Name: Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de cariotipagem espectral (SKY) para identificar anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística. Este método avançado supera as técnicas clássicas de citogenética.

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Os autores gostariam de agradecer Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell para a sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (DK080640) e da Universidade de Toledo &amp; ProMedica Prêmio Estímulo à Pesquisa Translacional Dr. Surya Nauli.

1. Pré-tratamento de célula e preparação metáfase <ol><li> As células são cultivadas em alteraç de Dulbecco de Medium de Eagle (DMEM) contendo 10-15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C, com 5% de CO 2 incubadora, até que eles chegar a 70-80% de confluência. </li><li> Trate as células com solução de Colcemid em 0,05 ug / ml para 30-60 min. </li><li> Recolher o meio contendo as células de flutuação em tubos estéreis de 50 ml de centrífuga de falcão. Lavar as células sobre a placa com sterile1X-PBS. Depois de incubar com tripsina estéril para 1-2 min, colheita e coletar as células restantes para dentro do tubo mesmo. </li><li> Spin os tubos a 1000 rpm durante 5 min, aspirar o sobrenadante deixando 0,5 ml e afrouxe pellet por flicking com o dedo somente. </li><li> Dependendo do tamanho do pellet, adicione 5-10 ml de solução hipotônica de KCl 0,56% em dH 2 O e incubar a suspensão a 37 ° C por 30-45 min. </li><li> Adicionar uma gota de metanol / ácido acético(3:1 vol / vol) por ml de suspensão de células hipotônica e inverta suavemente o tubo para a mistura. </li><li> Centrifugar a 1200 rpm durante 5 min e coletar pellet como passo 1,4, em seguida, adicionar 5 ml de metanol fresco / ácido acético (3:1 vol / vol) gota a gota solução fixadora enquanto flicking o pellet continously. Este procedimento é crítico de modo a que os spreads metafásicas não vai ser preso em clumps as células &#39;que comprometeriam o experimento. </li><li> Centrifugar novamente a 1200 rpm durante 5 min e adicione 5-10 ml de gelo-frio de metanol / fixador de ácido acético ao longo da parede do tubo. Na presente fase, se necessário, as células podem ser armazenadas em solução fixadora em um tubo de apertados e selado à temperatura de -20 ° C para o termo curto ou -80 ° C durante a longo prazo (anos) para uso futuro. </li><li> Slides limpas em etanol absoluto, em seguida, mergulhar o slide no dH 2 O para approximately10X, a fim de formar uma bainha de água sobre a superfície do slide. Coloque o slide sobre uma placa de vidro e gota 15-20 uL de suspensão de células (a partir do passo 1,8) A partir de 10 &quot;acima o slide. Coloque o slide em um banho de água fixado em 65-70 ° C durante 1-2 min e permitir que para secar. </li><li> Verifique se o slide sob um microscópio de luz, utilizando 10X e 40X objetivos secos certificando-se há cromossomos metafásicos e os spreads são uniformemente espaçados. Verifique a presença citoplasma ao redor dos cromossomos. Se citoplasma é presente proceder com pré-tratamento de slide (digestão pepsina), se nenhum citoplasma está presente e os cromossomas tem boa morfologia, em seguida, não há nenhuma necessidade para pré-tratamento slide. </li></ol> 2. Pré-tratamento de slides (pepsina tratamento) <ol><li> Aplicar 120 uL de 1:200 solução de RNase (20 mg / ml) dissolvido em 2X-SSC sobre um milímetro 24 lamínula microscópio x 60 mm e inverta o rosto de slide metáfase para baixo sobre o lamínula, em seguida, inverter cuidadosamente o rosto de slide metáfase-se e incubar a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Retire cuidadosamente a lamínula sem arranhar a lâmina e lavar com 2X SSC-tampão em uma jarra de Coplin cada 5 min para 15 mincom agitação. </li><li> Adicionar 5-15 uL de pepsina solução estoque (100 mg / ml em dH 2 O), para um copo limpo e em seguida, adicione 100 ml de pré-aquecido (37 ° C) 0,01 M de HCl. É importante que a pepsina é adicionado em um limpo proveta de primeira e não diretamente para dentro da solução HCl, caso contrário ele não iria se dissolver em solução. Incubar o slide em uma jarra de Coplin contendo a solução de HCl / pepsina nas concentrações de 37 ° C durante 3-5 min. Este passo é muito crítico como a digestão demasia fará com que os cromossomos a ser overdigested e demasiado pouca digestão vai deixar o citoplasma não digerido que poderá conduzir a ligação não-específica da sonda e interferir com o sinal de hibridação. </li><li> Lave o slide em uma jarra de Coplin contendo 100 ml 1X-PBS durante 5 min duas vezes à temperatura de quarto. </li><li> Lave o slide em uma jarra de Coplin contendo 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 para 5 min à temperatura ambiente (50 ml de MgCl 1M n º 2 em 950 ml de 1X-PBS). </li><li> Coloque o slide em uma jarra de Coplin containing 100 formaldeído ml 1% para 10 min à temperatura ambiente (1,7 ml de formaldeído a 37% em 100 ml de 1X-PBS/MgCl 2). </li><li> Lave o slide em uma jarra de Coplin contendo 100 ml 1X-PBS durante 5 min. </li><li> Observar o slide ao abrigo de um microscópio de luz usando lente seca de 40X para assegurar de que os slides são digeridos corretamente e nenhuma citoplasma está presente e a morfologia cromossomo é preservada. Selecione uma área para a hibridização usando uma caneta de diamante. </li></ol> 3. Cromossoma sonda e desnaturação e hibridização <ol><li> Prepare a solução de desnaturação fresco (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) e Pré-aquecer a 70-80 ° C em uma jarra de Coplin colocado em um Lugar banho de água o slide no jarra de Coplin contendo a solução de desnaturação em um banho de água a 70 ° C para os cromossomos do rato e em 80 ° C para os cromossomos humanos para a 30s-1.5 min. </li><li> Imediatamente coloque o slide em etanol de gelo-frio 70% para 3 min seguido por 80% e etanol a 100% por 3 min cada um e de ar seco. Examine o slidede morfologia cromossômica. Morfologia cromossômica Bom é denotada por cromossomos escuros e não &quot;fase de luz&quot; ou halo cromossomos. </li><li> Aqueça a sonda de SkyPaint (kit de pintura SKY; frasco para injectáveis ​​# 1) a 37 ° C com agitação durante 20 min vórtice, e centrifugar brevemente a 1000 rpm durante alguns segundos. </li><li> Desnaturar a sonda em um termociclador programado para um ciclo de dois-passo de cada 85 ° C durante 5 ciclo de min seguido por 37 ° C por 60 min para permitir que sonda marcada com-de DNA para preannealing. </li><li> Aplicar 10 ul da sonda desnaturada para a área de hibridação e tampa com uma 22 mm x 40 mm lamela tomando cuidado para não prender as bolhas de ar. Selar as bordas da lamínula com cimento de borracha e incubar em uma câmara de umidificado a 37 ° C durante 48-72 hrs. </li></ol> 4. Detecção de sonda fluorescente <ol><li> Remova a lamínula cuidadosamente e coloque o slide em uma jarra de Coplin contendo pré-aquecido (45 ° C) de lavar roupa solução que eu (preparado de fresco formamida a 50% em 2X SSC). Lave por 5 mintrês vezes a 45 ° C em um banho de água agitação a 45 rpm </li><li> Lave o slide em uma solução de lavagem II (1X SSC) a 45 ° C por 5 min duas vezes com a tremer. </li><li> Lave o slide em uma solução de lavagem III (% SSC/0.1 4X de Tween 20) durante 5 min a 45 ° C com agitação. </li><li> Aplicar 80 uL de reagente de bloqueio (kit de pintura SKY; frasco para injectáveis ​​# 2), coloque uma lamela e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova o slide e permita que o fluido para drenar. Aplicar 80 uL de Cy5 reagente de coloração (Concentrada anticorpo de detecção CAD kit; frasco para injectáveis ​​# 3), aplique uma lamínula e incubar a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Lave o slide com uma solução de lavagem III a 45 ° C por 5 min três vezes com a tremer. </li><li> Aplicar 80 uL de Cy5.5 reagente de coloração (Concentrada anticorpo de detecção CAD kit; frasco para injectáveis ​​# 4), coloque uma lamínula e incubar a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Lave o slide com uma solução de lavagem III a 45 ° C por 5 min três vezes com a tremer. </li><li> Incline o slide e permitir que o fluido a<html> escorrer. Aplicar 20 ul do reagente DAPI anti-fade (kit de pintura SKY; frasco # 5) e colocar uma lamela de microscópio 24 mm x 60 mm. Retire cuidadosamente as bolhas de ar que são formadas. Slides pode ser imaged imediatamente ou armazenado a 4 ° C no escuro por nenhuma mais tempo do que 1 semana. </li></ol> 5. Aquisição e análise de imagem <ol><li> De aquisição de imagem é realizado por que visualizaram o slides metáfase usando um microscópio Olympus equipado com uma lente de 60X óleo de imersão, um cubo Espectral (personalizado projetado triplo band-pass filtro), um filtro de DAPI e um módulo de interferômetro de Sagnac com uma câmera CCD. </li><li> Spectral-cariótipos foram realizadas usando o software SKY Ver (Versão imagem Aplicada espectral 1,62) Seguindo o manual do usuário. </li><li> Depois de analisar as imagens, os cromossomos podem ser visualizadas como imagens de cores específicas (com cores fluorescentes), imagens a cores (com pseudo cores para a classificação) e imagens invertidas DAPI (padrão de bandas específico). </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. resultados representativos Um procedimento de SKY completa geralmente leva cerca de uma tempo de semanas (Figura 1). Isso inclui aquisição de imagem e de análise, desde que as células em metafase, estão em oferta adequada. Análise de cariotipagem revela cariótipo mouse normal (40, XY) de células de camundongos do tipo selvagem (Figura 2a). Em contraste, as células a partir de Pkd1 - / - do mouse (PKD modelo do rato) mostra um aumento significativo no número de cromossomos e anormalidades estruturais, tais como as deleções cromossômicas (cromossomo # 8) e translocações (cromossomos # 11 e 19) (Figura 2b). Analisamos também os tecidos vasculares dos pacientes DPRAD. Um estudo simples por meio da contagem os números de cromossômicas indicaram que não-ADPKD e algumas amostras DPRAD vasculares teve normais números de cromossômicas de 23 pares (Figura 2c). Em geral, porém, observou-se falha de segregação cromossômica, resultando em 46 pares de cromossomos em UmAmostras de DPKD em vez de 23 pares (Figura 2d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> Figura 1. SKY fluxograma protocolo. Fluxograma do protocolo SKY ilustra passos para completar uma experiência a partir de pré-tratamento das células e preparações metáfase para aquisição e análise de imagem. Um cronograma de uma semana aproximada é apresentado à esquerda com o passo-a-passo os procedimentos para cada dia. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> Figura 2. Cariotipagem espectral em linhas mouse imortalizados celulares e recém-isoladas células humanas primárias. Cores e imagens invertidas DAPI de cromossomos individuais são mostrados antes a classificação cromossômica. Após a triagem, os cromossomos são apresentados na &quot;classificação&quot; da tabela. Uma imagem SKY) de um spread metáfase de rato do tipo selvagem contém cariótipo normal (40, XY). B) Pkd1 - / -. mouse mostra o número de cromossomos anormais (68 em vez de 40) e alterações cromossômicas, como deleção do cromossomo (cromossomo # 8) e translocações cromossômicas (cromossomos 11 e # 19) c) SKY imagem de um spread metáfase do tecido vascular de um paciente não tem ADPKD cariótipo normal (46, XX). d) SKY imagem de um spread metáfase do tecido vascular de um paciente ADPKD contém cariótipo anormal (92, XXXX). Parte dos dados foram previamente relatados e reutilizado com permissão 14.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica utilizada em citogenética estudar composições genômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas de pintura de cromossomos, ea detecção destas sondas são adquiridas através de um interferômetro de Sagnac. O processo de SKY completa geralmente leva cerca de uma semana, e ele, envolve várias etapas-chave (Figura 1). A SKY usa um protocolo padrão, que foi primeiramente descrita por Padilla-Nash et al 3. O protocolo já foi adaptado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal de soro de bovino (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin Estreptomicina / </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de solução salina tamponada com </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY pintura sonda kit (Humana) </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY pintura sonda kit (Mouse) </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de detecção de Concentrada anticorpo </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> O ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído 37% </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> preparar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro lâminas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio tampa de vidro 24x60mm </td><td> VWR Vista Visão </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Borracha cimento </td><td> Elmer (loja de varejo local) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hibridação humidifiedchamber / / Bandeja </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> colocar toalhas de papel molhadas no fundo </td></tr><tr><td> Thermociclista </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de agitação / agitador orbital </td><td> Bélico Biotecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitando banheira / água </td><td> Precisão científica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI cubo filtro </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY cubo filtro </td><td> Tecnologia Chroma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Aplicado imagem espectral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido cultura de células </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Óleo de 60X </td></tr></tbody></table>

cariotipagem espectral para o estudo de anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Método convencional para identificar e classificar cromossomos individuais depende do padrão único de bandagem de cada cromossomo em uma espécie específicos que estão sendo analisados ​​1, 2. Esta técnica clássica de bandagem, no entanto, não é confiável na identificação de complexos aberrações cromossômicas, tais como aqueles associados com o câncer. Para superar as limitações da técnica de anilhamento, cariotipagem espectral (SKY) é introduzido para fornecer informações confiáveis ​​tanto em anormalidades cromossômicas. SKY é uma fluorescência multicolor hibridização in-situ (FISH) técnica para detectar cromossomos em metafase, com microscópio espectral 3, 4. SKY tem sido comprovada para ser uma ferramenta valiosa para a análise citogenética de uma ampla gama de anormalidades cromossômicas associados com um grande número de doenças genéticas e doenças malignas 5, 6. SKY envolve o uso de sondas de DNA multicolor fluorescentemente-com o Rótulo preparados a partir de o oligonucle degenerarprimers otide por PCR. Assim, cada cromossoma tem uma cor exclusiva espectral depois de hibridização in-situ com sondas, que são diferencialmente rotulados com uma mistura de corantes fluorescentes (Rodamina, Texas Vermelho, Cy5, FITC e Cy5.5). As sondas utilizadas para SKY consistir de até 55 sondas cromossômicas específicas 7-10. O procedimento para a SKY envolve várias etapas (Figura 1). SKY exige a disponibilidade de células com alto índice mitótico a partir de tecido normal ou doente ou sangue. Os cromossomos de uma única célula a partir de qualquer célula de um recém-isolado primária ou uma linha de células estão espalhados em um slide de vidro. Esse spread cromossomo é rotulado com uma combinação diferente de corantes fluorescentes específicos para cada cromossomo. Para a detecção da sonda e de aquisição de imagem, o sistema de imagem espectral consiste de interferômetro de Sagnac e uma câmera CCD. Este permite a medição do espectro de luz visível emitida a partir da amostra e para adquirir uma imagem espectral frocromossomos m individuais. HiSKY, o software usado para analisar os resultados das imagens capturadas, proporciona uma fácil identificação de anomalias cromossômicas. O resultado final é uma metáfase e uma imagem de classificação cariótipo, no qual cada par de cromossomos tem uma cor distinta (Figura 2). Isso permite a fácil identificação de identidades cromossômicas e translocações. Para mais detalhes, visite o site da Imagem Aplicada (Spectral <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY foi recentemente usada para a identificação de defeitos cromossômicos de segregação e anormalidades cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), uma doença genética caracterizada por uma disfunção em cílios 11-13. Usando esta técnica, foi demonstrada a presença de segregação cromossômica anormal e defeitos cromossômicos em pacientes DPRAD e modelos de mouse 14. Outras análises usando SKY não só nos permitiu identificar o número cromossômico e identidade, mas também para detectar com precisão muito complexos aberrações cromossômicas, como translocações e deleções cromossômicas (Figura 2).

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica avançada citogenética para identificar as aberrações cromossômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas cromossômicas de pintura, que permitem a classificação de todos os cromossomos. SKY também pode identificar aberrações cromossômicas e defeitos complexos de segregação em camundongos e humanos, com várias doenças, incluindo doença renal policística.

Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

O método convencional para identificar e classificar cromossomos individuais depende de o padrão de bandeamento único de cada cromossomo em uma espécie específica ser...

O objetivo deste procedimento é marcar cromossomos com sondas de pintura para identificar aberrações cromossômicas e defeitos de segregação em camundongos e humanos com doença renal policística. Isso é realizado primeiramente colhendo células de humanos ou camundongos e tratando com smid, seguido por fixação e preparação de metáfases em lâminas de vidro. Em seguida, a lâmina é pré-tratada para remover RNA e citoplasma extras que possam interferir na hibridização.Isso é feito pela digestão com RNAses e pepsina, respectivamente. Em seguida, realiza-se a desnaturação de cromossomos e sonda, seguida pela hibridização para marcar os cromossomos. O passo final é a detecção da sonda com corantes fluorescentes.No final, podem ser obtidos resultados que mostram anormalidades numéricas e estruturais dos cromossomos por meio de fluorescência, microscopia e captura de imagem e análise pelo software Skyview. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como as técnicas clássicas de encurvamento de GIMs, é que ela fornece informações adicionais sobre aberrações cromossômicas complexas, como translocações cromossômicas e rearranjos cromossômicos complexos, que não podem ser caracterizados pelas técnicas clássicas de encurvamento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da doença renal policística, como o mecanismo de formação dos rins císticos.O procedimento será demonstrado pela Dra. Wiam Abu, permitindo que um talentoso pós-doutorando sênior do nosso laboratório comece a cultivar células endoteliais em DMEM contendo 10 a 15% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam 70 a 80% de confluência. Em seguida, trate as células com solução de colagenase na concentração final de 0,05 miligramas por mililitro por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius antes da colheita. Para colher as células, primeiro colete o meio contendo quaisquer células flutuantes em tubos cónicos estéreis de 50 mililitros.Lave as células na placa com PBS estéril uma vez após a incubação com trips estéreis por um a dois minutos, recolha e colete as células remanescentes no mesmo tubo. Após a centrifugação das células a 1000 rotações por minuto durante cinco minutos, aspire a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando cerca de 0,5 mililitros sobre o pellet. Solte o pellet celular batendo levemente no tubo.Em seguida, dependendo do tamanho do pellet, adicione de cinco a dez mililitros de uma solução hipertônica contendo 0,56% de cloreto de potássio em água destilada e incube a suspensão a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Após a incubação, utilize uma pequena pipeta de um mililitro para adicionar uma gota de solução fixadora gelada por cada mililitro da suspensão celular hipertônica. Em seguida, inverta suavemente o tubo para homogeneizar, após centrifugar as células por cinco minutos a uma velocidade de 1.200 rotações por minuto.Aspire o sobrenadante como antes. Em seguida, adicione lentamente um mililitro de solução fixadora fresca enquanto agita suavemente o pellet. Depois, adicione cuidadosamente mais quatro mililitros de fixador à parede do tubo.Este procedimento é essencial para garantir que as extensões de metáfase não fiquem aprisionadas nos agregados celulares. Após repetir a etapa de centrifugação e aspirar o sobrenadante, substitua de cinco a dez mililitros do fixador pipetando lentamente o fixador pelas paredes do tubo. Nesta etapa, as células podem ser armazenadas em um tubo fechado e selado a menos 20 graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo até que estejam prontas para prosseguir.Quando estiver pronto para prosseguir, verifique o número de cromossomos em metáfase na preparação celular. Limpe a lâmina com etanol absoluto. Em seguida, mergulhe a lâmina em água destilada aproximadamente 10 vezes para formar uma película de água sobre a superfície da lâmina, coloque a lâmina sobre uma placa de vidro e deixe cair 15 a 20 microlitros da suspensão celular de uma altura de 10 polegadas acima da lâmina.Coloque a lâmina em um banho-maria ajustado a 65 a 70 graus Celsius por um a dois minutos e deixe secar. Verifique a lâmina em um microscópio óptico utilizando as objetivas secas de 10 vezes e 40 vezes. Certifique-se de que há cromossomos em metáfase e de que os espalhamentos estão uniformemente espaçados. Examine o citoplasma ao redor dos cromossomos.Se o citoplasma estiver presente, como visto aqui, prossiga com o pré-tratamento da lâmina. Se não houver citoplasma e os cromossomos apresentarem boa morfologia, então não há necessidade de pré-tratamento da lâmina com 120 microlitros de uma solução recém-preparada de um para 200 de 20 miligramas por mililitro. Solução de RNA dissolvida em duas vezes SSC em um lamínula de 24 milímetros por 60 milímetros.Coloque o lâmina de metáfase com a face voltada para baixo sobre o lamínula. Em seguida, inverta cuidadosamente a lâmina de metáfase com a face voltada para cima. Coloque a lâmina dentro de uma câmara umidificada e incube-a a 37 graus Celsius por 45 minutos.Após o tempo de incubação, remova cuidadosamente a lamínula sem riscar a lâmina e lave duas vezes com tampão SSC em um frasco de acoplamento, três vezes por cinco minutos cada, sob agitação. Enquanto isso, adicione de cinco a 15 microlitros de pepina a 100 miligramas por mililitro em água destilada a um béquer limpo e, em seguida, adicione 100 mililitros de ácido clorídrico 0,01 molar pré-aquecido a 37 graus Celsius. É importante adicionar a pepina ao béquer limpo primeiro, caso contrário, não se dissolverá.Transfira esta solução para um frasco coplan. Incube a lâmina de lavagem no frasco de acoplamento a 37 graus Celsius por não mais de três a cinco minutos após a digestão. Lave a lâmina duas vezes em um frasco copin contendo um XPBS durante cinco minutos cada, com agitação.A seguir, realize uma lavagem de cinco minutos em um frasco Coplin contendo PBS suplementado com cloreto de magnésio. Em seguida, faça uma incubação de 10 minutos em um frasco Coplin contendo 1% de formaldeído, seguida por uma lavagem final em um frasco Coplin contendo PBS 1X por cinco minutos. Então, desidrate os frascos Coplin contendo uma série de etanol a 70%, 80% e 100% por dois minutos cada, e depois deixe secar ao ar.Observe o lâmina ao microscópio óptico utilizando uma objetiva seca de 40 vezes para garantir que as lâminas foram digeridas adequadamente, que não há presença de citoplasma e que a morfologia dos cromossomos está preservada. Por fim, selecione uma área para hibridização utilizando uma caneta de diamante. Após preparar recentemente a solução desnaturante, coloque-a em um frasco tipo Coplin e aqueça previamente a 70 graus Celsius em banho-maria.Em seguida, coloque a lâmina no frasco cochin contendo a solução desnaturante pré-aquecida em banho-maria a 70 graus Celsius por 30 segundos a um minuto. Após a incubação, coloque imediatamente a lâmina em etanol gelado a 70% por três minutos, seguido por etanol a 80% e a 100% por três minutos cada, e depois seque ao ar. Examine a lâmina quanto à morfologia dos cromossomos, observando a presença de cromossomos escuros que não parecem claros ou brilhantes.Indica bons cromossomos ou morfologia. Aqueça a tinta celeste. Incube a 37 graus Celsius com agitação por 20 minutos.Em seguida, agite em vórtex e centrifugue brevemente a 1000 rotações por minutos. Desnature o marcador por alguns segundos em um termociclador a 85 graus Celsius por cinco minutos, seguido por incubação a 37 graus Celsius. Aplique 10 microlitros do marcador desnaturado na área de hibridização e cubra com uma lamínula de 22 milímetros por 40 milímetros por uma hora.Certifique-se de não aprisionar bolhas de ar e feche as bordas do lamínula com cola de borracha, depois incube em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 48 a 72 horas. Remova cuidadosamente o lamínula e coloque a lâmina em um frasco de acoplamento contendo solução de lavagem recém-preparada, previamente aquecida a 45 graus Celsius. Lave por cinco minutos, três vezes, a 45 graus Celsius em banho-maria agitado a 45 rotações por minuto.Em seguida, lave as lâminas duas vezes na solução de lavagem dois a 45 graus Celsius por cinco minutos cada, com agitação, seguido por cinco minutos na solução de lavagem três a 45 graus Celsius com agitação. A seguir, aplique 80 microlitros do reagente bloqueador. Em seguida, coloque uma lamínula e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.Remova o lamínula e deixe o fluido escorrer. Adicione 80 microlitros do reagente corante sci-fi. Coloque uma lamínula e incube a 37 graus Celsius por 40 minutos. Após a incubação, lave a lâmina com solução de lavagem três vezes a 45 graus Celsius por cinco minutos cada, com agitação.Em seguida, aplique 80 microlitros do reagente corante PS 5.5. Coloque uma lamínula e incube a 37 graus Celsius por 40 minutos; após a incubação, lave três vezes com a solução de lavagem três, como antes. Por fim, incline a lâmina e permita que o fluido drene.Adicione 20 microlitros do reagente Antifa dappy e coloque um microscópio com lâmina de 24 milímetros por 60 milímetros. Cubra cuidadosamente com lamínula, removendo bolhas de ar que possam ter se formado. As lâminas podem ser analisadas imediatamente ou armazenadas a quatro graus Celsius no escuro por não mais de uma semana. Esta imagem do céu de uma metáfase normal proveniente de um camundongo selvagem foi obtida usando um microscópio Olympus equipado com uma lente de imersão em óleo de 60 vezes.Um filtro personalizado de três bandas passantes, conhecido como cubo espectral, um filtro dappy e um módulo de interferômetro sac com uma câmera CCD. Os cariótipos espectrais foram realizados utilizando o software SkyView. O painel superior esquerdo mostra a metáfase marcada espalhada, e o painel superior direito mostra uma imagem de campo claro do espalhamento.O painel inferior mostra o cromossomo organizado em ordem crescente utilizando o software skyview. Esta imagem do céu de uma preparação de metáfase de um camundongo com deleção homozigótica de pkd um mostra número anormal de cromossomos, onde estão presentes 68 cromossomos em vez de 40. Também são visíveis anormalidades cromossômicas, como a deleção do cromossomo oito e translocações cromossômicas, tais como aquelas entre os cromossomos cinco e 16, e também entre os cromossomos 11 e 19.Esta imagem de céu de uma metáfase espalhada de cromossomos humanos provenientes do tecido vascular de um paciente não A-D-P-K-D apresenta o cariótipo feminino normal de 44 autossomos e dois cromossomos XXX. Esta imagem final de céu mostra uma metáfase espalhada do tecido vascular de um paciente com A-D-P-K-D, com um cariótipo anormal de 88 autossomos e quatro cromossomos sexuais XXXX. Um mestre.Essa técnica pode ser realizada em cinco dias se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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