vidro utilização para moer baços contra a tela de malha de célula de dissociação peneira e para dentro da placa de Petri. Repetir para cada grupo de tratamento de ratinhos. </li><li> Suspensão de células de filtro para um tubo cónico de 50 ml usando um filtro de 70 pm e uma célula pipeta de 5 ml serológico. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 1 x ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos por baço. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Parar a reacção por adição de 20 ml de 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 ml estéril 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. </li><li> Contar as células utilizando azul de tripano e um hemacitómetro e ressuspender em concentração desejada em SM 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml). </li></ol> 3. Superfície celular de coloração / Imunofenotipagem de MDSC por citometria de fluxo <ol><li> Rotular os poços de uma placa de fundo 96-V bem para o controlo e as amostras experimentais e manchas únicas para os controlos de compensação (nenhuma mancha, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC e DAPI). </li><li> Adicionar 5x10 5-1x10 6 células equivalentes a 50 uL / poço de esplenócitos para os seus respectivos poços na placa de 96 poços de fundo em V. Centrifugarem placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. </li><li> Preparar &quot;Mix Master&quot; (MM) do rato BD Fc Block (Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal) diluída em SM 3%, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo. Como ponto de partida, usar 1 ug Bloco Fc em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V por rapidamente invertendo a placa sobre e para trás, ao longo de um recipiente de resíduos ou pia sem interrupção dos peletes celulares. </li><li> Vortex, brevemente centrifugar Fc MM Bloco durante 5 segundos e adicionar 50 uL a todos os peletes na placa de 96 poços de fundo em V. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, deixando amostras em seus poços. Incubar placa durante 15 min no escuro em gelo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. </li><li> Preparar &quot;Mix Master&quot; (MM) de fluorocromo-anticorpos diluídos em SM 3% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo, enquanto as amostras incubar com o Bloco Fc. Anticorpos deve ser tituladapara determinar diluições óptimas para a coloração de procedimentos. Como ponto de partida, combinar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC e diluição 1:20 de Gr-1-APC em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço de amostra. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente. </li><li> Vortex, brevemente centrifugar MM de anticorpos fluorescente-conjugados de coloração durante 5 segundos e adicionar 50 uL de controlo e de peletes experimentais. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Para uma única mancha compensações, adicionar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC, diluição 1:20 de Gr-1-APC e 75 ng / ml de DAPI, em SM 3% para um volume final de 50 uL por poço para os seus respectivos poços. Adicionar 50 ul SM 3% a imaculada bem (não mancha). Misturar bem e incubar as células na placa de 96 poços de fundo em V durante 30 min no escuro em gelo. </li><li> Tubos de etiquetas FACS (5 ml, 12 mm x 75 mm de poliestireno tubos de fundo redondo) para corresponder a cada poço na placa de 96 poços de fundo em V. Adicionar 200 uL SM 3% a cada um FACStubo. </li><li> Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e remover os sobrenadantes. Lave pelotas pela adição de 100 ul SM 3% a cada pellet e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. Repita o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente. Ressuspender cada sedimento em 100 SM ul 3% e misture bem. </li><li> Transferir 100 uL sedimento ressuspenso a partir de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V à sua tubo FACS respectivamente rotulado. </li><li> Antes da análise de fluxo de citometria, adicionar 75 ng / ml DAPI para controlar e as amostras experimentais e de controlo de compensação DAPI única mancha. </li><li> Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de percentagens MDSC. Execute a compensação usando o negativo (nenhum controlo mancha) e os controlos positivos individuais. Configurar um gráfico de pontos que mostra a dispersão frontal (FSC) versus lateral (SSC) em escala logarítmica, para que populações de leucócitos deinteresse pode ser identificada. Desenhe um grande portão em todos os leucócitos, excluindo detritos e aglomerados com menor dispersão para a frente e lateral. A partir deste portão principal, criar um novo gráfico de pontos que exibe SSC contra DAPI e DAPI em porta (ao vivo) células. Seleccionar esta população recém-gated e criar um gráfico de pontos que exibe Mac-1 versus Gr-1 e portão no seu positiva dupla (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Enriquecimento magnético de GR-1 + Leucócitos <ol><li> Alíquotas 1x10 7 restantes leucócitos não coradas em tubos adequadamente marcados FACS e centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. </li><li> Preparar MM de Gr-1-PE anticorpo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:10 de Gr-1-PE anticorpo em 50 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro. </li&gt; <li> Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante. </li><li> Preparar MM de Anti-PE micropérolas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:4 de anti-PE micropérolas em 200 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender o granulado em 3 ml de SB. Filtrar através de uma peneira iM 70 para um novo tubo ml, rotulados 50 cónico. </li><li> Prepare-se e prepare Auto MACS Separador Pro. Recarga de todos os frascos com as soluções adequadas e esvaziar o depósito de resíduos, se necessário. Vire instrumento e examinar o status de recipientes de fluido e de coluna (s) após a inicialização. Todos os símbolos devem ser verdes. No menu, selecione &quot;separação&quot; do superiorbarra de menu, seguido de &quot;Lavar Agora&quot; na barra de menu inferior. Selecione &quot;Lavar&quot; a partir da opção pop-up, seguido de &quot;Executar&quot; para iniciar o processo de preparação. Uma vez que o processo de priming é concluída com êxito, o instrumento, então, mostrar que é &quot;Ready for Separation&quot; no menu Status. </li><li> Escolha suporte de tubos refrigerados adequado para tamanhos de tubos e coloque 50 ml de tubo cônico com células marcadas magneticamente na linha A, 50 ml tubo cônico de coleta de fração negativa na linha B e 15 ml tubo cônico para a coleta de fração positiva na linha C. </li><li> Escolha &quot;POSSEL_S&quot; programa de separação de células para seleção positiva de células alvo marcadas no modo sensível a partir de amostras. Células alvo magneticamente marcadas são retidos na coluna automáticos; células não marcadas são libertados para o tubo de recolha negativo fracção em B. Em linha de retracção automática do magneto, as células alvo marcadas irá ser libertado para o tubo de recolha positiva na linha C do tubo rack. </li></ol>Leucócitos + enriquecidos <ol><li> Recontagem Gr-1 + e Gr-1 - frações utilizando Trypan Blue e um hemocitômetro. Ressuspender as células em concentração desejada em meio de coloração com 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml) e transferir 50 uL para tubos correspondentemente rotulados FACS. </li><li> Prepara-se uma MM de Mac-1 só, a uma diluição 1:25 em SM 3% para um volume final de 50 uL por amostra. Corar as células e preparar individuais compensações mancha de Gr-PE, Mac-1 FITC e DAPI para análise de citometria de fluxo. Adicionar 200 uL SM 3% e DAPI corante de viabilidade, como descrito anteriormente. </li><li> Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de determinar Gr-1 + e Gr-1 - Percentagens e também para comparar as proporções MDSC enriquecimento pré-e pós-autoMACS. </li></ol> 6. Os resultados representativos Aqui nós mostramos r<html> resultados epresentative para autoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos a partir do conjunto, baço ingénuas para FACS subsequentes de triagem de MDSC (Figura 1). 1x10 6 leucócitos naive foram coradas com Mac-1-FITC e Gr-1-APC anticorpos para identificar percentagens MDSC usando um instrumento BD LSRII, antes de triagem autoMACS. 1x10 7 leucócitos naive foram então coradas com anti-Gr-1-PE anticorpos e PE-micropérolas para o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos utilizando um autoMACS Separator Pro. Pós-autoMACS enriquecimento, Gr-1 percentagens em Gr-1 + e Gr-1 - fracções recolhidas foram avaliados usando citometria de fluxo. 1x10 6 Gr-1 + leucócitos foram removidas e coradas com Mac-1-FITC de anticorpos para avaliar e comparar percentagens MDSC de enriquecido, pooled leucócitos virgens de não enriquecido, reunidas portadores de tumor leucócitos por citometria de fluxo. fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Enriquecimento AutoMACS de Naïve Gr-1 + leucócitos para FACS MDSC Ordenação. Os baços foram colhidas a partir de ratos portadores de tumor pancreático e ingénuos e transformados em suspensões de célula única. Análise de citometria de fluxo de superfície de leucócitos ingénuo coradas com Mac-1 e Gr-1 fluorescente anticorpos conjugados, antes de autoMACS enriquecimento (A). Análise de citometria de fluxo de Gr-1 + (B) e Gr-1 - (C) As fracções de enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto leuckocytes naive coradas com Gr-1-PE anticorpos e anti-PE micropérolas. Análise por citometria de fluxo de MDSC e Gr-1 + percentagens enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto de leucócitos ingênuo (D) em comparação aos não enriquecidos leucócitos obtidos a partir de camundongos portadores de tumor (E) (ratos ingênuos, n = 5 ; camundongos portadores de tumor, n = 3). MDSC e Gr-1 percentagens são fechado nos gráficos de contorno representativas e histogramas.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos 4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos 5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de 14 e purificação de células T CD8 +</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> REAGENTE </td><td> EMPRESA </td><td> Catalogo </td><td> COMENTÁRIOS </td></tr><tr><td> Fosfato 1X Tampão Salina </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / Vermelho de Fenol-livre </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Deixe BSA dissolver imperturbável em PBS; ambiente estéril </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Inativados pelo calor; ambiente estéril </td></tr><tr><td> Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal (Fc Block) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> Anti-ratinho CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> EstérilAmbiente </td></tr><tr><td> Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> Anti-ratinho Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Ambiente de Diluição Estéril </td></tr><tr><td> A dissociação de células Sieve </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> Autoclave antes do uso </td></tr><tr><td> 70 m de filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> 1X Tampão de Lise RBC </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Aquecer até à temperatura ambiente antes da utilização; ambiente estéril </td></tr><tr><td> As placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> 50ml contubos ical </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm de poliestireno de fundo tubos redondos </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Conhecido como tubos FACS; ambiente estéril </td></tr><tr><td> 96 poços de fundo em V placas </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> PE micro </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Ambiente estéril </td></tr><tr><td> AutoMACS Separador Pro </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> Colunas AutoMACS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS tampão de corrida </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

preparação de mielóides derivadas de células supressoras (mdsc) de ingênuos e pâncreas tumor-rolamento ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro 1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície 7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive 7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão 11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis ​​MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo. Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos 13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados ​​em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro </in&gt; ensaios.

Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucócitos a partir de baços de rato. Este método utiliza a citometria de fluxo e Cell AutoMACS classificação para enriquecer para viável Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucócitos anteriores FACS de triagem de MDSC para uso<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaios.

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

As MDSCs são uma população heterogênea de macrófagos imaturos, células dendríticas e granulócitos que se acumulam em órgãos linfoides em condições patológicas...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar rapidamente uma população enriquecida de leucócitos positivos para GR1 contendo células supressoras derivadas de mieloides viáveis, ou MDSCs, a partir de baços de camundongos, para uso em ensaios in vivo e in vitro. Primeiro, baços de vários camundongos são agrupados e processados para gerar uma suspensão simples de células. Para quantificar a porcentagem de MDSCs antes do enriquecimento, uma pequena alíquota das células agrupadas é transferida para uma placa de fundo em V de 96 poços.Os antígenos de superfície MAC um e GR um são marcados e as células marcadas são transferidas para tubos FACS para análise por citometria de fluxo. Os leucócitos restantes em pool são corados com um anticorpo conjugado a um fluorocromo contra GR um e incubados com microesferas magnéticas, que se ligam ao fluorocromo no anticorpo anti-GR um. As populações GR um positivas e GR um negativas são então separadas usando um separador AutoMax pro para avaliar o sucesso do enriquecimento de GR um na população.Uma pequena alíquota é coletada e analisada quanto à expressão de GR um e MAC um para avaliar as porcentagens de MDSC. A comparação dos dados resultantes de imunofenotipagem demonstra um aumento nas porcentagens de MDSC na população de leucócitos enriquecida para GR um em comparação com a população não enriquecida. Além disso, há um aumento nos MDSC ingênuos, gerando uma população comparável aos MDSC de animais com tumor.A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a coloração convencional em fluxo e a triagem baseada em citometria de fluxo de alta velocidade de M DSCs a partir de tecidos linfoides, é que a nossa técnica de mistura mestra evita variações significativas nos nossos resultados, garantindo uma coloração superficial igual de leucócitos em pool, tipagem forense e triagem AutoMax de m DSCs e células positivas para GR um, respectivamente. O procedimento será demonstrado por Nadine Nelson, aluna de pós-graduação do nosso laboratório, e pela Dra. Haw sra, diretora da infraestrutura central de citometria de fluxo da USF. O procedimento a seguir deve ser realizado em ambiente estéril sob capela de segurança biológica, mantendo as células e os anticorpos sobre gelo.Sempre que possível, monte a peneira de dissociação celular inserindo a tela de malha na abertura do copo em direção ao fundo. Em seguida, insira o anel de retenção na área roscada com o lado ranhurado para cima e use a chave do anel para apertar firmemente o anel de retenção e fixar a tela. Coloque a peneira montada em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de uma solução tampão XPBS.Baços retirados de camundongos C57 black six, com tumores ou controles ingênuos, com idade entre seis e oito semanas, são colocados na tela de malha da peneira de dissociação celular. Em seguida, utilize um pistilo de vidro para moer os baços através da tela de malha para dentro da placa de Petri. Repita este processo para cada grupo de tratamento de camundongos.Em seguida, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros, aplique a suspensão celular em uma peneira celular de 70 micrômetros e permita que filtre para dentro de um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet adicionando cinco mililitros de tampão de lise de hemácias por baço e pipetando vigorosamente para cima e para baixo. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, interrompa a reação adicionando 20 mililitros de PBS e pipetando vigorosamente para cima e para baixo.Em seguida, centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos, remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de PBS estéril e conte as células. Usando azul de tripano e um hemocitômetro, ressuspenda as células em uma concentração de 1 × 10⁷ a 2 × 10⁷ células por mililitro em meio de coloração a 3%. A obtenção de uma coloração ideal é o aspecto mais difícil deste procedimento.Isso pode ser realizado com sucesso por meio da titulação de anticorpos previamente. Utilize a preparação de misturas-mestras e a marcação da superfície em pequenos volumes conforme descrito neste protocolo. Para marcar as células para análise por citometria de fluxo, identifique os poços de uma placa de 96 poços vbo para amostras controle e experimentais e marcações individuais.Para controles de compensação, adicione cinco vezes 10 à quinta até uma vez 10 à sexta células em 50 microlitros para cada um dos poços rotulados. Em seguida, centrifugue a placa a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos após a centrifugação. Visualize a placa por baixo.Olhando para cima para garantir que os pellets estejam presentes nas cavidades, prepare uma mistura mestra do bloqueador BDFC de camundongo contendo o anticorpo monoclonal anti-CD1632 de rato diluído em meio de coloração a 3% em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL sobre gelo, usando vórtex. Em seguida, centrifugue brevemente por cinco segundos, segurando a placa de 96 poços com fundo em V sobre um recipiente de resíduos ou pia. Inverta rapidamente a placa e retorne-a imediatamente para remover o sobrenadante sem perturbar os pellets celulares.Em seguida, adicione 50 microlitros da mistura mestra do bloqueador FC a todos os pellets na placa de fundo V de 96 poços, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Coloque a placa no gelo e incube por 15 minutos no escuro. Centrifugue a placa a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Prepare uma mistura mestra dos anticorpos Mac um fitzy e GR um A PC diluídos em meio de coloração a 3% em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo.Vortexie brevemente e centrifugue por cinco segundos. Após a centrifugação, inverta a placa para remover o sobrenadante de cada poço e, em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos aos pellets controle ou experimentais. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Para compensações de coloração simples, adicione 50 microlitros de MAC diluído um F GR um A PC ou DPI em meio de coloração a 3% nos poços apropriados. Para o controle sem coloração, adicione 50 microlitros do meio de coloração a 3% no poço apropriado e misture.Em seguida, incube a placa por 30 minutos no escuro sobre gelo. Durante a incubação, rotule tubos fax de modo que correspondam a cada poço da placa e adicione 200 microlitros de meio de coloração a 3% a cada tubo fax. Após o tempo de incubação de 30 minutos, centrifugue a placa a 250 a 300 ×g por cinco minutos.Após a centrifugação, remova os sobrenadantes como antes. Em seguida, lave os pellets adicionando 100 microlitros de meio de coloração a 3% a cada pellet. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.Centrifugue a placa novamente por cinco minutos. Repita, lave, mais uma vez após a centrifugação, remova o sobrenadante como antes e reconstitua cada pellet em 100 microlitros de meio de coloração a 3%, misturando bem. Em seguida, transfira 100 microlitros das células reconstituídas de cada poço da placa para o tubo de ensaio respectivamente rotulado.Em seguida, adicione 75 nanogramas por mililitro de DPI às amostras controle e experimentais e ao controle de compensação de coloração simples de DPI. Adquira os dados citométricos para determinar as porcentagens de MDSC conforme descrito no documento anexo. Para enriquecer os leucócitos positivos para GR1, alíquota uma vez 10 à sétima dos leucócitos remanescentes não corados em tubos de feno adequadamente rotulados e centrifugue-os a 250–300 ×g durante cinco minutos. Adicione 50 microlitros de uma diluição 1:10 do anticorpo GR1 conjugado com PE em tampão Max e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Após a incubação, adicione dois mililitros de tampão máx a cada tubo fax e centrifugue a 250 a 300 ×g por cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de uma diluição de um para quatro de microesferas anti-PE em tampão máx a cada tubo e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Adicione dois mililitros de tampão máximo a tubos fax e centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, re-suspenda o pellet em três mililitros de tampão de coloração, filtrando por uma peneira de 70 mícrons para um novo tubo cônico de 50 mililitros rotulado. Neste protocolo, estamos utilizando separação magnética automática.A separação magnética é uma excelente opção de método. Se você precisar separar um grande número de células rapidamente e de forma economicamente viável, e com base em um marcador de superfície, certifique-se de verificar seus resultados ao final com citometria de fluxo. Para preparar e condicionar o separador AutoMax pro, certifique-se de que todos os frascos estejam preenchidos com as soluções apropriadas.Ligue o instrumento. Em seguida, após a inicialização, verifique o status dos recipientes de fluido e das colunas. Todos os símbolos devem estar verdes.A seguir, no menu, selecione separação na barra de menu superior, seguido por lavagem. Agora, na barra de menu inferior, selecione enxágue na opção pop-up, seguido por executar para iniciar o processo de escorva. Uma vez que o processo de escorva seja concluído com sucesso, o instrumento exibirá que está pronto para a separação.No menu de status, coloque o tubo cônico de 50 mililitros com células marcadas magneticamente na linha A de um suporte para tubos refrigerado de tamanho apropriado. Em seguida, coloque um tubo cônico de 50 mililitros para coleta da fração negativa na linha B e um tubo cônico de 15 mililitros para coleta da fração positiva na linha C. Escolha o programa de separação de células POS S célula para seleção positiva de células-alvo marcadas no modo sensível a partir das amostras. Quando o programa iniciar, as células-alvo marcadas magneticamente serão retidas na coluna AutoMax, enquanto as células não marcadas serão liberadas para o tubo de coleta da fração negativa na linha B. Em seguida, o ímã será recolhido e as células-alvo marcadas serão liberadas para o tubo de coleta positiva na linha C do suporte para tubos.Após o enriquecimento, utilize azul de tripan e um hemocitômetro para recontar as frações GR1 positivas e GR1 negativas. Em seguida, ressuspenda as células em 1 × 10⁷ células por mililitro a 2 × 10⁷ células por mililitro em meio de coloração a 3% e transfira 50 microlitros para tubos FACS previamente rotulados. Incube as células com MAC1 e corante de viabilidade DPI para citometria de fluxo e compensações de coloração simples.Realize a aquisição de dados por citometria de fluxo para determinar as porcentagens de células GR1 positivas e GR1 negativas e também para comparar as porcentagens de MDSCs antes e após o AutoMax e o enriquecimento. Baços foram coletados de camundongos com tumor pancreático e camundongos ingênuos e processados em suspensões de células simples conforme descrito neste artigo em vídeo. A citometria de fluxo foi realizada para analisar leucócitos ingênuos corados na superfície com anticorpos fluorescentes conjugados contra MAC1 e GR1, conforme mostrado aqui. Apenas uma porcentagem muito baixa, 1,19%, de MDSCs duplo-positivos para MAC1 e GR1 foi observada antes do enriquecimento com AutoMax. No entanto, após o enriquecimento da população GR1 positiva, essa subpopulação celular tornou-se significativamente maior, 10,5% a partir de camundongos ingênuos, e agora é comparável a 25,3% a partir de camundongos com tumor.Após este procedimento, outros métodos, incluindo MDSC acelerada, triagem por citometria de fluxo com experimentos de transferência in vivo, PCR quantitativa em tempo real e western blotting, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os mecanismos moleculares responsáveis pela expansão, migração e diferenciação de MDSC, bem como pela sua supressão das respostas imunes.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para o isolamento de populações altamente purificados de leucócitos que infiltram tumores. Este protocolo é adaptado a partir do Biotech Miltenyi protocolo para aumentar o rendimento e grau de pureza para o isolamento de células a partir de tecido de tumor complexo.

Isolamento de células imunes de tumores primários

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Um método preciso e prático para medir parâmetros como a tensão no tecido do miocárdio é de grande valor clínico, uma vez que tem sido demonstrado, que a tensão é um marcador mais sensível e mais cedo para a disfunção contrátil do que o parâmetro freqüentemente usado EF.

Avaliação Strain Ressonância Magnética Derivado do Miocárdio Usando o controle de recursos

A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada...

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Aprenda a isolar células supressoras derivadas de mieloides (MDSC) de baços de camundongos usando citometria de fluxo e separação magnética automatizada AutoMACS. Este método rápido enriquece leucócitos Gr-1+ viáveis para estudos imunológicos in vivo e in vitro.

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS) (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

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