Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

O objetivo do seguinte experimento é analisar as propriedades viscoelásticas celulares sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Isso é alcançado aplicando pressão negativa à membrana celular por meio de uma micropipeta aass conectada a um transdutor de pressão que foi construído a partir de capilares de vidro utilizando um puxador de micropipetas. A micropipeta é fixada em um micromanipulador fino posicionado sobre a platina de um microscópio invertido, e a ponta da micropipeta é aproximada de uma célula.

Em seguida, cria-se um selamento entre a ponta da pipeta e a membrana celular; a deformação da membrana para dentro da pipeta é então medida em resposta a um degrau aplicado de pressão negativa. São obtidos resultados que demonstram os efeitos de diferentes tratamentos sobre as propriedades biomecânicas celulares, com base no grau de deformação da membrana em resposta a uma força bem definida. O objetivo do nosso laboratório é investigar o impacto da dislipidemia nas propriedades biofísicas e biomecânicas de células endoteliais vasculares, e hoje vamos apresentar um método chamado aspiração por micropipeta, que utilizamos para medir a rigidez celular.

As implicações dessa técnica estendem-se ao entendimento básico da biomecânica celular em múltiplos mecanismos, como angiogênese, percepção mecânica e migração, entre outros. Embora este método possa fornecer informações sobre a biomecânica celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como membranas modelo, organelas intracelulares ou tecidos. Para visualizar a membrana celular e observar a projeção da membrana para dentro da pipeta, as membranas celulares endoteliais vasculares são coradas com um corante fluorescente lipofílico.

Para começar, dilua o corante estoque até uma concentração de trabalho com uma solução aquecida de PBS e sonique a mistura por cinco minutos para quebrar os agregados D. Após uma centrifugação de cinco minutos no microcentrífuga, remova o sobrenadante e lave as células endoteliais vasculares adicionando 0,5 mililitros de PBS. Após cinco minutos, aspire a solução e prossiga com mais duas lavagens.

Em seguida, adicione a solução de dice às células e incube por 30 minutos em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a incubação, lave as células novamente com PBS como antes. Micropipetas são puxadas aquecendo um capilar de vidro no meio.

Quando o vidro começa a derreter, as duas metades do capilar são puxadas para gerar duas micropipetas. As pontas das pipetas utilizadas nestes experimentos normalmente variam entre dois e seis mícrons. Diâmetro externo, dependendo do tamanho da célula, a forma da ponta deve se assemelhar a um tubo cilíndrico para iniciar a inserção do capilar de vidro no puxador de pipetas.

Nesta demonstração, o puxador de pipetas horizontal Suter P 97 é utilizado com um programa otimizado. Este puxador oferece múltiplas opções programáveis para variar a velocidade e outros parâmetros do puxamento. Prossiga para ativar o programa de puxamento.

Após puxar cada micropipeta, verifique a forma da ponta sob o microscópio. Após o polimento térmico da ponta, preencha a micropipeta com uma solução salina fisiológica, como PBS ou meio de crescimento não fluorescente. É importante que a solução seja suplementada com 30% de soro, o que permitirá que a membrana celular entre suavemente na pipeta. Nesta demonstração, utiliza-se um microscópio invertido com fluorescência e capacidade de desconvolução 3D, acoplado a uma câmera de vídeo conectada a um computador, um transdutor de pressão, uma plataforma livre de vibrações e um micromanipulador, para começar a montar as células em uma câmara de aspiração micrométrica, levantando-as de seus substratos e transferindo-as com pipeta para uma câmara longitudinal rasa montada no microscópio invertido com fluorescência.

A razão para usar uma câmara longitudinal rasa é permitir que uma micropipeta se aproxime das células em um ângulo muito rasante, o mais próximo possível da horizontal. Isso é feito para permitir que a membrana puxada para dentro da micropipeta seja visualizada em um único plano de foco. Coloque uma micropipeta cheia em um suporte de pipeta conectado a um transdutor de pressão por meio de tubo flexível, com diâmetro ajustado ao conector do suporte de pipeta para garantir um encaixe firme.

No início de cada experimento, a pressão no interior da pipeta é equilibrada com a pressão atmosférica; monte a pipeta em um micromanipulador que permita controle fino dos movimentos da pipeta na faixa de micrômetros. Posicione a pipeta em um ângulo raso em relação ao fundo da câmara e leve a ponta da pipeta até o centro do campo visual. O corpo da pipeta, que é a parte cilíndrica da ponta da pipeta na qual a membrana é aspirada, deve estar alinhado horizontalmente ao plano focal.

Para alcançar esta primeira posição, segure a pipeta no ângulo mais raso possível e, em seguida, flexione o corpo da pipeta contra o fundo da câmara. Como o corpo é muito fino, é suficientemente flexível para deslizar sobre o fundo da câmara ao se aproximar de uma célula. Aproxime lentamente a micropipeta ao lado de uma única célula utilizando o manipulador grosso até ficar próxima ao plano de foco da célula.

Em seguida, utilizando o micromanipulador fino, mova a micropipeta até a borda da célula até que a ponta da pipeta toque suavemente a membrana. Tire uma imagem para observar a posição da pipeta. Selos bons são formados quando toda a ponta da pipeta está em contato completo com a superfície da célula e o contato é estável.

Em seguida, aplique um passo de pressão negativa utilizando o transdutor e mantenha-a até que a projeção da membrana seja estabilizada. A quantidade de pressão necessária para aspirar a membrana para dentro da pipeta varia conforme o tipo celular e as condições experimentais específicas. A deformação inicial é tipicamente observada ao aplicar pressão na faixa de menos dois a menos 15 milímetros de mercúrio.

Quando a pressão é aplicada, a membrana é gradualmente deformada para dentro da pipeta até se estabilizar em um determinado comprimento. Um processo que normalmente leva de dois a três minutos; nesse período, são necessárias imagens da deformação da membrana a cada 30 segundos para acompanhar o avanço da membrana puxada para dentro da pipeta. Por fim, aumente a pressão para o próximo nível em incrementos de dois a cinco milímetros de mercúrio.

Repita todo o procedimento até que a projeção da membrana se desprenda da célula e entre na pipeta, momento em que o experimento é interrompido. Para quantificar o grau de deformação da membrana, o comprimento aspirado é medido desde a ponta da pipeta até o vértice da circunferência da projeção da membrana. Uma pipeta maior exercerá mais força sobre a membrana celular no mesmo nível de pressão, para compensar a variabilidade entre os diâmetros das pipetas.

O comprimento aspirado é normalizado em relação ao diâmetro da pipeta medido em cada experimento para validar o uso da técnica de microaspiração em células aderidas ao substrato; foi testado com a interrupção da actina F, que resulta em uma diminuição na rigidez de células endoteliais aórticas bovinas, conforme estimado por esta abordagem. Aqui, é apresentada uma série típica de imagens fluorescentes de uma membrana endotelial sofrendo deformação progressiva em resposta à pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta, conforme esperado. A membrana é gradualmente aspirada para dentro da pipeta e o comprimento aspirado aumenta em função da pressão aplicada; os cursos temporais da deformação mostram que a interrupção da actina F aumenta significativamente os comprimentos aspirados das projeções sob todas as condições de pressão.

Utilizando essa abordagem, descobriu-se que a rigidez celular aumenta quando as membranas celulares são esgotadas de colesterol, enquanto o enriquecimento com colesterol não teve efeito. Aqui, uma célula enriquecida com colesterol, uma célula controle e uma célula esgotada de colesterol são mostradas após atingirem comprimentos máximos de aspiração de menos 15 milímetros de mercúrio. As projeções geralmente começaram a se desenvolver em menos 10 milímetros de mercúrio, e os tempos necessários para a deformação da membrana puderam ser medidos nas pressões negativas de 10, 15 e 20 milímetros de mercúrio.

Aqui, os comprimentos aspirados máximos são representados graficamente em função da pressão aplicada. O comprimento normalizado máximo em células esgotadas foi significativamente menor do que o das células controle para pressões de menos 15 milímetros de mercúrio e menos 20 milímetros de mercúrio. A aplicação de pressões negativas superiores a 25 milímetros de mercúrio resultou na separação da projeção aspirada, formando um sle separado.

O nível de pressão que resultou no desprendimento da membrana foi semelhante sob diferentes condições de colesterol e uma observação inesperada. Como mostram estudos anteriores, o aumento no colesterol da membrana potencializa a rigidez das bicamadas lipídicas da membrana. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas, se executada corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar que este experimento é realizado em células individuais.

Portanto, de três a cinco células devem ser analisadas por condição, por experimento, num total de três experimentos.