Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

O objetivo geral deste procedimento é incorporar um transportador A, b, C. Neste caso, o transportador de maltose malf GK dois em partículas de nano disco de membrana solúvel. Isso é feito misturando primeiro a proteína MSP do andaime da membrana, com o transportador e a quantidade correta de lipídios no detergente mycells.

O segundo passo é adicionar grânulos de poliestireno e balançar suavemente a mistura durante a noite, o detergente é progressivamente absorvido pelos grânulos, permitindo a formação das partículas do nano disco. Em seguida, as contas são removidas por sedimentação. A etapa final é separar os discos devidamente formados dos agregados e proteínas de andaime desmontadas por cromatografia de filtração em gel.

Finalmente, a qualidade dos discos é avaliada por eletroforese em gel nativo ou espectroscopia de espalhamento de luz. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como lipossomas, é que as proteínas e discos de membrana são perfeitamente solúveis em solução aquosa. Além disso, os domínios da proteína agora são acessíveis de ambos os lados.

Como agora não há mais compartimento de membrana Usando proteínas de andaime de membrana de diferentes comprimentos, pude capturar e estudar os diferentes estados ligamentares das proteínas de membrana. Mais importante ainda, este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo proteômico da membrana, como a identificação de novos parceiros de ligação de transportadores a, b, C. Na verdade, as implicações dessa técnica se estendem ainda mais para a terapia porque pode ajudar na descoberta de ativadores ou inibidores de proteínas e receptores de membrana.

Embora esse método pareça simples, deve-se ter cuidado ao escolher a proporção correta de lipídios proteicos. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam para calcular a proporção correta do moldador ou fazer o controle correto que garante a qualidade da preparação. Portanto, uma demonstração visual desse método é muito útil para um novo aluno aprender as várias etapas e possíveis dificuldades.

Para começar gro hexa histidina marcada MSP em e coli cepa BL 21 DE três do plasmídeo P MSSP 1D uma produção de proteína induzida quando a densidade óptica medida a 600 nanômetros é de cerca de 0,5 por três horas a 37 graus Celsius, colha as células por centrifugação a 5.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Suspender novamente o pellet em tampão TSG 10 contendo 100 micromolares de PMSF e piolhos das células com uma prensa francesa três vezes a 8 000 PS. Eu removo o material insolúvel por centrifugação a 5.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, isolar a fracção solúvel que contém o MSP por ultracentrifugação a 125 000 Gs durante 45 minutos.

Purifique o MSP por cromatografia quelante de níquel usando aproximadamente 1,5 mililitros de seros de níquel de alto desempenho em tampão TSG 10. Lave os contaminantes com tampão T SG 10 contendo eluição ILE de 50 milimolares. O MSP com tampão TSG 10 contendo 600 milimolares I midaz após o dialisamento.

A proteína purificada no tampão TSG 10 MSP pode ser armazenada a menos 70 graus Celsius e uma concentração de proteína de aproximadamente 10 a 15 miligramas por mililitro. O complexo MALF GK dois, marcado no terminal C de MAL K, é expresso a partir do plasmídeo. PED 22 FG K cultivado em e coli cepa BL 21 DE três induzem a produção de proteínas quando a densidade óptica medida a 600 nanômetros é de cerca de 0,5 com 0,2% L de árabes por três horas a 37 graus Celsius após lise celular e centrifugação.

Como antes, suspendemos o pellet de membrana no tampão TSG 20 até uma concentração final de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, solubilize o material com 1% de peso por volume GDM por três horas a quatro graus Celsius com agitação suave. Remova o material insolúvel por ultracentrifugação quanto à purificação do MAL FTK dois.

Em seguida, recolher o sobrenadante contendo o complexo FTK dois solubilizado e purificar novamente com cromatografia quelante de níquel. Purificar ainda mais o complexo por cromatografia de filtração em gel em tampão TSGD em uma coluna SUEx 200, HR dez trezentas a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Para preparar fosfolipídios, um extrato lipídico total de E coli dissolvido em clorofórmio é separado em 1000 alíquotas anômalas em tubos de microficha com tampa de rosca, evapora o solvente sob um fluxo suave de nitrogênio e conduz ainda mais durante a noite no vácuo.

Dessecar em seguida, dissolver o filme lipídico no tampão TS a cinco concentrações finais de NMO e vórtice vigorosamente, em seguida, pulsar o sonicate cinco vezes por aproximadamente cinco segundos. Os lipídios dissolvidos parecerão ligeiramente opacos devido à sua insolubilidade geral no tampão TS aquoso, mas devem permanecer em suspensão. Adicione DDM a uma concentração final de 0,5% Neste ponto, a solução se tornará uma mistura lipídica clara em banho-maria e pulsará o sonicado cinco vezes por aproximadamente cinco segundos.

A mistura lipídica pode ser armazenada a quatro graus Celsius por no máximo uma semana. Para preparar as contas biológicas, coloque aproximadamente 10 a 15 mililitros de contas biológicas em um tubo de 50 mililitros. Primeiro, lave as contas com 50 mililitros de metanol 100%.

Deixe as contas assentarem por gravidade e, em seguida, despeje suavemente a solução. Repita o processo uma vez para metanol e depois duas vezes cada para 95% de etanol mili Q de água e, finalmente, tampão TS. Comece a constituição nano discreta diluindo o MSP no tampão TSGD até a concentração final de aproximadamente sete miligramas por mililitro ou 0,3 milimolar.

Para garantir um experimento bem-sucedido, é importante escolher as proporções corretas de lipídios e proteínas a serem misturadas. Misture aproximadamente dois M de malf GK purificado dois complexos em uma proporção de proteína para MS P para lipídios de um para três a 60 em tampão TSGD para um volume final de 300 microlitros aqui, uma amostra de excesso de lipídios na proporção de um para três para 400 também é preparada como um controle negativo em uma suspensão de 50 microlitros de bio esferas para o tubo e incube a mistura durante a noite em um mesa de balanço a quatro graus Celsius no dia seguinte, sedimentar as contas por gravidade. Uma vez que os grânulos tenham assentado, passe a solução através de uma ponta estreita para evitar o máximo possível de bio grânulos.

Remover precipitados grandes por ultracentrifugação a 100 000 GS durante 20 minutos. Proceder à purificação dos discos por cromatografia de filtração em gel, tal como realizada anteriormente no tampão TSG 10. Em seguida, injete um Eloqua na mesma coluna de filtração de gel para testar a estabilidade da preparação.

Em seguida, agrupe as frações que contêm os discos. A qualidade da preparação é avaliada por eletroforese em gel nativo. Analise um micromolar de nanodiscos para avaliar a qualidade da reconstituição.

Avalie também a ligação do mal E ao complexo mal ftk dois reconstituído em nano discos. Após a eletroforese, corar o gel com azul de kumasi por 10 minutos e deter por aproximadamente uma hora. Para realizar o espalhamento dinâmico de luz ou DLS, primeiro purifique os nano discos por cromatografia de filtração em gel como antes, usando uma coluna SUEx 200 HR dez trezentas a uma taxa de fluxo de 0,1 mililitros por minuto.

Pool frações contendo nano discos e concentrado a aproximadamente 10 miligramas por mililitro com um filtro centrífugo AmCon. Em seguida, filtre a amostra duas vezes. Realize a análise por DLS usando um instrumento dynapro nano star em um volume interno de um microlitro de dados de quartzo vete fit.

Usando o software dinâmico para estimar o diâmetro e o peso molecular das partículas, determine a atividade A TPAs de dois discos nano reconstituídos de mal FTK usando um ensaio métrico de colo. Primeiro misture um micromolar de discos purificados e um milimolar a TP com quantidades crescentes de mal. Incube as amostras a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, meça a liberação de fosfato inorgânico a 660 nanômetros. Compare a quantidade de fosfato liberada com uma curva padrão gerada com uma solução padrão de fósforo. Os nanodiscos são purificados por cromatografia de filtração em gel.

O cromatograma mostra que a maioria dos discos reconstituídos eluem como um único pico, enquanto os discos feitos com excesso de lipídios eluem no volume vazio e, como uma série de picos largos, a qualidade da preparação do disco é analisada por discos de eletroforese em gel nativo reconstituídos com uma quantidade limitada de lipídios migram como uma faixa afiada no gel nativo, enquanto aqueles reconstituídos na presença de excesso de lipídios migram como esfregaços. A análise por DLS mostra que a população de discos é homogênea, com um raio médio de 5,0 nanômetros. Com base na aproximação DLS, os discos reconstituídos têm um peso molecular aparente de 215 kilodaltons amostras reconstituídas na presença de excesso de lipídios exibem raios amplamente distribuídos em torno de 100 nanômetros, o que é típico para amostras não homogêneas.

A atividade do complexo MAL FTK dois é avaliada medindo a taxa de hidrólise de TP e a afinidade por parceiros de interação, como a proteína de ligação à maltose, MAL E, a proteína de ligação à maltose. O MAL E liga-se com alta afinidade ao transportador MAL FTK dois usando eletroforese em gel não desnaturante. É possível detectar um complexo entre MAL E e MAL ftk dois, a estimulação da atividade de MAL KA TPA por MAL E é mostrada aqui em função da concentração de MAL e.

A fabricação do nano disco é relativamente simples, mas pequenos desvios das condições ideais podem levar à agregação irreversível de proteínas, uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a importância de escolher uma proporção correta de lipídios proteicos, pois uma quantidade excessiva de lipídios levará à produção de grandes lipossomas polidispersos, como partículas. É crucial analisar cuidadosamente a qualidade do material reconstituído usando outras técnicas além da filtragem em gel, como espectroscopia de espalhamento de luz, ultracentrifugação analítica ou, mais simplesmente, eletroforese em gel nativo.

Lembre-se, o tipo de fosfolipídio que incorpora o disco, bem como a proteína do andaime da membrana, podem contribuir para a eficiência da reconstituição. Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha entendido bem como gerar nanodiscos solúveis e homogêneos contendo a proteína de membrana de sua escolha. Boa sorte com seus experimentos.