Name: A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Aprenda a técnica de microscopia TIRF para visualizar em tempo real a sinalização do receptor de células T e o recrutamento de proteínas como ZAP-70 em microclusters. Este método oferece alta resolução para estudar dinâmicas de sinalização em imunologia.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, National Institutes of Health. Somos gratos a Johannes Huppa e Mark Davis para fornecer-nos com o scFv de H57 usada nesses estudos. RV gostaria de agradecer Keir Neumann para discussão útil durante o desenvolvimento desta técnica.

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</ol>

Todos os animais utilizados nos experimentos foram mantidos em um ambiente livre de patógenos específicos, e os experimentos foram aprovadas pelos Institutos Nacionais de Saúde Animal e Uso Comissão.

Descrevemos aqui um sistema para estudar a sinalização em antigénio específicos células de ratinho primárias T utilizando TIRFM e bicamadas lipídicas de vidro com suporte como APCs artificiais. A técnica baseia-se com sucesso expressando as proteínas GFP etiquetados nestas células. Transfecção de células T é sempre uma tarefa desafiadora. Tipicamente, electroporação ou gene de entrega utilizando retrovírus ou lentivírus são utilizados. Uma técnica não é superior em relação ao outro, ambos têm as suas limitações e vantagens. Descobrimos que a electroporação tem as seguintes vantagens: 1) Não é necessário que as células se dividem activamente como é exigido para os retrovírus, mas não lentivírus, e 2) O nível de expressão pode ser controlada através da variação do tempo as células são incubadas antes de imagem. A maior desvantagem é que achamos muito difícil expressar as proteínas que são de tamanho grande em células primárias. Nós apresentamos um método que nos dá a viabilidade celular muito bom após a eletroporação. Como um resultado disso, é applicable a usá-la para alcançar siRNA silenciamento gênico mediado. Também descrevemos aqui uma personalização de dois canais microscópio TIRF simultânea aquisição que é cromaticamente corrigida e não requer alinhamento separado para comprimentos de onda diferentes. Estas capacidades, no entanto, estão disponíveis comercialmente. Nosso sistema é baseado em princípios de microscopia TIRF publicado por especialistas na área e é mais barato do que as alternativas comerciais. Uma possível crítica de nosso projeto é que nós estamos usando o mesmo ângulo de incidência para os comprimentos de onda de excitação diferentes. Isto resultaria em uma profundidade de penetração diferente TIRF para comprimentos de onda de excitação diferentes. Pensamos que estes efeitos são pequenas, porque a onda evanescente é um campo exponencialmente em decomposição e da profundidade do campo TIRF é uma função linear de comprimento de onda. Fluoróforos próximas da superfície de vidro irá experimentar qualquer diferença na intensidade do laser entre os dois comprimentos de onda. Para fluoróforos perto do PEprofundidade netration, a diferença de intensidade será 1,3 vezes maior para os dois comprimentos de onda 488 e 640 nm e 1,15 de dobragem para os dois comprimentos de onda 488 e 561 nm. O mesmo sistema pode ser utilizado em conjunto com técnicas de resolução super que fazem uso de iluminação TIRF. Nós também descrito um sistema de câmara de duas, que é construído personalizado. Tal como o sistema TIRF, aparelhos semelhantes estão também comercialmente disponíveis. Nosso sistema oferece flexibilidade para mudar os filtros e dicróicas, permitindo sua utilização com diferentes combinações de comprimentos de onda. O inconveniente do nosso sistema é o grau de rotação um necessária para alinhar as duas imagens. Este problema pode ser resolvido usando suportes da câmara que são acionados piezo e oferecem graus de rotação do alinhamento. Também implementada com sucesso um sistema de câmara de dois sobre este microscópio, no qual as câmaras são diferentes e têm tamanhos de pixel diferentes. Um sistema como este seria útil se uma necessária sensibilidade em um canal e um grande dyfaixa dinâmica em outro, ambos os quais são raramente disponível na mesma câmara. Utilizou-se o Photometrics câmara HQ-2 a binning 2x2 nos dando um tamanho de pixel eficaz de 12,9 uM com a câmara de Photometrics Quant-EM que tem um tamanho de pixel de 16 uM. Um tubo de 180 milímetros lente de distância focal foi utilizado para a Quant-EM e uma lente 145 milímetros de comprimento focal tubo foi utilizado para a câmara HQ-2. A HQ-2 foi controlado usando Metamorph software eo Quant-EM foi controlada através do gestor de micro-software em um computador separado no modo de disparo externo. O gatilho externo foi fornecido com a câmera Quant-EM utilizando uma saída digital da placa DAC medição de informática, que foi implementado como um obturador adicional nas configurações configure iluminação de Metamorph. A razão entre as distâncias focais das lentes de tubo corresponde a razão entre os tamanhos de pixel eficazes. Um alinhamento representativo é mostrado na Figura 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit para células T rato </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Para preps endotoxinas livres de DNA </td></tr><tr><td> Amaxa dispositivo Nucleofector </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante IL-2 murina </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microesferas 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-bem câmaras lamela </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

a técnica de microscopia tirf para imagens em tempo real, simultâneo da tcr e seus associados proteínas sinalizadoras

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Sinalização é iniciada através do receptor de célula T (TCR) quando ele está envolvida por fragmentos antigénicos peptídicos ligados por Complexo Principal de Histocompatibilidade (pMHC) proteínas expressas na superfície de células apresentadoras de antigénio (APCs). O complexo TCR é composto do heterodímero TCRαβ ligação do ligando que associa não covalentemente com CD3 dímeros (os εδ e εγ heterodímeros e do homodímero ζζ) 1. Após acoplamento do receptor, as cadeias zeta CD3 são fosforilados pela quinase da família Src, Lck. Isto leva ao recrutamento da família Syk quinase, ZAP70, que é então fosforilada e activado por Lck. Depois disso, o adaptador de ZAP70 fosforila as proteínas LAT e SLP76, iniciando a formação do complexo de sinalização proximal contendo um grande número de diferentes moléculas sinalizadoras 2. A formação deste complexo eventualmente resulta em cálcio e Ras-dependente traactivação nscription fator ea consequente início de uma série complexa de programas de expressão génica que dão origem a diferenciação de células T 2. Sinais de TCR (eo estado resultante da diferenciação) são modulados por muitos outros fatores, incluindo a potência antígeno e crosstalk com co-stimulatory/co-inhibitory, quimiocinas e receptores de citocinas 3-4. Estudar a organização espacial e temporal do complexo de sinalização proximal sob condições de estimulação diversas é, portanto, a chave para a compreensão da TCR via de sinalização, bem como sua regulamentação por outras vias de sinalização. Um sistema de modelo muito útil para estudar a sinalização iniciada pelo TCR na membrana plasmática de células T é bicamadas lipídicas de vidro-suportados, como descrito anteriormente 5-6. Eles podem ser utilizados para apresentar complexos antigénicos pMHC, adesão e moléculas co-estimulatórias em células T, que serve como APCs artificiais. Por imagem das células T a interagir com obicamada lipídica usando microscopia de fluorescência interna total reflexão (TIRFM), podemos limitar a excitação para dentro de 100 nm do espaço entre o vidro ea superfície da célula 7-8. Isto permite-nos a imagem em primeiro lugar os eventos de sinalização que ocorre na membrana plasmática. À medida que está interessado em imagiologia o recrutamento de proteínas de sinalização para o complexo TCR, nós descrevemos um de dois câmara TIRF sistema de imagem, em que o TCR, rotulado com Fab fluorescente (antigénio fragmento de ligação) fragmentos do anticorpo H57 (purificada a partir de hibridoma H57-597 , ATCC Número, ATCC: HB-218) que é específico para TCRβ, e as proteínas de sinalização, marcado com GFP, pode ser trabalhada em simultâneo e em tempo real. Esta estratégia é necessário devido à natureza altamente dinâmico de ambas as células T e dos eventos de sinalização que estão a ocorrer no TCR. Esta modalidade de imagem tem permitido aos pesquisadores ligantes de imagens simples 9-11, bem como o recrutamento de moléculas sinalizadoras a receptores ativados eé um excelente sistema para estudar bioquímica in-situ 12-16.

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

A sinalização é iniciada através do Receptor de Células T (TCR) quando este é engajado por fragmentos de peptídeos antigênicos ligados ao Complexo Principal de Histocompatibilidade...

Este vídeo descreve um procedimento para acompanhar eventos de sinalização do receptor de células T utilizando aquisição simultânea em dois canais. A microscopia de fluorescência por reflexão total interna, ou microscopia TIRF, é usada inicialmente em células T transfectadas com um plasmídeo que codifica a proteína ZAP-70 marcada com GFP. Uma bicamada lipídica suportada em vidro, que incorpora peptídeos ancorados a lipídios, complexos peptídeo-MHC, moléculas de adesão e moléculas coestimulatórias é preparada.As células T transfectadas com ZAP 70 são adicionadas à bicamada quando os receptores de células T são ligados por complexos peptídeo-MHC. As cadeias CD3 associadas ao receptor de células T são fosforiladas pela quinase da família SARC, LCK, e a quinase ZAP 70 é recrutada a partir do citoplasma. Em seguida, o receptor de células T é marcado fluorescentemente e é realizada a imagem, na qual as células são imersas em meio com índice de refração mais baixo que o do vidro de cobertura e iluminadas por um feixe a laser em um ângulo que sofre reflexão interna total.Isso gera uma onda evanescente na interface entre o vidro e a água, que decai exponencialmente no meio, permitindo uma profundidade de penetração de 100 a 200 nanômetros. Assim, apenas os fluoróforos na membrana plasmática ou muito próximos a ela são excitados. A análise das imagens resultantes revela que a sinalização ocorre em microagregados do receptor de células T.A principal vantagem da microscopia TIRF ou da microscopia confocal convencional é que se obtém uma melhor resolução, permitindo visualizar facilmente aglomerados de sinalização ou complexos de sinalização, como microaglomerados de TCR. Travis Crites e Chen, ambos pós-doutorandos no meu laboratório, demonstrarão como transfectar linfócitos T primários de camundongo utilizando a tecnologia de nucleofecção maxi e, em seguida, imagi-los por microscopia de fluorescência com reflexão interna total ou TIRF, estimulados com uma bicamada lipídica de vidro contendo antígeno.Este método tem sido amplamente utilizado para estudar a sinalização em diversos tipos de células imunológicas, incluindo células T, células B, células natural killer e células mastócitos. O método é amplamente aplicável e pode ser usado para estudar a maioria dos sistemas de receptores em células de mamíferos, especialmente quando a sinalização ocorre em aglomerados. Pessoas novas no método podem ter dificuldades inicialmente, pois as células T são muito difíceis de transfectar.Além disso, é necessária uma coordenação precisa para que a viabilidade e eficiência de transfeção de linfócitos T, a qualidade do bilar e o alinhamento do microscópio estejam adequados. O primeiro passo deste procedimento consiste em transfectar linfócitos T primários naïve ou ativados in vitro com plasmídeos de expressão que codificam moléculas sinalizadoras marcadas com GFP, utilizando um kit nucleofector para linfócitos T de camundongo AM maxa. Todos os linfócitos T utilizados neste estudo expressavam o A-N-D-T-C-R que reconhece o peptídeo MCC encontrado na molécula de MHC IE de K. O procedimento de transfeção aqui apresentado é realizado de acordo com as recomendações do fabricante.No entanto, algumas dicas são apresentadas que promovem a viabilidade dos linfócitos T após a transfeção. Tanto a viabilidade quanto a eficiência de transfeção são maiores em linfócitos T ativados in vitro do que em células ingênuas, e, portanto, este protocolo utiliza linfócitos T ativados in vitro antes do início. Prepare dois mililitros de meio suplementado para linfócitos T para cada transfeção, combinando 1,9 mililitro do meio fornecido no kit, 20 microlitros do componente A, 20 microlitros do componente B e 100 microlitros de soro bovino fetal em um tubo de dois mililitros.Transfira dois mililitros de meio para cada poço de uma placa de 12 poços. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora para permitir que o meio equilibre; a morte celular resultará da suspensão de células transfectadas em meio frio ou que não esteja em um pH de 7,2. Para preparar a mistura de transfeção, combine 82 microlitros de solução nucleoefetora para linfócitos T de camundongo com 18 microlitros do suplemento dois e cinco microgramas de DNA plasmidial livre de endotoxinas em uma concentração não inferior a 0,5 microgramas por microlitro, misturando bem batendo levemente no tubo.Transfira de cinco a dez milhões de células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros, centrifugue a 75 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente após a centrifugação. Utilize um aspirador a vácuo para remover o máximo possível do sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular na mistura de transfeção, aspirando suave e lentamente o pellet celular três a quatro vezes até que não restem grandes agregados celulares. Com o auxílio de uma pipeta, transfira cuidadosamente a suspensão para um vete amaxa certificado, garantindo que não haja bolhas presentes.Tampe o qve e selecione o programa efetor nuclear X 0 0 1 no dispositivo efetor nuclear. Insira o vete no suporte Q vete e pressione o botão para aplicar o programa selecionado. Em seguida, transfira imediatamente o vete e o meio de cultura pré-equilibrado para a cabine de segurança.Usando a pipeta de plástico fornecida, adicione aproximadamente 500 microlitros do meio previamente equilibrado ao vete. Em seguida, adicione a suspensão celular ao meio na placa. Gota a gota.Incube as células a 37 graus Celsius durante quatro horas para permitir a expressão em baixo nível das proteínas marcadas com GFP e para minimizar o aparecimento de artefatos decorrentes da superexpressão. Nesta seção, descreve-se um método para alinhar o microscópio para aquisição simultânea de imagens em dois canais, antes de ligar todos os componentes do microscópio. Ligue o computador e o software.Em seguida, certifique-se de que todos os componentes de hardware sejam reconhecidos pelo software. Como o software é iniciado sem mensagens de erro, todos os componentes foram detectados. Dilua um microlitro da sub resolução.Adicione as microesferas fluorescentes brilhantes Flores em dois mililitros de PBS para uso como padrão de colocalização. Em seguida, adicione 0,25 mililitros da suspensão de microesferas a cada poço de um sistema de lâmina de cobertura com oito poços da Lab Tech. Coloque o sistema de lâmina de câmara sobre a plataforma acima do objetivo.Em seguida, traga as microesferas absorvidas para o vidro em foco na pré-visualização ao vivo. O painel esquerdo é o canal no qual as células transfectadas com GFP serão visíveis. O painel direito mostrará o TCR marcado durante os experimentos de imagem em tempo real de células vivas.Usando o alinhamento Y do lançamento de fibra XY, Z, ajuste a posição do feixe a laser de modo que o feixe saia pela objetiva e seja projetado no teto. É importante fazer isso quando a objetiva estiver na posição em que o plano de vidro está em foco. Se o feixe no teto estiver difuso, o feixe não está colimado.Ajuste o micrômetro Z para obter a colimação total do teste de colimação para cada uma das linhas a laser que serão utilizadas no experimento. Em seguida, utilizando um medidor de potência a laser, ajuste a potência do laser para 20 a 30 micro watts em cada canal. Os linfócitos T são extremamente sensíveis à radiação a laser e a iluminação é limitada a um total combinado de 50 micro watts.A seguir, ajuste o ângulo para o gramado. Gire o micrômetro de alinhamento Y no lançamento da fibra para mover o feixe para longe do teto até que seu ângulo em relação ao eixo óptico do objetivo se aproxime de 90 graus.Uma vez atingido o ângulo crítico para reflexão interna total, a luz do laser não sairá mais do objetivo. Para avaliar se o alinhamento do gramado foi alcançado, foque para cima e para baixo através do plano do vidro de cobertura. Observe aqui que, quando as microesferas absorvidas à superfície saem do foco, muitas microesferas podem ser vistas flutuando na solução. Para obter um bom alinhamento do gramado, é necessário aumentar o ângulo do feixe em relação ao objetivo.À medida que o ângulo do feixe é aumentado, as microesferas que estão flutuando próximo à superfície começam a desaparecer e a intensidade das microesferas absorvidas na interface aumenta. Agora, quando as microesferas adicionadas e absorvidas na interface são tiradas de foco, nenhuma microesfera flutuando na solução permanece visível. Neste ponto, o sistema está corretamente alinhado, pois somente as microesferas que estão absorvidas na lamela de cobertura conseguem estar em foco.Em seguida, para alinhar os canais fluorescentes vermelho e verde um em relação ao outro, foque nas esferas e compare a posição de características identificáveis nas imagens produzidas em ambos os canais. Utilizando os parafusos micrométricos X e Y em um dos suportes da câmera, aproxime ao máximo a posição relativa das esferas. Observe a esfera brilhante no quadrante inferior esquerdo de ambas as imagens para garantir o alinhamento espacial entre os dois canais.Este recurso é levado à mesma posição relativa em ambas as imagens. Capture e salve a imagem de ambos os canais. Essas imagens serão utilizadas como padrão de colocalização para alinhar os dois canais.Um exemplo desse alinhamento é visto aqui antes do alinhamento. Um dos canais está rotacionado em relação ao outro, conforme mostrado nesta imagem, na qual as imagens dos dois canais das microesferas de sub-resolução são sobrepostas. Após os ajustes, as imagens são alinhadas conforme mostrado aqui.A qualidade do alinhamento pode ser analisada mais detalhadamente comparando imagens de células vivas transfectadas com GFP. Observe como os estágios Laila dos dois canais estão perfeitamente alinhados após o alinhamento das duas imagens utilizando a calibração estabelecida com microesferas fluorescentes.Uma vez que o microscópio esteja montado, preparam-se câmaras de fluxo contendo bicamadas lipídicas suportadas em vidro apresentando antígeno e realiza-se o turf M para visualizar células T TRANSFECCIONADAS interagindo com o substrato primeiro. Seguindo o protocolo descrito por Ana e Dustin, monte uma câmara de fluxo com bicamadas lipídicas planares formadas sobre uma lamínula de vidro contendo lipídios NI NTA, a molécula de adesão ICAM-1 e complexos peptídeo-MHC. Os IEFK carregados com MCC são incorporados na bicamada por meio de marcações de histidina.A molécula coestimuladora CD80 é incorporada. Utilizando uma âncora GPI, coloque a câmara de fluxo na platina do microscópio e estabilize-a fixando a câmara a uma placa adaptadora na platina do microscópio com uma barra de tensão para imobilizá-la. Em seguida, fixe o elemento aquecedor fornecido pelo fabricante na câmara de fluxo para controlar sua temperatura.Posicione o objetivo sobre uma bicamada e coloque o plano da bicamada em foco para ativar o aquecimento do objetivo e da célula de fluxo; ligue os aquecedores da célula de fluxo e do objetivo para elevar a temperatura da câmara a 37 graus Celsius. Após quatro horas de incubação, transfira os linfócitos T seccionados para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a uma velocidade de 80 vezes G. Re-suspenda as células em 300 microlitros de tampão H-B-S-B-S-A. Em seguida, adicione o fragmento FAB H57 ou o fragmento variável de cadeia simples H57 para marcar o TCR, obtendo uma concentração final de 10 microgramas por mililitro para o FAB ou 20 microgramas por mililitro para o fragmento variável de cadeia simples.Transfira as células para um tubo fax de cinco mililitros. Em seguida, utilizando uma seringa de ponta lisa de um mililitro, injete as células na câmara de fluxo por meio de uma válvula de três vias. Configure as condições de imagem para que a aquisição simultânea em dois canais mostre uma pré-visualização em tempo real dos canais TCR e GFP e localize um campo com células transfectadas.Devido às diferenças de intensidade entre o TCR e a GFP, a escala das imagens pode precisar ser ajustada em tempo real para que as células possam ser visualizadas em ambos os canais. Como é o caso aqui, confirme a iluminação do campo observando o plano de vidro para detectar qualquer marcação da membrana lateral. Se as membranas laterais não entrarem em foco, então o alinhamento do campo está adequado.Nesta prévia ao vivo, a coloração da membrana lateral é aparente tanto no plano da lamínula quanto quando a lamínula é desfocada para alinhar adequadamente o microscópio com o terreno. O ângulo do laser em relação ao objetivo é aumentado e a membrana lateral sai de foco. Inicie a captura de imagens individuais e sequências de lapso de tempo com um intervalo de 10 segundos.As células foram incubadas por cinco minutos em lâminas de vidro com bicamadas suportadas contendo seis moléculas por micrômetro quadrado de peptídeo carregado da histidina marcada IEFK, 100 moléculas por micrômetro quadrado da ICAM-1 marcada com histidina conjugada à Alexa 647 e 100 moléculas por micrômetro quadrado de CD80 ancorado por GPI. A microscopia TIRF de dois canais com aquisição simultânea foi realizada na presença contínua do fragmento FAB H57 conjugado à Alexa 546.Para a coloração do TCR, as células foram visualizadas até uma hora após o contato inicial com a bicamada. O número de aglomerados de ZAP 70 por célula foi analisado utilizando um software automatizado de contagem de aglomerados. Pelo menos 40 células foram analisadas em cada caso.Os peptídeos carregados estão indicados na figura interna. ICAM um refere-se a células em bicamadas contendo 100 moléculas por micrômetro quadrado de Alexa 647 conjugada. His marcado ICAM um conforme mostrado na figura, a sinalização dependente de zap 70 ocorre em microagregados de TCR e somente em resposta a ligantes agonistas, como pode ser visto neste filme, obtido a 10 segundos por quadro.A sinalização do TCR em resposta a peptídeos agonistas é sustentada pela geração contínua de microagregados de TCR na periferia da área de contato, que recrutam ZAP 70. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar linfócitos T primários utilizando uma tecnologia de eletroporação nuclear e imagens adequadas do recrutamento de moléculas sinalizadoras GFP a microagregados de TCR usando microscopia TIRF. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete horas, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular suas células primárias com muito cuidado. Quanto mais saudáveis forem as células em cada etapa do experimento, maior será a eficiência de transfeção e maior o número de células que você capturará na sua imagem. Os linfócitos T são altamente móveis e, como resultado, a aquisição sequencial das imagens nos canais de TCR e GFP faz com que as duas imagens não se alinhem perfeitamente devido ao movimento dos microagregados de TCR e das células.Para superar esse problema, desenvolvemos o microscópio turf de aquisição simultânea em canal duplo.

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Aprenda a técnica de microscopia TIRF para visualizar em tempo real a sinalização do receptor de células T e o recrutamento de proteínas como ZAP-70 em microclusters. Este método oferece alta resolução para estudar dinâmicas de sinalização em imunologia.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

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