Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados In vivo

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas de unidade única in vivo de uma população identificada de neurônios em um sistema modelo não genético. Isso é feito realizando primeiro uma craniotomia para expor a região cerebral de interesse. O segundo passo é usar fios de tungstênio para colocar o corante fluorescente na região para a qual os neurônios-alvo se projetam.

Em seguida, o corante é transportado retrógrado, resultando na marcação seletiva dos neurônios de projeção. A etapa final é registrar a partir do axônio marcado do neurônio de projeção individual. Em última análise, registros extracelulares de unidade única são usados para mostrar como os neurônios sensoriais centrais em um circuito intacto respondem à estimulação sensorial em evo.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os circuitos neurológicos detectam diferenças de submilissegundos no tempo das entradas sinápticas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é a capacidade de atingir neurônios individuais ou mesmo axônios e sistemas não geneticamente acessíveis. Os peixes elétricos semanais usam sinais elétricos para comunicação e navegação.

Eles distinguem sinais de diferentes peixes usando diferenças de submilissegundos no tempo das entradas sinápticas. Perguntamos como os neurônios comparadores de tempo presumidos em seu circuito eletrossensorial são capazes de detectar diferenças de tempo tão pequenas. Mas essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas, como vias sensoriais visuais e auditivas.

É particularmente difícil de liquidar a partir dessas células por causa do pequeno tamanho denso atolamento no tecido circundante e nos terminais pré-sinápticos que cobrem a maior parte da barriga celular Injeção de corante intracelular durante uma gravação de célula inteira. In vitro rotula uma única célula para guiar gravações direcionadas desse axônio. Da mesma forma, o transporte retrógrado após a injeção de corante extracelular fornece um meio de rotular seletivamente os neurônios de projeção em regiões superficiais do cérebro.

Isso pode ser usado para fornecer orientação visual para gravações in vivo de unidade única. Para preparar a agulha codificada D, primeiro eletrolítico, afie um fio de tungstênio de 160 micrômetros de diâmetro até o diâmetro final da ponta da agulha de cinco a 50 micrômetros. Então, na noite anterior ao experimento, codifique a ponta da agulha com uma solução de dois milimolares de 10.000 corantes de piso Alexa conjugados com dextrano de peso molecular para induzir a anestesia geral.

Coloque o peixe na água do tanque com solução MS 2: 22 a 300 miligramas por litro, imobilize e silencie eletricamente o peixe injetando 100 microlitros de mangual a três miligramas por mililitro na musculatura dorsal do corpo. Em seguida, encha a câmara de gravação com água do tanque e coloque o peixe com o lado ventral voltado para baixo na plataforma no centro da câmara. Em seguida, administre a solução aerada MS 2 22 a 100 miligramas por litro em um a dois mililitros por minuto, colocando uma ponta de pipeta em sua boca.

Em seguida, estabilize o peixe com varas fixas e cera em ambos os lados do corpo. Monitore o estado de saúde do peixe, verificando o fluxo sanguíneo contínuo nos vasos oculares e a cor normal do corpo. Em seguida, gire a plataforma ao longo do eixo vertical.

Ajuste uma extremidade da plataforma de modo que um lado da superfície dorsal da cabeça do peixe fique exposto acima da água enquanto o resto do corpo do peixe permaneça submerso. Coloque um pequeno pedaço de lenço umedecido em qualquer parte não submersa da pele para evitar o ressecamento. Neste procedimento, aplique 0,4% de lidocaína na superfície exposta da cabeça usando um cotonete.

Em seguida, use uma lâmina de bisturi para cortar um pedaço retangular de tecido da pele de aproximadamente três milímetros por cinco milímetros para um peixe de 6,2 centímetros. A borda lateral do retângulo deve estar alinhada com o centro do olho. A borda anterior do retângulo deve ser logo posterior ao olho e a borda medial do retângulo deve ser apenas lateral à linha média.

Em seguida, remova o retângulo usando uma pinça. Corte mais 2,5 milímetros quadrados anteriores para expor o crânio. Limpe completamente a superfície exposta do crânio raspando qualquer excesso de tecido usando a lâmina do bisturi.

Em seguida, seque completamente a superfície com um lenço Kim e ar forçado. Em seguida, cole um poste de metal na região anterior medial exposta do crânio com super cola. Espere até que a cola esteja completamente seca.

Use uma broca odontológica com uma ponta de carboneto de moinho de bolas de 0,5 milímetro de diâmetro para desenhar um retângulo de aproximadamente dois milímetros por quatro milímetros no crânio para um peixe de 6,2 centímetros. Depois disso, corte o perímetro do retângulo com o bisturi e a pinça. Em seguida, retire o crânio

Para expor o cérebro, corte a dura-máter pigmentada e a pia-máter transparente usando uma tesoura de mola ou uma agulha. Em seguida, remova as porções cortadas com um par de pinças para expor o núcleo extralateral anterior e o núcleo extralateral posterior. Agora posicione um manipulador com uma agulha revestida com D preparada anteriormente acima da região alvo que contém os axônios de interesse.

O núcleo extralateral posterior em nosso caso insere rapidamente a agulha aproximadamente 25 micrômetros no tecido. Depois que o corante se difundir por 15 a 30 segundos, retraia a agulha. Repita com agulhas novas adicionais, conforme necessário.

Coloque cada um em um local diferente para que o corante seja distribuído por toda a região alvo. Em seguida, enxágue o excesso de corante da cavidade com a solução de toque de Hickman e aguarde pelo menos duas horas para a absorção e transporte do corante. Para visualizar os axônios de interesse, coloque a câmara de gravação com o peixe sob a objetiva de um microscópio de epifluorescência de estágio fixo vertical.

Mude a solução de respiração para água fresca do tanque e mantenha a mesma vazão. Em seguida, coloque uma extremidade do fio terra na cavidade cerebral exposta e conecte a outra extremidade ao terra do cabeçote de gravaçãotage. Em seguida, coloque um par de eletrodos de gravação ao lado da base da cauda.

Em seguida, conecte os eletrodos a um amplificador diferencial e dispositivo de gravação. Para monitorar o comando de descarga de órgãos elétricos ou EODC, prepare um esboço em escala da região do cérebro vista em baixa ampliação, incluindo os principais vasos sanguíneos como pontos de referência para identificar a localização exata dos axônios marcados. Para confirmar o posicionamento D primeiro, visualize todo o tecido com iluminação de campo claro para orientação.

Em seguida, visualize-o com iluminação fluorescente. O núcleo extralateral posterior deve apresentar marcação difusa. Em seguida, sob alta ampliação, localize o núcleo extralateral anterior com os vasos como pontos de referência.

Ilumine-o com luz fluorescente enquanto procura um axônio marcado próximo à superfície, usando um diâmetro externo de um milímetro de diâmetro interno de 0,58 milímetro. Bo vidro capilar de silicato com filamento. Puxe um eletrodo de gravação com uma haste estreita de cinco milímetros de comprimento e um diâmetro de ponta de cerca de um a 2.4 micrômetros.

Encha o eletrodo com solução de campainha de Hickman filtrada. A resistência final da ponta deve estar na faixa de 16 a 155 mega ohms. Coloque o eletrodo em um suporte de eletrodo com uma porta de pressão.

Conecte-o ao cabeçote montado em um manipulador. Em seguida, conecte o estágio principal a um amplificador. Um dispositivo de aquisição analógico para digital não mostrado conecta o amplificador ao computador.

Depois disso, aplique pressão positiva de 30 milibar na linha do eletrodo. Avance o eletrodo lentamente em direção ao axônio a partir da superfície do tecido. Como o eletrodo está próximo ao axônio, a pressão positiva deve causar um movimento leve, mas perceptível, do axônio enquanto o eletrodo está próximo ao axônio.

Registre a atividade durante a apresentação dos estímulos de teste. Embora um artefato elétrico confirme o registro e a estimulação adequados, não deve haver potenciais de ação. Libere a pressão externa no eletrodo e repita a estimulação e o registro.

Em seguida, aplique uma leve sucção, fazendo com que o axônio se mova para dentro do eletrodo. Repita a estimulação e a gravação novamente. Agora você deve ver alguns potenciais de ação em resposta aos estímulos.

Quando os potenciais de ação estiverem visíveis, feche a linha de pressão. Quando todas as gravações desejadas estiverem concluídas, mude a água do tanque de volta para a solução de respiração com MS 2 22 a cem miligramas por litro para garantir que o peixe esteja completamente anestesiado. Nenhum EODC deve ser detectado por pelo menos 10 minutos antes da eutanásia do peixe.

Aqui estão cinco traços de amostra mostrando os potenciais de ação evocados por um estímulo de pulso quadrado transversal positivo contralateral contralateral monofásico de 0,1 milissegundo por centímetro, e aqui está um gráfico raster mostrando os tempos de pico durante 20 repetições de uma janela de gravação de 75 milissegundos para a mesma unidade estimulada em tempos zero com estímulos de seis milivolts por centímetro. O intervalo de durações está listado à direita. Aqui é mostrada uma curva de ajuste da duração do estímulo que quantifica as respostas como picos por repetição de estímulo.

Uma vez dominada, a cirurgia e a injeção de corante mostradas nesta técnica podem ser feitas em uma hora se forem realizadas corretamente, e as gravações podem ser iniciadas duas a três horas após a injeção de corante. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar cuidadosamente a saúde do animal experimental após este procedimento. Outros métodos, como imagens de dois fótons, podem ser realizados para registrar a partir de neurônios em estruturas cerebrais ainda mais profundas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular e registrar respostas de unidade única de uma população identificada de neurônios.