A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Este vídeo descreve um procedimento para acompanhar eventos de sinalização do receptor de células T utilizando aquisição simultânea em dois canais. A microscopia de fluorescência por reflexão total interna, ou microscopia TIRF, primeiramente transfecta as células T com um plasmídeo que codifica a proteína ZAP-70 marcada com GFP. Um bicamada lipídica suportada em vidro, que incorpora um peptídeo ancorado a lipídios, complexos peptídeo-MHC, moléculas de adesão e moléculas coestimulatórias é preparado.

As células T transfectadas com ZAP 70 são adicionadas à bicamada quando os receptores de células T são ligados por complexos peptídeo-MHC. As cadeias CD3 associadas ao receptor de células T são fosforiladas pela quinase da família SARC, LCK, e a quinase ZAP 70 é recrutada a partir do citoplasma. O receptor de células T é então marcado fluorescentemente e é realizada a imagem, na qual as células estão imersas em meio com índice de refração mais baixo do que o do vidro de cobertura e iluminadas por um feixe a laser em um ângulo que sofre reflexão interna total.

Isso gera uma onda evanescente na interface entre o vidro e a água, que decai exponencialmente no meio, permitindo uma profundidade de penetração de 100 a 200 nanômetros. Assim, apenas os fluoróforos na membrana plasmática ou muito próximos a ela são excitados. A análise das imagens resultantes revela que a sinalização ocorre em microagregados do receptor de células T.

A principal vantagem da microscopia TIRF ou da microscopia confocal convencional é que se obtém uma resolução melhor, de modo que aglomerados de sinalização ou complexos de sinalização, como microaglomerados de TCR, são facilmente visualizados. Travis Crites e Chen, ambos pós-doutorandos no meu laboratório, demonstrarão como transfectar linfócitos T primários de camundongo utilizando a tecnologia de nucleofecção maxi e, em seguida, imagiá-los usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total ou TIRF, estimulados com uma bicamada lipídica de vidro contendo antígeno.

Este método tem sido amplamente utilizado para estudar a sinalização em diversos tipos de células imunes, incluindo células T, células B, células natural killer e células mastócitos. O método é amplamente aplicável e pode ser usado para estudar a maioria dos sistemas de receptores em células de mamíferos, especialmente se a sinalização ocorrer em aglomerados. Indivíduos novos no método podem ter dificuldades inicialmente, pois as células T são muito difíceis de transfectar.

Além disso, é necessária uma coordenação precisa para que a viabilidade dos linfócitos T e a eficiência de transfeção, a qualidade do bilar e o alinhamento do microscópio estejam adequados. O primeiro passo deste procedimento é transfectar linfócitos T primários ingênuos ou activados in vitro com plasmídeos de expressão que codificam moléculas sinalizadoras marcadas com GFP, utilizando um kit efetor nucleotídico para linfócitos T de camundongo AM maxa. Todos os linfócitos T utilizados neste estudo expressavam o A-N-D-T-C-R que reconhece o peptídeo MCC ligado à molécula MHC IE de K. O procedimento de transfeção aqui apresentado é realizado de acordo com as recomendações do fabricante.

No entanto, algumas dicas são apresentadas que promovem a viabilidade dos linfócitos T após a transfeção. Tanto a viabilidade quanto a eficiência de transfeção são maiores em linfócitos T ativados in vitro do que em células ingênuas; portanto, este protocolo utiliza linfócitos T ativados in vitro antes do início. Prepare dois mililitros de meio suplementado para linfócitos T para cada transfeção, combinando 1,9 mililitro do meio fornecido no kit, 20 microlitros do componente A, 20 microlitros do componente B e 100 microlitros de soro bovino fetal em um tubo de dois mililitros.

Transfira dois mililitros de meio para cada poço de uma placa de 12 poços. Coloque a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora para permitir a equilibração do meio, pois a morte celular resultará da suspensão de células transfectadas em meio frio ou que não esteja em um pH de 7,2. Para preparar a mistura de transfeção, combine 82 microlitros de solução nucleoefetora para linfócitos T de camundongo com 18 microlitros do suplemento dois e cinco microgramas de DNA plasmidial livre de endotoxinas em uma concentração não inferior a 0,5 microgramas por microlitro, misturando bem batendo levemente.

Transfira de cinco a dez milhões de células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros, centrifugue a 75 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente após a centrifugação. Use um aspirador a vácuo para remover o máximo possível do sobrenatante a fim de ressuspender o pellet celular na mistura de transfeção, pipetando suave e lentamente o pellet celular de três a quatro vezes até que não restem grandes agregados celulares. Com o auxílio de uma pipeta, transfira cuidadosamente a suspensão para um vete amaxa certificado, garantindo que não haja bolhas presentes.

Tampe o qve e selecione o programa nuclear efetor X 0 0 1 no dispositivo efetor nuclear. Insira o vete no suporte Q vete e pressione o botão para aplicar o programa selecionado. Em seguida, transfira imediatamente o vete e o meio de cultura pré-equilibrado para a cabine de segurança.

Usando a pipeta plástica fornecida, adicione aproximadamente 500 microlitros do meio previamente equilibrado ao vete. Em seguida, adicione a suspensão celular ao meio na placa. Gota a gota.

Incube as células a 37 graus Celsius durante quatro horas para permitir a expressão em baixo nível das proteínas marcadas com GFP e minimizar o aparecimento de artefatos decorrentes da superexpressão. Nesta seção, é descrito um método para alinhar o microscópio para a aquisição simultânea de imagens em dois canais antes de ligar todos os componentes do microscópio. Ligue o computador e o software.

Em seguida, certifique-se de que todos os componentes de hardware sejam reconhecidos pelo software. Como o software inicia sem mensagens de erro, todos os componentes foram detectados. Dilua um microlitro da sub resolução.

Adicione as microesferas fluorescentes brilhantes de Flores a dois mililitros de PBS para uso como padrão de colocalização. Em seguida, adicione 0,25 mililitros da suspensão de microesferas a cada poço de um sistema de lâmina de cobertura com oito poços da Lab Tech. Coloque o sistema de lâmina com câmara sobre a plataforma acima do objetivo.

Em seguida, coloque as microesferas absorventes em foco no vidro na pré-visualização ao vivo. O painel esquerdo é o canal no qual as células transfectadas com GFP serão visíveis. O painel direito mostrará o TCR marcado durante os experimentos de imagem de células vivas.

Usando o alinhamento Y do lançamento de fibra XY, Z, ajuste a posição do feixe a laser de modo que o feixe saia pela objetiva e seja projetado no teto. É importante fazer isso quando a objetiva estiver na posição em que o plano de vidro está em foco. Se o feixe no teto estiver difuso, o feixe não está colimado.

Ajuste o micrômetro Z para obter a colimação total para cada uma das linhas a laser a serem utilizadas no experimento. Em seguida, utilizando um medidor de potência a laser, ajuste a potência do laser para 20 a 30 micro watts para cada canal. Os linfócitos T são extremamente sensíveis à radiação a laser e a iluminação é limitada a um total combinado de 50 micro watts.

A seguir, ajuste o ângulo para o gramado. Gire o micrômetro de alinhamento Y no lançamento da fibra para mover o feixe para longe do teto até que seu ângulo em relação ao eixo óptico do objetivo se aproxime de 90 graus.

Uma vez atingido o ângulo crítico para reflexão interna total, a luz do laser não sairá mais do objetivo. Para avaliar se o alinhamento do tapete foi alcançado, foque para cima e para baixo através do plano do coverslip. Observe aqui que, quando as microesferas aderidas à superfície saem de foco, muitas microesferas podem ser vistas flutuando em solução. Para obter um bom alinhamento do tapete, é necessário aumentar o ângulo do feixe em relação ao objetivo.

À medida que o ângulo do feixe aumenta, as microesferas que estão flutuando próximo à superfície começam a desaparecer e a intensidade das microesferas absorvidas na interface aumenta. Agora, quando as microesferas adicionadas e absorvidas na interface são tiradas de foco, nenhuma microesfera flutuando em solução permanece visível. Neste ponto, o sistema está corretamente alinhado, pois somente as microesferas que estão absorvidas na lamínula são capazes de estar em foco.

Em seguida, para alinhar os canais fluorescentes vermelho e verde um em relação ao outro, foque nas esferas e compare a posição de características identificáveis nas imagens produzidas em ambos os canais. Utilizando os parafusos micrométricos X e Y em um dos suportes da câmera, aproxime ao máximo a posição relativa das esferas. Observe a esfera brilhante no quadrante inferior esquerdo de ambas as imagens para garantir o alinhamento espacial entre os dois canais.

Este recurso é levado à mesma posição relativa em ambas as imagens. Capture e salve a imagem de ambos os canais. Essas imagens serão utilizadas como padrão de colocalização para alinhar os dois canais.

Um exemplo desse alinhamento é visto aqui antes do alinhamento. Um dos canais está rotacionado em relação ao outro, conforme mostrado nesta imagem, na qual as imagens dos dois canais das microesferas abaixo da resolução são sobrepostas. Após os ajustes, as imagens são alinhadas conforme mostrado aqui.

A qualidade do alinhamento pode ser ainda mais analisada comparando imagens de células vivas transfectadas com GFP. Observe como o palco Laila dos dois canais está perfeitamente alinhado. Após o alinhamento das duas imagens usando a calibração estabelecida com as microesferas fluorescentes.

Uma vez que o microscópio esteja configurado, preparam-se câmaras de fluxo contendo bicamadas lipídicas suportadas em vidro com antígenos apresentados e realiza-se a técnica turf M para visualizar primeiramente as células T TRANSFECCIONADAS interagindo com o substrato. Seguindo o protocolo descrito por Ana e Dustin, monte uma câmara de fluxo com bicamadas lipídicas planares formadas sobre uma lamínula de vidro contendo lipídios NI NTA, a molécula de adesão ICAM um e complexos peptídeo-MHC. Os IEFK carregados com MCC são incorporados na bicamada por meio de marcações de histidina.

A molécula coestimuladora CD80 é incorporada. Utilizando uma âncora GPI, coloque a cubeta de fluxo na platina do microscópio e estabilize-a fixando a câmara a uma placa adaptadora na platina do microscópio com uma barra de tensão para imobilizá-la. Em seguida, fixe o elemento aquecedor fornecido pelo fabricante na cubeta de fluxo para controlar sua temperatura.

Posicione o objetivo sobre uma bicamada e coloque o plano da bicamada em foco para ativar o aquecimento do objetivo e da célula de fluxo; ligue os aquecedores da célula de fluxo e do objetivo para elevar a temperatura da câmara a 37 graus Celsius. Após quatro horas de incubação, transfira os linfócitos T seccionados para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a uma velocidade de 80 vezes G. Resuspenda as células em 300 microlitros de tampão H-B-S-B-S-A. Em seguida, adicione H 57 FAB ou fragmento variável de cadeia simples H 57 para marcar o TCR até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro para o FAB ou 20 microgramas por mililitro para o fragmento variável de cadeia simples.

Transfira as células para um tubo fax de cinco mililitros. Em seguida, utilizando uma seringa de um mililitro com ponta lisa, injete as células na câmara de fluxo por meio de uma válvula de três vias. Configure as condições de imagem para que a aquisição simultânea em dois canais mostre uma pré-visualização em tempo real dos canais TCR e GFP e localize um campo com células transfectadas.

Devido às diferenças de intensidade entre o TCR e a GFP, a escala das imagens pode precisar ser ajustada em tempo real para que as células possam ser visualizadas em ambos os canais. Como é o caso aqui, confirme a iluminação do campo observando o plano de vidro para detectar qualquer marcação da membrana lateral. Se as membranas laterais não entrarem em foco, então o alinhamento do campo está adequado.

Nesta pré-visualização ao vivo, a coloração da membrana lateral é aparente tanto no plano da lamínula quanto quando a lamínula é desfocada para alinhar adequadamente o microscópio com o terreno. O ângulo do laser em relação ao objetivo é aumentado e a membrana lateral sai de foco. Inicie a captura de imagens individuais e sequências de lapso de tempo com um intervalo de 10 segundos.

As células foram incubadas por cinco minutos sobre lâminas de vidro com bicamadas contendo seis moléculas por micrômetro quadrado de peptídeo carregado com marcação histidina (hist-tagged) IEFK, 100 moléculas por micrômetro quadrado de ICAM-1 marcado com Alexa 647 e marcação histidina, e 100 moléculas por micrômetro quadrado de CD80 ancorado por GPI. A microscopia TIRF de dois canais com aquisição simultânea foi realizada na presença contínua do fragmento FAB H57 conjugado com Alexa 546.

Para corar as células TCR, as imagens foram obtidas até uma hora após o contato inicial com a bicamada. O número de aglomerados de ZAP 70 por célula foi analisado utilizando um software automatizado de contagem de aglomerados. Pelo menos 40 células foram analisadas em cada caso.

Os peptídeos carregados são indicados na inserção. ICAM um refere-se a células em bicamadas contendo 100 moléculas por micrômetro quadrado de Alexa 6 4 7 conjugada. His marcado ICAM um conforme mostrado na figura, ocorre sinalização dependente de zap 70 em microagregados de TCR e somente em resposta a ligantes agonistas, como pode ser visto neste filme, obtido a 10 segundos por quadro.

O sinalização do TCR em resposta a peptídeos agonistas é mantida pela geração contínua de microagregados de TCR na periferia da área de contato, que recrutam ZAP 70. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar linfócitos T primários utilizando uma tecnologia de eletroporação nuclear maxa e imagens adequadas do recrutamento de moléculas sinalizadoras GFP para microagregados de TCR usando microscopia TIRF. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular as células primárias com muito cuidado. Quanto mais saudáveis forem as células em cada etapa do experimento, maior será a eficiência de transfeção e maior o número de células que você conseguirá capturar na sua imagem. Os linfócitos T são altamente móveis, e como resultado, a aquisição sequencial das imagens nos canais TCR e GFP faz com que as duas imagens não se alinhem perfeitamente devido ao movimento dos microagregados de TCR e das células.

Para superar esse problema, desenvolvemos o microscópio turf de aquisição simultânea em dois canais.