Name: Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a colher macrófagos alveolares murinos e avaliar sua ativação por nanopartículas polianidrido usando citometria de fluxo. Este método permite estudar modulação imune em modelos pulmonares.

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Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para apoio financeiro e Shawn Dr. Rigby pela Universidade do Estado Iowa Facilidade de Citometria de Fluxo para sua assistência técnica especializada.

1. Colheita macrófagos alveolares (AMɸ) do mouse usando lavagem pulmonar <ol><li> Use equipamento de proteção individual (EPI), tais como jaleco, luvas descartáveis, e proteção ocular adequada. </li><li> Prepare completa AMɸ (cAMɸ) médio antes do início da colheita. Adicionar 2,5 mL de penicilina / estreptomicina (pen / strep) solução, 250 uL de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), e 25 mL de calor de soro fetal inactivado bovino (FBS) a 222,25 ml de Modificado Dulbelcco de Eagle Médium (DMEM). Filtro-esterilizar cAMɸ média usando um 0,2 uM de poro de tamanho filtro superior garrafa sob vácuo. </li><li> Euthanize um rato saudável por asfixia CO 2 em uma câmara de eutanásia. Embora um rato C57BL / 6 (6-8 semanas de idade) foi utilizado para os fins do presente projecto, esta técnica de lavagem pulmonar pode ser realizada em qualquer estirpe de rato. Usando um cilindro de gás comprimido, deixe o fluxo de gás para a câmara de 1 min antes de colocar o mouse na châmbar para assegurar que a câmara está totalmente carregada com CO 2. Colocar o rato na câmara por pelo menos um minuto a eutanásia no rato. Além disso, desangrar cada rato através de punção cardíaca como um método físico para confirmar a morte do rato como descrito em 1.4. </li><li> Lay rato na sua parte traseira (lado dorsal), spray com etanol a 70%, localizar o esterno e, a um ângulo de 30 graus a partir do abdómen, inserir uma agulha de calibre 23 (ligada a uma seringa de 1 mL) cerca de 50 mm para dentro da cavidade torácica . Com a colocação adequada da agulha, que deveria ser possível recolher entre 0,4 a 1 mL de sangue, dependendo do tamanho do rato. Examine o animal para a cessação dos sinais vitais. </li><li> Lugar do mouse sobre bancada do laboratório para que ele esteja mentindo sobre o seu abdome (lado ventral). Pulverização do rato com etanol a 70% para esterilizar o ambiente de trabalho. Belisque a pele da metade para baixo da coluna do mouse. Com uma tesoura de dissecção que foram esterilizadas com etanol 70%, fazer uma pequena incisão através da pele. &lt;/ Li&gt; <li> Agarrar a pele em ambos os lados da incisão e puxar a pele em direcções opostas ao longo do eixo crânio-caudal do rato. Quando feito correctamente, a pele irá ser removido da carcaça subjacente. </li><li> O pescoço do mouse deve agora mostrar músculos expostos e glândulas. Corte com cuidado o tecido e puxe-o para o anterior do mouse com a pinça, expondo assim a laringe, traquéia, esôfago e do mouse. Evitar o corte da veia jugular ou da artéria carótida. </li><li> A traqueia é agora visível e é identificável como o tecido com anéis cartilaginosos em torno dele. Delicadamente segurar a traqueia com uma pinça e suavemente levantar e separar a traqueia a partir do esófago, que está localizado no lado dorsal. </li><li> Fazer uma pequena incisão anterior para onde um detém a traqueia, mas posterior para a laringe. A incisão deve ser feita a cerca de ângulo de 45 °. Além disso, não completamente transect a traquéia, pois isso irá impedi-lo de retracção ema cavidade do corpo. </li><li> Encher uma seringa cc 1 equipado com um cateter de gato Tom com PBS estéril, em preparação para inserir o cateter para dentro do lúmen da traqueia. Segure a traquéia usando uma pinça e com a mão segure o cateter perto da ponta para aumentar o controle e gentilmente insira-o no local da incisão traqueal. Insira cuidadosamente cateter na traquéia cerca de 20 mm. Agarrar a traqueia que é em torno do tubo de cateter, libertando a outra mão. </li><li> Utilizando uma seringa de 1 ml, equipado com o cateter, suavemente infundir 0,75 mL de temperatura ambiente, PBS estéril para dentro dos pulmões e, em seguida, aspirar cuidadosamente a parte de trás PBS para a seringa. Repita este processo três vezes, enquanto externamente massageando o peito. Desligue a seringa do cateter e dispensar o fluido de lavagem para um tubo de centrífuga de 15 mL. Após o enchimento da seringa com 0,75 mL de PBS fresco e voltar a ligar a seringa ao cateter, repetir os passos 1,9 e 1,10 duas vezes para cada rato. Recuperação de fluido pode ser parcial, a obtenção de menos do que o volume infundido. Se recolher células a partir de mais de um rato, colocar o tubo 15 mL com as células colhidas em gelo até que todas as lavagens de pulmão foram realizados. </li></ol> 2. Processamento de Colheita lavagem pulmonar AMɸ <ol><li> Centrifugar fluido lavagem pulmonar a 250 X g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Utilizando uma técnica asséptica, decante o sobrenadante em recipiente adequado de lixo dentro de uma cabine de segurança biológica. Ressuspender o sedimento de células por suavemente raking do tubo de centrifugação através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. Adicionar 1 mL de meio de cAMɸ para ressuspender as células. </li><li> Enumerar as células utilizando um contador de partículas Coulter Z1 por pipetagem de 20 uL de células em 10 mL de Isoton II diluente em Coulter frasco contador. Adicionar 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reagente II lítica em frasco, inverter cuidadosamente 3 a 4 vezes e, em seguida, carregar o frasco de amostra para o contador para se obter uma concentração de células. Certifique-se de programar o contador com um fator de diluição de 2 x 10 4 para exibir aconcentração de células como o número de células por mL. </li><li> Diluir as células a 2,5 x 10 5 por mL utilizando meio cAMɸ. </li><li> Pipetar 2 mL de 2,5 x 10 5 células / ml em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. </li><li> Para enriquecer para AMɸ, pratos de cultura dentro de uma incubar a 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO2 durante 6 h para permitir que as células aderem ao fundo do poço. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a não perturbar as células aderentes. </li><li> Lavar os poços utilizando PBS estéril (cálcio e magnésio livre) para remover as células não aderentes e detritos. Adicionar 2 mL de meio de cAMɸ a cada poço. </li><li> Incubar as células durante a noite no interior de um 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO 2 antes da adição de estimulantes. Após este passo de enriquecimento, aproximadamente 87% das células são positivas para o macrófago marcadores CD11b e F4/80 (Figura 2c). </li></ol> 3. A adição de PolyanhydridNanopartículas de e os tratamentos <ol><li> Fabricar nanopartículas através nanoencapsulação polianidrido anti-solvente 15. Neste processo, o polímero é dissolvido em cloreto de metileno (4 ° C a uma concentração de 25 mg / mL) e precipitado em pentano (-20 ° C a uma razão de 1:200 cloreto de metileno: pentano). </li><li> Pesar nanopartículas polianidrido usando esterilizado pesar papel em um equilíbrio que pode medir com precisão quantidades microgramas. Adicionar partículas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Volte a suspender as nanopartículas no gelo frio cAMɸ. Os cálculos são feitos de tal forma que não mais do que 0,3 mL de meio é adicionado a cada poço para obter a concentração desejada de nanopartículas. Manter as partículas resuspensas em gelo até que as nanopartículas são adicionadas ao poço de cultura. </li><li> Antes de adicionar as nanopartículas para as culturas AMɸ, sonicar partículas usando um sonicador de bancada com uma microponta. Esterilizar microtip por pulverização com etanol a 70% e wiping com um Kimwipe estéril antes da sonicação. Sonicar a 10-20 joules por 30 a 45 s, mantendo o tubo em gelo. Observe suspensão de nanopartículas macroscopicamente. Se as partículas não são suficientemente disperso, permitir que a suspensão para definir em gelo durante 1 a 2 min para assegurar que as nanopartículas são abaixo da temperatura de transição vítrea do polímero antes sonicando novamente por 30 a 45 seg. A finalidade deste passo de sonicação é adequadamente dispersar as nanopartículas, como o CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tendem a agregar quando expostos a um ambiente aquoso. No entanto, alguns pequenos agregados de nanopartículas ainda pode permanecer na suspensão. </li><li> Suspensão de nanopartículas (adequadamente dispersa) deve ser mantido em gelo e ser usado imediatamente para evitar prematura erosão de superfície ou de agregação. </li><li> Remova as placas de cultura contendo o AMɸ da incubadora e coloque no gabinete de biossegurança. Tilt placa em aproximadamente um ângulo de 45 graus e pipeta fora a quantidade de mediUM que será adicionada à suspensão de nanopartículas (também não deve exceder 0,3 mL). Não perturbe as células aderentes ao retirar do meio. </li><li> Vórtice a suspensão de nanopartículas polianidrido brevemente antes de a adicionar aos poços apropriados. Pipetar a quantidade de suspensão de nanopartículas (não mais do que 0,3 mL) para dentro do poço específico (s), no entanto, não pipetar cima e para baixo para misturar. Esta ação poderia retirar o aderente AMɸ do poço. As partículas irão assentar no fundo do poço, e contactar as células. Para os estudos descritos neste relatório, a concentração final de nanopartículas co-cultivados com o AMɸ foi de 125 ug / mL. Prossiga com os poços e os grupos subseqüentes tratamento desejado. Incluem grupos de controlo positivo e negativo, como único meio e 200 lipopolissacárido ng / mL (LPS) a poços designados. </li><li> Retornar os pratos de cultura para a 37 ° C humidificada incubadora com atmosfera de 5% de CO2 durante 48 h. Os estudos cinéticos em nossa Laboratory demonstraram 48 horas para ser o período de cultura óptima para a avaliação tanto a expressão do marcador de superfície celular ea secreção de citocinas como o que permite um tempo adequado para a transcrição ea síntese de proteínas a ocorrer. Embora os níveis mais elevados de citocinas acumular-se durante um período de cultura prolongada (isto é, 72 hr), avaliando célula expressão do marcador de superfície, neste ponto do tempo pode ser confundida com a contribuição dos níveis elevados de citocinas. As alterações na expressão do marcador de superfície observada pode não ser directamente atribuível à estimulação com as nanopartículas em si. </li></ol> 4. Avaliando AMɸ Ativação utilizando citometria de fluxo <ol><li> Preparar fluorescência-activated separação de células (FACS) tampão (0,1% de azida sódica e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)) em 0,1 M de fosfato salino tamponado (pH 7,4) antes da colheita dos macrófagos banhados que foram co-cultivados com nanopartículas oestimulantes r. </li><li> Prepare soluções de trabalho do tampão de bloqueio e os anticorpos monoclonais. Para preparar o tampão de bloqueio, diluir rato IgG (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / mL e 10 ug / mL, respectivamente, em tampão de FACS. Diluir superfície do painel de anticorpo marcador em tampão FACS, quer o fabricante concentração recomendada ou a concentração do usuário optimizado. Para os resultados apresentados neste trabalho, o painel de marcador de superfície é constituído por anticorpos contra MHC II, CD86, CD40 e CIRE (CD209). Anti-rato de anticorpos contra os marcadores de macrófagos F4/80 e CD11b também estão incluídos no painel para identificar positivamente o fenótipo de macrófagos durante a análise de dados. Cuidados devem ser tomados ao selecionar anticorpos contra moléculas de MHC II, como linhagens puras, muitas vezes diferem em seus haplótipos MHC II. Os anticorpos selecionados devem reagir com os aloantígenos específicos de MHC expressas pelo seu estirpe de ratinhos de interesse. </li><li> Após 48 h de incubação com nanopartículas e / ouestimulantes, os pratos de cultura de células lugar em gelo durante 20 min. Para remover os macrófagos aderentes a partir das placas, raspe poços com um raspador de células de 24 cm. </li><li> Usando uma pipeta de 5 mL serológica, aspirar cuidadosamente as células e meio de cima e para baixo cinco vezes para gerar uma única suspensão celular. Pipetar os conteúdos dos poços individuais em separado 5 tubos de poliestireno mL de modo a não se misturam as células de diferentes tratamentos experimentais. </li><li> Adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo. </li><li> Centrifugar os tubos de células a 250 x G a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente pellet celular em líquido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. </li><li> A fim de impedir a ligação não específica dos anticorpos monoclonais, adicionam-se 10 uL de tampão de bloqueio (preparado em 4,2) a cada tubo de células. Tubos de vórtice e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar volume apropriado de diluídos anticorpos monoclonais a cada tubo e incubcomeu no escuro em gelo durante 15 min. Os tubos que contêm amostras a serem analisadas devem receber a combinação de anticorpos do painel polycromatic (optimização anterior de combinação de anticorpos devem ser realizados por laboratórios individuais). Grupos de controlo adicionais devem ser incluídos para configurar correctamente os parâmetros de aquisição no citómetro de fluxo, incluindo um tubo de células que não foram marcadas, e os tubos de compensação que correspondem a células marcadas usando cada cor única separadamente. Para configurar corretamente as portas para a análise por citometria de fluxo, a fluorescência Minus One (FMO) controlos devem ser incluídos durante a aquisição. Controles FMO são células marcadas com todos os anticorpos conjugados com fluorocromo que são utilizados no painel excepto aquele que é substituído pelo seu controlo de isotipo correspondente. Populações positivas e negativas (ie, alíquotas separadas de células tratadas com um estimulante de controlo positivo e apenas meio) deve também ser incluídos na FMO e tubos de controlo de compensação. </li><li&gt; Adicionar 2 mL de tampão de FACS para cada tubo de vórtice, e centrifugar a 250 x G a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em células de fluido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. </li><li> Se o painel de anticorpos constituída por um anticorpo não directamente conjugado com um fluorocromo mas é preferivelmente conjugado com biotina, um fluorocromo-estreptavidina é necessário para visualizar o marcador de superfície. Neste passo, adicionar um volume apropriado da estreptavidina fluorocromo-diluído e incubar no escuro durante 15 min em gelo. Como em 4,2, o estreptavidina irá ser diluído para uma concentração recomendada pelo fabricante ou para um optimizado pelo utilizador. Este passo só é necessário para painéis contendo biotiniladas anticorpos primários. </li><li> Executar um passo de lavagem como descrito em 4,10. </li><li> Diluir um volume apropriado de BD estabilização 01:03 fixador em água desionizada. Adicionar 100 uL de fixador diluído a cada tubo, enquanto suavemente vortexing para evitar aglomeração das células. Células marcadas e fixadas podem ser estavelmente armazenadas no escuro a 4 ° C durante aproximadamente uma semana antes da aquisição de um citómetro de fluxo. </li></ol> 5. Os dados representativos As nanopartículas fabricadas na etapa 3,1 tinha um diâmetro médio de 163 ± 24 nm e uma morfologia consistente com aquele obtido em estudos anteriores 5,16. Nanopartículas em solução antes e após a sonicação são mostrados na Figura 1 para demonstrar a necessidade de sonicação para assegurar a dispersão adequada das partículas. Análise de citometria de fluxo de AMɸs colhidas obtidos através de lavagem pulmonar é mostrado na Figura 2. Marcação das células com uma combinação de anti-rato CD11b e anti-rato F4/80 anticorpos, bem como os controlos correspondentes FMO permite o estabelecimento de rotulagem de fundo, identificando AMɸs e gating para análise posterior. Tratamento de macrófagos alveolares com polianidridonanopartículas aumenta a activação como mostrado pela intensidade média de fluorescência aumentada de MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) e após (B) s 30 de sonicação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Análise por citometria de fluxo de colhidas macrófagos alveolares marcadas com (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ea PE-Cy7 FMO de controlo, (B) Alexa Fluor 700 FMO de Controlo e do anti-F4/80 PE-Cy7 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. O número no canto superior direito representa a porcentagem de células positivas duplo. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Histogramas demonstrando um aumento na intensidade de fluorescênciadade para a expressão de superfície de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) após co-cultura de macrófagos alveolares com CPTEG 50:50: polianidrido de CPH nanopartículas durante 48 horas. Os histogramas mostram resultados para AMɸ rotulados como controles (FMO <img alt="Gráfico da Linha 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Não tratado AMɸ rotulado com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( <img alt="Gráfico da Linha 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) E AMɸ cultivadas com nanopartículas e marcadas com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( <img alt="Gráfico da Linha 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Plataformas polianidrido vacina nanopartículas demonstraram eficácia quando administrada por via intranasal em regimes de dose única 5. Medindo a activação das populações de células fagocíticas residentes nos pulmões induzidos por esta plataforma de entrega de vacina permite a avaliação da sua capacidade potencial para, em última análise promover respostas imunes adaptativas. Especificamente, a colheita macrófagos alveolares no lavado pulmonar e tratá-los com diferentes formulaçõe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CAM Mídia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml Solução </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão FACS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina de soro bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antibodies </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC haplótipo II IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> CD86 anti-rato, o clone GL-1, conjugado com aloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 anti-rato, o clone 1C10, conjugada com a APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato CD209, clone 5H10, conjugado com biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato CD11b, clone M1/70, conjugado com Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratinho F4/80, clone BM8, conjugado com ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-estreptavidina Texas vermelho conjugado </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Outros Fornecimentos e Reagentes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Usado como 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimido CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 1 mL </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Soberano 3 ½ &quot;Pe. Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Gabinete de Biossegurança </td><td> NUAIRE </td><td> Série 22 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Pescador </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X sem cálcio e magnésio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Tubos da centrífuga com tampa de rosca </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Seis bem Cultura tecido tratado Placas </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de plástico Racks </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Célula Scraper 24 centímetros </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo </td><td> Falcão </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetar ajuda-XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, e 2 mL Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 uL micropipetas </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 L ponteiras </td><td> Pescador </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD de estabilizaçãoFixador </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II Reagente Lítico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Counter frascos de poliestireno </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ensaio </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Equipamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 umidificado </td><td> Nuaire </td><td> Modelo Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto citómetro de fluxo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter do contador de partículas Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicador equipamento de processamento de líquido com MicroTip </td><td> Misonix </td><td> Modelo No. S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

colheita murino macrófagos alveolares e avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Nanopartículas biodegradáveis ​​surgiram como uma plataforma versátil para a concepção e implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias infecciosas. Especificamente, polianidrido nanopartículas composto do ácido alifático sebácico (SA), a aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi)-hexano (CPH), ou o anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) exibem grandes quantidades única e cinética de erosão de superfície 1,2 e pode ser explorado para libertar lentamente biomoléculas funcionais (por exemplo, os antigénios de proteínas, imunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas também possuem atividade adjuvante intrínseco, tornando-os uma excelente escolha para uma plataforma de entrega de vacina 6,7,8. A fim de elucidar os mecanismos que regulam a ativação da imunidade inata após a vacinação da mucosa nasal, deve-se avaliar as respostas moleculares e celulares da p antígenocélulas ressentindo (APCs) responsáveis ​​pelo início respostas imunes. As células dendríticas são as principais APCs encontradas na condução das vias aéreas, enquanto os macrófagos alveolares (AMɸ) predominam no parênquima pulmonar 9,10,11. AMɸ são altamente eficientes na limpeza dos pulmões de micróbios patogénicos e restos celulares 12,13. Além disso, este tipo de célula desempenha um papel importante no transporte de antigénios microbianos para os nódulos linfáticos de drenagem, que é um primeiro passo importante na iniciação de uma resposta imunitária adaptativa 9. AMɸ também expressam níveis elevados de reconhecimento de padrões inata e receptores de catadores, pró-inflamatórias secretam mediadores, e principais células T naive 12,14. Uma população relativamente pura de AMɸ (por exemplo, superior a 80%) pode ser facilmente obtida por meio de lavagens pulmonares para o estudo em laboratório. Residente AMɸ colhidas a partir de animais imunes competentes proporcionar um fenótipo representante dos macrófagos que irá encounter vacina da partícula baseada em in vivo. Descrevemos os protocolos utilizados para colheita e cultura AMɸ de camundongos e examinar o fenótipo de ativação dos macrófagos após o tratamento com nanopartículas polianidrido in vitro.

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Nanopartículas biodegradáveis surgiram como uma plataforma versátil para o projeto e a implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de nanopartículas de polianidrido de ativar macrófagos alveolares purificados. Primeiro, a traqueia do camundongo é cirurgicamente exposta e realizada uma lavagem broncoalveolar para coletar células do trato respiratório. Em seguida, os macrófagos alveolares são centrifugados para isolá-los e cultivados durante a noite.Uma suspensão de nanopartículas de polianidrido é então preparada e adicionada aos macrófagos alveolares. Os macrófagos são incubados para permitir a ativação após 48 horas. A expressão dos marcadores de superfície celular é analisada por citometria de fluxo.A análise dos dados permite a identificação de formulações de nanopartículas de Polly Anidrido capazes de ativar macrófagos alveolares espelhados. Esse metal pode ajudar a responder perguntas nas áreas de biomateriais e imunologia. Especificamente, podemos identificar biomateriais com atividade adjuvante intrínseca, evidenciada pela capacidade de ativar as células apresentadoras de antígenos, incluindo macrófagos alveolares.Tivemos pela primeira vez a ideia de usar este método em nossa pesquisa quando descobrimos que uma plataforma de nanovacina baseada em polianidrido contra patógenos respiratórios proporcionava proteção completa contra pneumonia bacteriana. No presente trabalho, buscamos investigar as interações específicas da plataforma vacinal com células imunes respiratórias. Inicie este procedimento colocando um camundongo eutanasiado em decúbito dorsal.Pulverize o camundongo com etanol a 70%. Embora um camundongo C57BL/6 com seis a oito semanas de idade seja usado aqui, esta técnica pode ser realizada em qualquer linhagem de camundongo. Localize o esterno e, em um ângulo de 30 graus em relação ao abdômen, insira uma agulha de 23 calibres com uma seringa de um mililitro. A cerca de 50 milímetros na cavidade torácica, colete de 0,4 a um mililitro de sangue, geralmente nas rodas.Realizar este procedimento terá dificuldade em obter um resultado satisfatório para os experimentos. Por isso, é muito importante realizar o procedimento com cuidado, conforme demonstrado aqui. Para realizar a lavagem, vire o camundongo sobre seu abdome e pulverize com etanol 70%.Em seguida, pinçe a pele aproximadamente na metade da coluna vertebral usando tesoura de dissecação esterilizada com etanol 70%. Faça uma pequena incisão na pele. Segure a pele em ambos os lados da incisão e puxe em direções opostas ao longo do eixo cranial-caudal do camundongo.Uma vez expostos os músculos e glândulas do pescoço, corte cuidadosamente o tecido muscular. Em seguida, usando pinça, puxe o tecido em direção à região anterior do camundongo para expor a laringe, a traqueia e o esôfago.Evite cortar a veia jugular ou a artéria carótida. A traqueia é identificável como o tecido com anéis cartilaginosos ao redor. Com a pinça, segure delicadamente a traqueia e levante-a suavemente, separando-a do esôfago, que está localizado na face dorsal.Encha uma seringa de um cc, equipada com um cateter tipo tomcat, com PBS estéril. Em seguida, num ângulo de 45 graus, faça uma pequena incisão na traqueia anterior à pinça, mas posterior à laringe.Evite seccionar completamente a traqueia, o que impediria sua retração para dentro da cavidade corporal. Usando uma pin&ccedil;a, segure a traqueia e insira suavemente o cateter cerca de 20 mil&iacute;metros no local da incis&atilde;o da traqueia. Em seguida, segure a traqueia ao redor do tubo do cateter para liberar a outra m&atilde;o enquanto massageia externamente o t&oacute;rax.Utilize uma seringa de um mililitro equipada com o cateter para infundir suavemente 0,75 mililitros de PBS estéril à temperatura ambiente nos pulmões. Em seguida, aspire suavemente o PBS de volta para a seringa. Repita este processo três vezes.Desconecte a seringa do cateter e transfira o fluido de lavagem para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Encha a seringa com 0,75 mililitros de PBS fresco, reconecte a seringa ao cateter e repita a lavagem. A recuperação do fluido pode ser parcial, portanto, o volume obtido pode ser menor que o volume infundido.Se as células forem coletadas de mais de um camundongo, coloque o tubo de 15 mililitros com as células coletadas no gelo até que todas as lavagens pulmonares tenham sido realizadas. Para enriquecer a população de macrófagos alveolares nas células coletadas, centrifugue o fluido de lavagem pulmonar a 250 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Usando técnica estéril, decante o sobrenatante para um recipiente apropriado de resíduos dentro de uma cabine de segurança biológica. Resuspenda o pellet celular agitando suavemente o tubo de centrífuga sobre a parte superior de um suporte para tubos de ensaio. Adicione um mililitro de meio completo para macrófagos alveolares para ressuspender as células e enumerá-las.Pipete 20 microlitros de células em 10 mililitros de diluente isotônico dois em um frasco contador de cultura. Adicione três a quatro gotas de zog globina, reagente lítico dois ao frasco e inverta suavemente três a quatro vezes. Em seguida, carregue o frasco da amostra em um contador de partículas Colter Z um contador.Certifique-se de programar o contador com o fator de diluição de duas vezes 10 à quarta potência para exibir a concentração celular como número de células por mililitro. Uma vez determinada a concentração celular, dilua as células até 2,5 vezes 10 à quinta potência por mililitro com meio completo para macrófagos alveolares em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, distribua dois mililitros da solução em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços.Para enriquecer os macrófagos alveolares, incube as placas de cultura em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com atmosfera de 5%CO2 por seis horas. Durante a incubação, os macrófagos aderirão ao fundo do poço; após a incubação, aspire suavemente o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar as células aderentes. Em seguida, lave os poços usando PBS estéril sem cálcio e sem magnésio.Para remover as células não aderentes e os detritos, adicione dois mililitros de meio completo para macrófagos alveolares a cada poço. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius durante a noite. Após esta etapa de enriquecimento, aproximadamente 87% das células serão positivas para o marcador de macrófagos CD11b e F4/80.Uma vez que a população de macrófagos alveolares tenha sido enriquecida, o próximo passo do procedimento é adicionar nanopartículas de polianidrido, que primeiramente devem ser fabricadas por meio da nanoencapsulação antissolvente de polianidrido. Nesse processo, o polímero é dissolvido em cloreto de metileno e precipitado em pentano. Pese a quantidade apropriada de nanopartículas de polianidrido utilizando papel de seda esterilizado.Aqui, são adicionados 125 microgramas de partículas para cada mililitro de cultura. Adicione as partículas a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, re-suspenda as nanopartículas na quantidade apropriada de meio completo para macrófagos alveolares gelado, e coloque-o no gelo. Em seguida, esterilize a microponta de um sonicador de bancada.Pulverize com etanol 70% e limpe com um lenço de papel estéril, mantendo o tubo em gelo. Sonique de 10 a 20 joules por 30 a 45 segundos. Observe macroscopicamente a suspensão de nanopartículas se as partículas não estiverem suficientemente dispersas.Coloque a suspensão em gelo por um a dois minutos para garantir que as nanopartículas estejam abaixo da temperatura de transição vítrea do polímero. Em seguida, sonique novamente por 30 a 45 segundos. O objetivo da etapa de sonicação é dispersar adequadamente as nanopartículas conforme a marcação CCP 50 50.As nanopartículas de CPH tendem a se agregar quando expostas a um ambiente aquoso. No entanto, alguns pequenos agregados de nanopartículas podem ainda permanecer na suspensão. A suspensão de nanopartículas deve ser mantida sobre gelo e utilizada imediatamente para evitar erosão prematura da superfície ou agregação.Retire as placas de cultura contendo os macrófagos alveolares do incubador e coloque-as na cabine de segurança biológica. Incline a placa tomando cuidado para não perturbar as células aderentes A e pipete o volume de meio que será adicionado à suspensão de nanopartículas Vortex. Vortexe brevemente a suspensão de nanopartículas de polianidrido e então pipete até 0,3 mililitros da suspensão de nanopartículas nos poços apropriados.Novamente, tomando cuidado para não perturbar as células aderentes. As partículas sedimentarão no fundo do poço e entrarão em contato com as células. Prossiga para os poços subsequentes e os grupos de tratamento desejados.Inclua grupos controle positivo e negativo, como meio somente e 200 nanogramas por mililitro. Lipopolissacarídeo nos poços designados, depois incube a 37 graus Celsius por 48 horas. Após a incubação, a ativação alveolar pode ser avaliada por citometria de fluxo conforme descrito no documento anexo.Macrófagos alveolares foram obtidos de camundongos C57BL/6 e enriquecidos conforme descrito no artigo em vídeo para avaliar a ativação celular. Nanopartículas de polianidrido 50:50 CPT:CPH a 125 microgramas por mililitro foram adicionadas a cinco vezes 10 à quinta células por mililitro de macrófagos alveolares enriquecidos durante 48 horas. A expressão dos marcadores de macrófagos alveolares, MHC II, CD40, CD86 e SIRE, foi então avaliada por coloração com anticorpos e citometria de fluxo, conforme pode ser observado neste histograma.Macrófagos alveolares incubados com nanopartículas indicados pela linha azul sólida aumentaram a expressão superficial de MHC dois, uma molécula necessária para a apresentação de antígeno a linfócitos T CD quatro, em comparação com aqueles não tratados com nanopartículas, como esperado. Níveis mais baixos de marcação foram observados nos controles de fluorescência menos um (FMO), indicando que o sinal observado não é devido à autofluorescência. Macrófagos alveolares incubados com nanopartículas indicados pela linha azul sólida aumentaram a expressão de CD 40, uma molécula coestimuladora necessária para a ativação adequada de linfócitos T em comparação com células não tratadas.A expressão de outra molécula coestimuladora de células T, CD86, também foi aumentada após o tratamento com nanopartículas de polianidrido por 48 horas. A expressão de CYaC, um receptor do tipo lectina C que se liga a motivos de carboidratos presentes na superfície de patógenos, é grandemente potencializada em macrófagos alveolares após o tratamento com nanopartículas de polianidrido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma lavagem broncoalveolar com o objetivo de colher macrófagos alveolares, como cultivar essas células e também como estimular essas células para medir ou avaliar a ativação celular dessas células com nanopartículas de polihidroxialcanoato.Ao realizar este procedimento, é importante utilizar técnicas de laboratório estéreis para evitar a contaminação das células primárias que estão sendo colhidas e para prevenir a introdução de contaminantes nos tratamentos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.

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Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

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Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

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Aprenda a colher macrófagos alveolares murinos e avaliar sua ativação por nanopartículas polianidrido usando citometria de fluxo. Este método permite estudar modulação imune em modelos pulmonares.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

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