Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar rapidamente uma população enriquecida de leucócitos positivos para GR1 contendo células supressoras derivadas de mieloides viáveis, ou MDSCs, a partir de baços de camundongos, para uso em ensaios in vivo e in vitro. Primeiro, baços de vários camundongos são agrupados e processados para gerar uma suspensão simples de células. Para quantificar a porcentagem de MDSCs antes do enriquecimento, uma pequena alíquota das células agrupadas é transferida para uma placa de fundo em V de 96 poços.

Os antígenos de superfície MAC um e GR um são marcados e as células marcadas são transferidas para tubos FACS para análise por citometria de fluxo. Os leucócitos restantes em pool são corados com um anticorpo conjugado a um fluorocromo contra GR um e incubados com microesferas magnéticas, que se ligam ao fluorocromo no anticorpo anti-GR um. As populações GR um positivas e GR um negativas são então separadas usando um separador AutoMax pro para avaliar o sucesso do enriquecimento de GR um na população.

Uma pequena alíquota é coletada e analisada quanto à expressão de GR um e MAC um para avaliar as porcentagens de MDSC. A comparação dos dados resultantes de imunofenotipagem demonstra um aumento nas porcentagens de MDSC na população de leucócitos enriquecida para GR um em comparação com a população não enriquecida. Além disso, há um aumento nos MDSC ingênuos, gerando uma população comparável aos MDSC de animais com tumor.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a coloração convencional em fluxo e a triagem baseada em citometria de fluxo de alta velocidade de M DSCs a partir de tecidos linfoides, é que a nossa técnica de mistura mestra evita variações significativas nos nossos resultados, garantindo uma coloração superficial igual de leucócitos em pool, tipagem forense e triagem AutoMax de m DSCs e células positivas para GR um, respectivamente. O procedimento será demonstrado por Nadine Nelson, aluna de pós-graduação do nosso laboratório, e pela Dra. Haw sra, diretora da infraestrutura central de citometria de fluxo da USF. O procedimento a seguir deve ser realizado em ambiente estéril sob capela de segurança biológica, mantendo as células e os anticorpos sobre gelo.

Sempre que possível, monte a peneira de dissociação celular inserindo a tela de malha na abertura do copo em direção ao fundo. Em seguida, insira o anel de retenção na área roscada com o lado ranhurado para cima e use a chave do anel para apertar firmemente o anel de retenção e fixar a tela. Coloque a peneira montada em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de uma solução tampão XPBS.

Baços retirados de camundongos C57 black six, com tumores ou controles ingênuos, com idade entre seis e oito semanas, são colocados na tela de malha da peneira de dissociação celular. Em seguida, utilize um pistilo de vidro para moer os baços através da tela de malha para dentro da placa de Petri. Repita este processo para cada grupo de tratamento de camundongos.

Em seguida, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros, aplique a suspensão celular em uma peneira celular de 70 micrômetros e permita que filtre para dentro de um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet adicionando cinco mililitros de tampão de lise de hemácias por baço e pipetando vigorosamente para cima e para baixo. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, interrompa a reação adicionando 20 mililitros de PBS e pipetando vigorosamente para cima e para baixo.

Em seguida, centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos, remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de PBS estéril e conte as células. Usando azul de tripano e um hemocitômetro, ressuspenda as células em uma concentração de 1 × 10⁷ a 2 × 10⁷ células por mililitro em meio de coloração a 3%. A obtenção de uma coloração ideal é o aspecto mais difícil deste procedimento.

Isso pode ser realizado com sucesso por meio da titulação de anticorpos previamente. Utilize a preparação de misturas-mestras e a marcação da superfície em pequenos volumes conforme descrito neste protocolo. Para marcar as células para análise por citometria de fluxo, identifique os poços de uma placa de 96 poços vbo para amostras controle e experimentais e marcações individuais.

Para controles de compensação, adicione cinco vezes 10 à quinta até uma vez 10 à sexta células em 50 microlitros para cada um dos poços rotulados. Em seguida, centrifugue a placa a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos após a centrifugação. Visualize a placa por baixo.

Olhando para cima para garantir que os pellets estejam presentes nas cavidades, prepare uma mistura mestra do bloqueador BDFC de camundongo contendo o anticorpo monoclonal anti-CD1632 de rato diluído em meio de coloração a 3% em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL sobre gelo, usando vórtex. Em seguida, centrifugue brevemente por cinco segundos, segurando a placa de 96 poços com fundo em V sobre um recipiente de resíduos ou pia. Inverta rapidamente a placa e retorne-a imediatamente para remover o sobrenadante sem perturbar os pellets celulares.

Em seguida, adicione 50 microlitros da mistura mestra do bloqueador FC a todos os pellets na placa de fundo V de 96 poços, misturando suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Coloque a placa no gelo e incube por 15 minutos no escuro. Centrifugue a placa a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Prepare uma mistura mestra dos anticorpos Mac um fitzy e GR um A PC diluídos em meio de coloração a 3% em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo.

Vortexie brevemente e centrifugue por cinco segundos. Após a centrifugação, inverta a placa para remover o sobrenadante de cada poço e, em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos aos pellets controle ou experimentais. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo. Para compensações de coloração simples, adicione 50 microlitros de MAC diluído um F GR um A PC ou DPI em meio de coloração a 3% nos poços apropriados. Para o controle sem coloração, adicione 50 microlitros do meio de coloração a 3% no poço apropriado e misture.

Em seguida, incube a placa por 30 minutos no escuro sobre gelo. Durante a incubação, rotule tubos fax de modo que correspondam a cada poço da placa e adicione 200 microlitros de meio de coloração a 3% a cada tubo fax. Após o tempo de incubação de 30 minutos, centrifugue a placa a 250 a 300 ×g por cinco minutos.

Após a centrifugação, remova os sobrenadantes como antes. Em seguida, lave os pellets adicionando 100 microlitros de meio de coloração a 3% a cada pellet. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.

Centrifugue a placa novamente por cinco minutos. Repita, lave, mais uma vez após a centrifugação, remova o sobrenadante como antes e reconstitua cada pellet em 100 microlitros de meio de coloração a 3%, misturando bem. Em seguida, transfira 100 microlitros das células reconstituídas de cada poço da placa para o tubo de ensaio respectivamente rotulado.

Em seguida, adicione 75 nanogramas por mililitro de DPI às amostras controle e experimentais e ao controle de compensação de coloração simples de DPI. Adquira os dados citométricos para determinar as porcentagens de MDSC conforme descrito no documento anexo. Para enriquecer os leucócitos positivos para GR1, alíquota uma vez 10 à sétima dos leucócitos remanescentes não corados em tubos de feno adequadamente rotulados e centrifugue-os a 250–300 ×g durante cinco minutos. Adicione 50 microlitros de uma diluição 1:10 do anticorpo GR1 conjugado com PE em tampão Max e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

Após a incubação, adicione dois mililitros de tampão máx a cada tubo fax e centrifugue a 250 a 300 ×g por cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de uma diluição de um para quatro de microesferas anti-PE em tampão máx a cada tubo e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

Adicione dois mililitros de tampão máximo a tubos fax e centrifugue a 250 a 300 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, re-suspenda o pellet em três mililitros de tampão de coloração, filtrando por uma peneira de 70 mícrons para um novo tubo cônico de 50 mililitros rotulado. Neste protocolo, estamos utilizando separação magnética automática.

A separação magnética é uma excelente opção de método. Se você precisar separar um grande número de células rapidamente e de forma economicamente viável, e com base em um marcador de superfície, certifique-se de verificar seus resultados ao final com citometria de fluxo. Para preparar e condicionar o separador AutoMax pro, certifique-se de que todos os frascos estejam preenchidos com as soluções apropriadas.

Ligue o instrumento. Em seguida, após a inicialização, verifique o status dos recipientes de fluido e das colunas. Todos os símbolos devem estar verdes.

A seguir, no menu, selecione separação na barra de menu superior, seguido por lavagem. Agora, na barra de menu inferior, selecione enxágue na opção pop-up, seguido por executar para iniciar o processo de escorva. Uma vez que o processo de escorva seja concluído com sucesso, o instrumento exibirá que está pronto para a separação.

No menu de status, coloque o tubo cônico de 50 mililitros com células marcadas magneticamente na linha A de um suporte para tubos refrigerado de tamanho apropriado. Em seguida, coloque um tubo cônico de 50 mililitros para coleta da fração negativa na linha B e um tubo cônico de 15 mililitros para coleta da fração positiva na linha C. Escolha o programa de separação de células POS S célula para seleção positiva de células-alvo marcadas no modo sensível a partir das amostras. Quando o programa iniciar, as células-alvo marcadas magneticamente serão retidas na coluna AutoMax, enquanto as células não marcadas serão liberadas para o tubo de coleta da fração negativa na linha B. Em seguida, o ímã será recolhido e as células-alvo marcadas serão liberadas para o tubo de coleta positiva na linha C do suporte para tubos.

Após o enriquecimento, utilize azul de tripan e um hemocitômetro para recontar as frações GR1 positivas e GR1 negativas. Em seguida, ressuspenda as células em 1 × 10⁷ células por mililitro a 2 × 10⁷ células por mililitro em meio de coloração a 3% e transfira 50 microlitros para tubos FACS previamente rotulados. Incube as células com MAC1 e corante de viabilidade DPI para citometria de fluxo e compensações de coloração simples.

Realize a aquisição de dados por citometria de fluxo para determinar as porcentagens de células GR1 positivas e GR1 negativas e também para comparar as porcentagens de MDSCs antes e após o AutoMax e o enriquecimento. Baços foram coletados de camundongos com tumor pancreático e camundongos ingênuos e processados em suspensões de células simples conforme descrito neste artigo em vídeo. A citometria de fluxo foi realizada para analisar leucócitos ingênuos corados na superfície com anticorpos fluorescentes conjugados contra MAC1 e GR1, conforme mostrado aqui. Apenas uma porcentagem muito baixa, 1,19%, de MDSCs duplo-positivos para MAC1 e GR1 foi observada antes do enriquecimento com AutoMax. No entanto, após o enriquecimento da população GR1 positiva, essa subpopulação celular tornou-se significativamente maior, 10,5% a partir de camundongos ingênuos, e agora é comparável a 25,3% a partir de camundongos com tumor.

Após este procedimento, outros métodos, incluindo MDSC acelerada, triagem por citometria de fluxo com experimentos de transferência in vivo, PCR quantitativa em tempo real e western blotting, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os mecanismos moleculares responsáveis pela expansão, migração e diferenciação de MDSC, bem como pela sua supressão das respostas imunes.