Name: Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados In vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprenda a gravar respostas de unidade única de neurônios identificados in vivo usando marcação fluorescente retrógrada. Esta técnica permite gravações extracelulares direcionadas em sistemas não genéticos, como peixes elétricos.

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Financiamento concedido pela Fundação Nacional de Ciência (IOS-1050701 para BAC), o National Institutes of Health (NS54174 a SM e F30DC0111907 a AML-W.), A Fundação Memorial Uehara e Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (G2205 para TK ). Agradecemos Julian Meeks por seu apoio e orientação sobre o tema das gravações axonal extracelulares. Agradecemos Carl Hopkins para fornecer uma câmara de gravação protótipo.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma vez dominado, esta técnica permitirá um para atingir os neurônios identificados, incluindo axônios individuais, no gravações vivo em muitos sistemas modelo. Além disso, esta técnica permite registar com segurança de saída de pico de neurónios com características únicas que o tornam anatómicas tradicional em métodos de gravação vivo desafiador. Nós utilizamos esta técnica para gravar a partir de ELA &quot;pequenas células&quot; em mormyrid peixe fracamente elétrico. As tentativas anteriores para estudar as propriedades de ajuste de &quot;pequenas células&quot; não tiveram sucesso devido às condições desafiadoras de gravação 11, 14. Características anatômicas semelhantes criar barreiras para a obtenção de gravações em uma única unidade de diversos vertebrados neurônios electrosensory 8-10 e auditivos. Para superar estes desafios em nosso sistema, aproveitamos o fato de que &quot;pequenas células&quot; são as únicas células em ELA que se projetam para ELP. Assim, o transporte retrógrado de corante colocado no ELP limita rotulagem em ELA a &quot;pequena&quot;somas e axônios de células. marcação fluorescente dos axônios permitiu a colocação do eletrodo precisa ao lado de axônios marcados, fazendo gravações em uma única unidade de células identificadas possíveis apesar somas inacessíveis. Tentamos gravações somáticas, mas não tiveram sucesso, provavelmente devido às sinapses envolvendo em torno de 11 , 17. No entanto, a rotulagem somática era claramente visível, sugerindo que esta técnica pode ser usada para alvejar gravações somáticos em outros tipos celulares e outros circuitos. rotulagem fluorescente de neurónios através de transporte retrógrado in vivo, foi utilizado para orientar gravações alvo in vitro 19-21 . Uma técnica semelhante foi utilizada para alvo de gravações de neurónios motores in vivo em peixes-zebra medula espinal 22. nosso trabalho representa uma nova abordagem de expansão deste, em que ambos de rotulagem e gravação são feitas in vivo dentro do cérebro. nosso método demonstra que, in vivo rotulagem das áreas do sistema nervoso central com um retrógrado tpiloto pode ser expandido para o estudo de outros circuitos intactas com neurónios de projecção semelhante selectivos. Por exemplo, no tratamento de mamíferos auditivo, no colículo inferior (CI), que serve como um centro de retransmissão importante para as entradas de várias estruturas rhombencephalic 23. Injecção de corante para o IC seria etiquetar selectivamente as células de projecção a partir de cada um destes núcleos. O colículo superior (SC) tem uma função semelhante para a visão 24. Preparações da medula espinal são particularmente adequados para esta técnica, tal como a medula espinal é facilmente acessível, a injecção de corante pode ocorrer longe do local de gravação, e pode ser combinado com a gravação intracelular e enchimento de neurónios seleccionados para adquirir a informação anatómica mais detalhada 25. Finalmente, o tracto-tracing é uma técnica bem estabelecida utilizada em todo o sistema nervoso central para mapear complexo circuito 26. O método pode ser utilizado para adicionar a informação funcional para estes estudos, como tem sido feito windicadores de cálcio sensíveis om em cat córtex visual 27. A cirurgia, o que está bem estabelecido, fiável e, regularmente usado para cego in vivo gravações 16, deve ser preenchida com hemorragia mínima e sem danificar a superfície do cérebro para permitir que o animal e o tecido para sobreviver. Com a prática, a aplicação da cirurgia e corante pode ser completado em 30-45 minutos. Nós rotulado com sucesso &quot;pequenas células&quot; axônios em 67% dos preparativos. A maioria das preparações têm apenas 1 ou 2 axônios marcados visíveis, mas alguns têm até 8. Dos 119 unidades marcadas tentaram, obtivemos gravações-unitárias de 26 unidades distribuídas ao longo de 12 preparações (Tabela 2). Assim, os dados foram coletados a partir de 41% de preparações com axônios marcados para uma taxa global de sucesso de 28%. O aspecto crítico da aplicação corante é etiquetar profundidade. A falta de inserção do fio de tungsténio vai resultar em que o corante de ser lavado away. No entanto, se a penetração for muito profunda, axónios marcados não será visível para o direcionamento. Além disso, alguns danos mecânicos na célula deve ocorrer para que o corante deve ser adequadamente feita até 25, 28. No entanto, muito dano vai matar as células. Tentamos marcação com outros corantes e outros métodos (Tabela 2), incluindo a rotulagem anterógrada através de injeção de corante em ELA emparelhado com gravação de axônios marcados em ELP (Tabela 3). Nossa hipótese é que a rotulagem anterógrada não foi bem sucedida porque a rotulagem foi limitada a células com danos somática, tornando-se indiferente. Além disso, os terminais pré-sinápticas podem ter sido perturbada. Em contraste, marcação retrógrada minimiza tanto destas preocupações. A quantidade e localização de aplicação de corante pode ser alterado de acordo com o circuito particular a ser estudado. Rotulagem máxima ocorre com a maior concentração de corante, o que foi conseguido usando fios de tungsténio revestidas. No entanto, para a rotulagem de axônios comprojeções ep, corante pode sair de uma agulha de tungstênio como é avançado. Nestes casos, a injecção de pressão seria mais apropriada. Absorção e transporte Dye são rápidos, com axônios marcados em nossa preparação, sendo visível logo em 2 horas após a injeção e axônios marcados adicionais que aparecem tão tarde quanto 6 horas após a injeção. Assim, a marcação e gravação pode ser realizada num único dia, eliminando dificuldades técnicas associadas com a cirurgia de sobrevivência. Sincronismo irá variar para cada aplicação, dependendo da distância necessária para o transporte de corante. Outro aspecto importante é a colocação do eletrodo. É importante para entrar no tecido próximo do sítio do axónio rotulado para evitar o entupimento da ponta. Para o tecido denso, tal como na ELA, uma longa haste fina no eléctrodo de registo minimiza o excesso de movimento do tecido circundante. Se uma gravação de sucesso não é alcançado na primeira tentativa, repita com eletrodos frescas até uma gravação é obtida ou a TISSue é interrompida para o ponto no qual o axónio já não é visível. No entanto, é também importante para colocar rapidamente o eléctrodo próximo ao axónio para minimizar a quantidade de exposição fluorescente, o que pode causar a fototoxicidade, branqueamento e pode afectar as propriedades fisiológicas da célula 29-31. Uma vez que um segmento do axónio é aspirada com êxito no eléctrodo de registo, as gravações podem ser obtidos por várias horas. Se as unidades são constantemente perdidos em menos de 1 hora, considere fazer pontas de eléctrodos mais pequenos para impedir o axónio de deslizar para fora. Por outro lado, muito pequena de um ponta pode resultar em entupimento, baixo sinal-ruído, ou danos no axónio. Uma diminuição constante no pico de amplitude e o &quot;retorno&quot; de uma unidade de sucção é uma indicação adicional de que a ponta é demasiado grande. Muito sucção pode causar danos irreparáveis ​​para o axônio. Uma solução é permitir que uma pequena fuga na linha de ar de modo a pressão lentamente retorna a zero. Rapidamente equalizar ªe pressão irá resultar em uma relação transitória-fora &#39;push&#39; que pode expulsar o axônio. Embora esta técnica representa uma grande vantagem para a obtenção de gravações específicas identificadas a partir de neurónios de projecção, que não será útil para distinguir interneurónios locais, como corante seria ocupada por todos os tipos de células no local da injecção. Teoricamente, a utilização de fluoróforos com múltiplos locais de injecção pode permitir que este método seja expandida. Por exemplo, a comparação de um único versus dupla marcação pode ser usado para distinguir interneurónios de neurónios de projecção dupla seguintes injecções em dois pontos no circuito 32. Da mesma forma, traçadores retrógrados pode ser combinada com outras técnicas de imagem avançadas, como a imagem de dois fótons, como foi feito recentemente em tentilhão alta centro Vocal (HVC) 32. Além disso, as regiões de gravação são limitados aqueles que perto da superfície quando se utiliza microscópios de epifluorescência, já que só foram capazes de resolver uma emu; estruturas m nos primeiros 30 mm de tecido. No entanto, esta profundidade poderia ser estendido através da utilização de outras técnicas de microscopia, tais como a microscopia de dois fotões 33 ou objectivo acoplado a microscopia de iluminação plana 34. No geral, esta técnica representa um avanço importante no estudo dos circuitos neuronais in vivo, porque pode ser utilizado para gravar a partir de neurónios individuais, em muitos circuitos diferentes em uma variedade de sistemas de modelos - incluindo aqueles que são relativamente inacessíveis.

<table><tbody><tr><td>Mesilato de Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Trietiodeto de Galamina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Cloridrato de Lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de Ringer de Hickman&amp;rsquo;s </td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (0,29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0,084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,06 g/l)</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Gilson ou Rainin</td><td>Modelo Minipulse 3 312; RP-1</td><td>10,0 &amp;plusmn; 1,0 rpm; alternativamente, uma linha com alimentação por gravidade e medidor de fluxo</td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecação </td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Super Cola</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>Tubo de 2 g</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Broca de Carboneto para Moinho de Bolas #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0,19 DIA (diâmetro da broca = 0,48 mm)</td></tr><tr><td>Kit de Cauterização de Baixa Temperatura</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulador Manual</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dextrana Conjugada com Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>Concentração de 2 mM; peso molecular de 10.000. A escolha do comprimento de onda do corante deve ser feita para corresponder às configurações do filtro do microscópio</td></tr><tr><td>Microscópio Epifluorescente</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Um acessório de foco remoto é útil para ajuste fino; filtro TRITC — ou filtro apropriado para alinhar os planos focais para diferentes comprimentos de onda de corante</td></tr><tr><td>Objetiva de Baixa Potência</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>Série CFI Plan Achromat, 4X N.A. 0,1, D.T. 30 mm</td></tr><tr><td>Objetiva de Alta Potência</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>Série CFI Fluor, 40X WI N.A. 0,8, D.T. 2,0 mm</td></tr><tr><td>Fonte de Luz Branca</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Modelo 190</td><td>Iluminador de Fibra Óptica</td></tr><tr><td>Fonte de Luz Fluorescente </td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera de Baixo Nível de Luz</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manômetro Digital</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulador Motorizado</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Estágio de Cabeçote</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Sistema de Aquisição de Dados</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Estimulador de Pulso Isolado</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Puxador de Micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Configurações de programa para a nossa aplicação: Calor: rampa + 1, Tração: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocidade: 60, Tempo: 90; filamento tipo caixa</td></tr><tr><td>Vidro para Pipeta</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Vidro capilar de borossilicato com filamento (1 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de diâmetro interno)</td></tr></tbody></table>

labeling fluorescentes retrógrada permite alvejado extracelular gravação single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; in vivo</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

O objetivo geral deste método é o de registrar as respostas única unidade de uma população identificada de neurônios. Nos registros eletrofisiológicos in vivo dos neurônios individuais são fundamentais para a compreensão de como os circuitos neurais funcionam em condições naturais. Tradicionalmente, estes registos foram efectuados &quot;cego&quot;, o que significa a identidade da célula registada é desconhecido no início da gravação. Identidade celular pode ser posteriormente determinada via intracelular 1, juxtacellular 2 ou solta-patch 3 iontoforese de corante, mas estas gravações não podem ser pré-alvejado a neurônios específicos em regiões com tipos de células funcionalmente heterogêneos. As proteínas fluorescentes podem ser expressas de uma forma específica do tipo de célula permitindo visualmente guiada electrofisiologia unicelular 4-6. No entanto, existem muitos sistemas modelo para o qual estas ferramentas genéticas não estão disponíveis. Mesmo em sistemas modelo geneticamente acessíveis, o desejado promoter pode ser desconhecido ou neurônios geneticamente homogêneos pode ter diferentes padrões de projeção. Do mesmo modo, os vectores virais têm sido utilizados para etiquetar subgrupos específicos de neurónios de projecção 7, mas a utilização deste método é limitada pela toxicidade e falta de especificidade trans-sináptica. Assim, são necessárias técnicas adicionais que oferecem pré-visualização específico para gravar a partir de neurônios individuais identificados in vivo. Pré-visualização do neurônio alvo é particularmente útil para condições de gravação difíceis, para que as gravações de uma única célula clássicos muitas vezes são proibitivamente difícil 8-11. A nova técnica descrita neste artigo usa transporte retrógrado de um corante fluorescente aplicada com o uso de agulhas de tungstênio para rotular rapidamente e seletivamente um subconjunto específico de células dentro de uma determinada região do cérebro com base em suas projeções axonais únicos, proporcionando assim uma indicação visual para obter registros eletrofisiológicos alvo de neurônios identificados em um circuito intacto withind vertebrado SNC. O novo avanço mais significativo do nosso método é a utilização de rotulagem fluorescente para atingir tipos celulares específicos num sistema modelo acessíveis não geneticamente. Peixe fracamente elétrico é um sistema excelente modelo para o estudo de circuitos neurais no acordado, comportando 12 animais. Nós utilizamos esta técnica para estudar o processamento sensorial por &quot;pequenas células&quot; no núcleo exterolateral anterior (ELA) de peixes mormyrid fracamente elétrico. &quot;Pequenas células&quot; são supor para ser tempo de comparação neurônios importantes para a detecção de diferenças submillisecond nos tempos de chegada dos picos pré-sinápticos 13. No entanto, as características anatômicas, como mielina denso, engolindo as sinapses, e os corpos de pequenas células tornaram extremamente difícil para gravar a partir destas células através de métodos tradicionais 11, 14. Aqui demonstramos que o nosso novo método seletivamente rotula essas células em 28% das preparações, permitindo confiáveis, robustos e gravações caracteríszação das respostas à estimulação electrosensory.

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo visualmente<em&gt; In vivo</em&gt;, Permitindo a gravação extracelular de axónios identificados. Esta técnica permite a gravação quando os neurónios não podem ser marcados através de manipulação genética ou são difíceis de isolar usando &quot;cega&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Abordagens.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

O objetivo geral deste método é registrar respostas de unidades únicas de uma população identificada de neurônios. Registros eletrofisiológicos in vivo de...

O objetivo geral deste procedimento é registrar as respostas de unidades individuais in vivo a partir de uma população identificada de neurônios em um sistema modelo não genético. Isso é realizado primeiramente realizando uma craniotomia para expor a região cerebral de interesse. O segundo passo é usar fios de tungstênio para depositar o corante fluorescente na região para a qual os neurônios-alvo projetam.Em seguida, o corante é transportado de forma retrógrada, resultando na marcação seletiva dos neurônios de projeção. O passo final consiste em realizar a gravação a partir do axônio marcado do neurônio de projeção individual. Em última análise, gravações extracelulares de unidade única são utilizadas para demonstrar como os neurônios sensoriais centrais em um circuito intacto respondem à estimulação sensorial em evo.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como os circuitos neurais detectam diferenças de submilissegundo no tempo de chegada das entradas sinápticas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é a capacidade de direcionar neurônios individuais ou até mesmo axônios e sistemas não acessíveis geneticamente. Peixes elétricos semanais utilizam sinais elétricos para comunicação e navegação.Eles distinguem sinais de diferentes peixes utilizando diferenças de submilissegundo no tempo de chegada das entradas sinápticas. Investigamos como os neurônios comparadores de tempo presumidos em seu circuito sensorial eletrossensorial são capazes de detectar tais pequenas diferenças temporais. No entanto, esta técnica também pode ser aplicada a outros sistemas, como vias sensoriais visuais e auditivas.É particularmente difícil obter líquido dessas células devido ao pequeno tamanho, ao denso emaranhado no tecido circundante e aos terminais pré-sinápticos que cobrem a maior parte do corpo celular. A injeção intracelular de corante durante um registro em célula inteira. In vitro rotula uma única célula para orientar registros direcionados a partir do axônio. De forma semelhante, o transporte retrógrado após injeção extracelular de corante fornece um meio de rotular seletivamente os neurônios projetores em regiões superficiais do cérebro.Isso pode ser usado para fornecer orientação visual para gravações de unidade única in vivo. Para preparar a agulha codificada com D, primeiro afie eletroliticamente um fio de tungstênio com diâmetro de 160 micrômetros até o diâmetro final da ponta da agulha de cinco a 50 micrômetros. Em seguida, na noite anterior ao experimento, marque a ponta da agulha com uma solução de dois milimolares de corante Alexa floor conjugado à dextrana de peso molecular 10.000 para induzir anestesia geral.Coloque o peixe na água do aquário com solução MS 222 a 300 miligramas por litro para imobilizar e silenciar eletricamente o peixe, injetando 100 microlitros de flail a três miligramas por mililitro na musculatura dorsal do corpo. Em seguida, preencha a câmara de registro com água do aquário e posicione o peixe com o lado ventral voltado para baixo sobre a plataforma no centro da câmara. Então, administre a solução MS 222 arejada a 100 miligramas por litro em uma a duas mililitros por minuto, colocando a ponta de uma pipeta na sua boca.Posteriormente, estabilize o peixe com hastes fixas e cera em ambos os lados do corpo. Monitore a condição de saúde do peixe verificando o fluxo sanguíneo contínuo nos vasos oculares e a coloração normal do corpo. Em seguida, gire a plataforma ao longo do eixo vertical.Ajuste uma extremidade da plataforma de modo que um lado da superfície dorsal da cabeça do peixe fique exposto acima da água, enquanto o restante do corpo do peixe permanece submerso. Coloque um pequeno pedaço de lenço de papel Kim em qualquer parte da pele não submersa para evitar ressecamento. Neste procedimento, aplique lidocaína a 0,4% na superfície exposta da cabeça usando um cotonete.Em seguida, use uma lâmina de bisturi para cortar um pedaço retangular de tecido cutâneo de aproximadamente três milímetros por cinco milímetros para um peixe de 6,2 centímetros. A borda lateral do retângulo deve alinhar-se com o centro do olho. A borda anterior do retângulo deve ficar logo posterior ao olho, e a borda medial do retângulo deve ficar logo lateral à linha média.Posteriormente, remova o retângulo usando um par de pinças. Corte um quadrado adicional de 2,5 milímetros na região anterior para expor o crânio. Limpe completamente a superfície exposta do crânio raspando qualquer tecido em excesso com a lâmina do bisturi.Em seguida, seque completamente a superfície com um lenço Kim e ar forçado. Depois, cole um pino metálico à região exposta do crânio medial anterior com cola instantânea. Aguarde até que a cola esteja completamente seca.Use uma broca dentária com ponteira de carbeto em formato de bola com diâmetro de 0,5 milímetro para desenhar um retângulo de aproximadamente dois milímetros por quatro milímetros sobre o crânio de um peixe de 6,2 centímetros. Em seguida, corte o perímetro do retângulo com o bisturi e a pinça. Depois, remova o crânio.Para expor o cérebro, corte a dura-máter pigmentada e a pia-máter transparente utilizando uma tesoura de mola ou uma agulha. Em seguida, remova as partes cortadas com uma pinça para expor o núcleo extra lateral anterior e o núcleo extra lateral posterior. Posicione agora um manipulador com uma agulha revestida com D, preparada anteriormente, acima da região-alvo contendo os axônios de interesse.O núcleo extra lateral posterior, em nosso caso, insere rapidamente a agulha aproximadamente 25 micrômetros no tecido. Após a difusão do corante por 15 a 30 segundos, retire a agulha. Repita o procedimento com agulhas novas adicionais conforme necessário.Coloque cada um em um local diferente para que o corante seja distribuído por toda a região-alvo. Em seguida, lave o corante em excesso da cavidade com solução de Ringer de Hickman e aguarde pelo menos duas horas para a captação e transporte do corante. Para visualizar os axônios de interesse, posicione a câmara de registro com o peixe sob a objetiva de um microscópio de fluorescência epiluminiscente com platina fixa e posição vertical.Substitua a solução de respiração por água fresca do tanque e mantenha a mesma taxa de fluxo. Em seguida, coloque uma extremidade do fio terra na cavidade cerebral exposta e conecte a outra extremidade ao terra do estágio de registro. A seguir, posicione um par de eletrodos de registro próximo à base da cauda.Em seguida, conecte os eletrodos a um amplificador diferencial e a um dispositivo de gravação. Para monitorar o comando de descarga do órgão elétrico ou EODC, prepare um esboço em escala da região do cérebro visualizada em baixa ampliação, incluindo os principais vasos sanguíneos como pontos de referência para identificar a localização exata dos axônios marcados. Para confirmar primeiro a colocação de D, visualize todo o tecido com iluminação de campo claro para orientação.Em seguida, visualize-o com iluminação fluorescente. O núcleo extra lateral posterior deve apresentar marcação difusa. Depois disso, sob alta ampliação, localize o núcleo extra lateral anterior utilizando os vasos como pontos de referência.Illumine-o com luz fluorescente enquanto procura um axônio marcado próximo à superfície, utilizando um capilar de vidro de borossilicato com filamento, com diâmetro externo de um milímetro e diâmetro interno de 0,58 milímetro. Puxe um eletrodo de registro com um haste estreita de cinco milímetros de comprimento e diâmetro da ponta entre um e 2,4 micrômetros.Encha o eletrodo com solução de Ringer filtrada de Hickman. A resistência final da ponta deve estar na faixa de 16 a 155 megaohms. Coloque o eletrodo em um suporte de eletrodo com uma porta de pressão.Conecte-o ao estágio da cabeça montado em um micromanipulador. Em seguida, conecte o estágio da cabeça a um amplificador. Um dispositivo de aquisição analógico-digital não mostrado conecta o amplificador ao computador.Em seguida, aplique uma pressão positiva de 30 milibares à linha do eletrodo. Avance lentamente o eletrodo em direção ao axônio a partir da superfície do tecido. Quando o eletrodo estiver próximo ao axônio, a pressão positiva deve causar um movimento ligeiro, mas perceptível, do axônio enquanto o eletrodo estiver ao lado dele.Registre a atividade durante a apresentação dos estímulos de teste. Embora um artefato elétrico confirme a gravação e estimulação adequadas, não deverá haver potenciais de ação. Libere a pressão para fora no eletrodo e repita a estimulação e o registro.Em seguida, aplique uma leve sucção, fazendo com que o axônio se mova para dentro do eletrodo. Repita a estimulação e a gravação novamente. Agora você deverá observar alguns potenciais de ação em resposta às estimulações.Uma vez que os potenciais de ação sejam visíveis, feche a linha de pressão. Quando todas as gravações desejadas estiverem concluídas, troque a água do tanque novamente pela solução de ressurgência com MS 222 a cem miligramas por litro para garantir que o peixe esteja completamente anestesiado. Nenhum EODC deve ser detectado por pelo menos 10 minutos antes de eutanasiar o peixe.Aqui estão cinco traços de exemplo mostrando os potenciais de ação evocados por um estímulo quadrado transversal monofásico contralateral positivo de 0,1 milissegundo e seis milivolts por centímetro, e aqui está um gráfico em raster mostrando os tempos de pico durante 20 repetições de uma janela de gravação de 75 milissegundos para a mesma unidade estimulada nos tempos zero com estímulos de seis milivolts por centímetro. A faixa de durações está listada à direita. É mostrada aqui uma curva de sintonia de duração do estímulo que quantifica as respostas em picos por repetição do estímulo.Uma vez dominada, a cirurgia e a injeção do corante mostradas nesta técnica podem ser realizadas em uma hora, se executadas corretamente, e os registros podem ser iniciados duas a três horas após a injeção do corante. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar cuidadosamente a saúde do animal experimental após o procedimento. Outros métodos, como a imagem de dois fótons, podem ser realizados para registrar atividade de neurônios em estruturas cerebrais ainda mais profundas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular e registrar respostas de unidade única de uma população identificada de neurônios.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

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