Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar rapidamente a presença de bactérias específicas, como e coli, usando novos genes de gripe, DNA, sondas Zyme Primeiro, DNA gênico completo. As sondas Zyme são geradas por ligação. As bactérias são então cultivadas para enriquecer o número de moléculas-alvo e a mistura extracelular acumulada é preparada a partir do sobrenadante.

A mistura extracelular bruta é então combinada com a interação da sonda DNA zyme entre a sonda DNA Zyme e as moléculas-alvo resulta na clivagem da sonda, que então fluoresce está usando. Uma interação de fluorímetro entre a sonda e o alvo é vista como um aumento na fluorescência relativa. Os resultados são então verificados usando análise de eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos baseados em PCR ou anticorpos é que o procedimento é mais simples e fácil de executar. Embora este método tenha sido desenvolvido com a bactéria modelo e coli, ele pode ser aplicado à detecção de quaisquer outros patógenos bacterianos transmitidos por alimentos ou nosocomiais. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque podem não estar acostumados ao manuseio de sondas de DNA sintético e bactérias Demonstrando o procedimento está Sergio Aguire, assistente de pesquisa do meu laboratório e Monso Ali, pós-doutorando para este protocolo.

R-F-D-E-C um é o DNA Zyme em destaque. Consiste na sequência catalítica EC sublinhada em preto e na sequência de substrato FS sublinhada em verde contida no substrato é uma ligação de RNA indicada pelo r azul flanqueado por um DT marcado com Fluor indicado pelo F e um QUENCHER rotulado DT indicado pela fila RF SS é uma versão embaralhada de RFD EEC one onde a sequência catalítica EEC é parcialmente embaralhada em SS one, mas a parte FS uma permanece inalterada. O RF DEC um e o RF SS um são feitos por ligação enzimática mediada por molde do oligonucleotídeo FS um com o oligonucleotídeo EC um ou SS um na presença de LT um como molde de ligação para preparar misturas extracelulares brutas ou cems que serão usados como alvo para R-F-D-E-C um comece dispensando dois mililitros de LB em tubos de cultura estéreis de 14 mililitros usando uma pistola de pipeta.

Em seguida, usando uma ponta de pipeta estéril, pegue uma única colônia de E. coli de uma placa helicoidal e coloque-a em um tubo de cultura contendo lb. Coloque os tubos em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e agite a 250 RPM por 14 horas após a incubação. Para gerar uma cultura de inoculação de 1%re, dispense dois mililitros de LB fresco em tubos de cultura de 14 mililitros e adicione 20 microlitros da cultura bacteriana da etapa anterior.

Incubar os tubos a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM até que cada solução bacteriana atinja um OD 600 de aproximadamente uma transferência. Um mililitro de cada cultura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e peletizar as células por centrifugação a 11.000 G por cinco minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante transparente para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Armazenar o sobrenadante a 20 graus Celsius negativos. Se não for imediatamente utilizado para determinar se o sinal fluorescente é gerado com a interação das enzimas do ADN com o extracto bruto de células, as amostras são analisadas por espectrometria fotométrica. Ligue o espectrofotômetro fluorescente e configure os parâmetros de aquisição de dados com excitação em 488 nanômetros e emissão em 520 nanômetros.

Configure também o instrumento para fazer leituras a cada minuto durante uma hora. Lave três cubetas de cristal de quartzo primeiro com água destilada deionizada e depois com 100% de etanol. Seque as cubetas piscando gás nitrogênio.

Rotule as cubetas como C, um para controle um, C dois para controle dois e T para teste, em seguida, transfira 24 microlitros de água destilada deionizada para C um e 24 microlitros da mistura extracelular bruta de e coli preparada para C dois e T. Adicione 25 microlitros de dois X RB a cada veterinário Q e coloque-os no espectrofotômetro fluorescente. Comece a coletar dados de fluorescência após cinco minutos, adicione um microlitro de cinco micromolares RFS S um a C dois e um microlitro de cinco micromolares, RFD eec um a T e C um garantindo que as leituras de fluorescência não sejam interrompidas. Misturar cada solução pipetando e, em seguida, deixar a reacção continuar durante o resto do período de aquisição.

Salve os dados no formato de arquivo Excel. Em seguida, transfira os dados para um computador pessoal e use o Excel para criar uma imagem gráfica. As mesmas misturas de reação que foram usadas para análise pelo Spectra.

A fotometria pode ser usada para análise por eletroforese em gel. Após uma hora de aquisição. Remova as cubetas do espectrofotômetro e transfira as soluções para novos tubos de microcentrífuga.

Extinguir as reações adicionando cinco microlitros de acetato de sódio de três molares e 125 microlitros de etanol a 100%. Misturar cada solução por vórtice e colocar os tubos num congelador de 20 graus Celsius negativos durante uma hora após a centrífuga de incubação. A reação se mistura a 11.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius e remove cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.

Seque os pellets usando um concentrador de DNA por 10 minutos. Adicione 20 microlitros de tampão de carregamento de gel e faça um vórtice brevemente. Gire brevemente com uma centrífuga de bancada.

Em seguida, carregue 10 microlitros das amostras de reação por poço de gel 10% Dage após a execução. Remova as placas de vidro e lave bem com água da torneira. Para remover quaisquer pedaços de gel, limpe as placas com um lenço Kim.

Digitalize a placa de gel para verificar se há fluorescência usando um scanner de tufão. Analise as imagens resultantes usando o software image quant para avaliar a sensibilidade do sistema. Culturas diluídas em série são cultivadas por períodos de tempo crescentes.

Para determinar o período mínimo de incubação necessário para detectar uma única bactéria, prepare 10 tubos de cultura contendo dois mililitros de lb, inocule cada cultura com 100 microlitros de duas UFC por mililitro de um estoque de glicerol de e coli e incube a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM em 4, 8, 12, 16 e 24 horas. Colha 300 microlitros de cada um dos tubos de cultura inoculados, pois pode não haver bactérias detectáveis para amostras colhidas no momento. Pontos 4 8 12.

Deixe a cultura restante crescer por 24 horas para identificar culturas contendo bactérias. Medir o OD 600 e precipitar as células por centrifugação a 11 000 g durante cinco minutos. Transfira o sobrenadante que contém o CEMS para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro frescos e armazene a 20 graus Celsius negativos até o uso no dia seguinte.

Inspecione as culturas quanto ao crescimento. Apenas uma ou duas das 10 culturas podem conter e coli após a inoculação e os tubos restantes não conterão células. Use o CEMS recuperado de culturas positivas nos pontos de tempo designados Para preparar reações de clivagem com RFD EEC one, analise as misturas de reação usando eletroforese em gel DAGE conforme descrito anteriormente, as sondas RFD EEC one e RF SS one foram preparadas por ligação enzimática das porções do DNA ao substrato.

A interação FS um de CEM EEC e RFD EEC one ou RF SS um foi então avaliada por espectrometria. Como pode ser visto aqui. R-F-D-E-C produziu-se um alto nível de sinal fluorescente após a adição de CEM ec.

Em contraste, a R FS S one não produziu um sinal fluorescente forte. Assim, a função de produção de fluorescência de RFD EEC um. Ao entrar em contato com o CEM, o EC é sequenciado.

Específico para verificar se os aumentos de fluorescência observados foram devidos à clivagem da ligação do RNA. As misturas de reação foram analisadas por clivagem de RFD eec, espera-se que um por hidróxido de sódio molar 0,25 gere fragmentos de NA 2D, um fragmento de cinco primos retendo o Fluor e um fragmento de três primos retendo o sumidor. Como pode ser visto aqui.

A mistura de reação RFD CEE CEM CEE de fato produziu o produto de clivagem esperado. Além disso, apenas UNC clivado R-F-D-E-C um e o fragmento de cinco primos pôde ser detectado por imagem de fluorescência. Para examinar a especificidade do RFD EEC, foram realizados ensaios de fluorescência usando CEMS coletados apenas de várias outras bactérias gram-negativas e gram-positivas.

A amostra contendo CEM EC produziu um aumento na fluorescência. A falta de reatividade cruzada com CEMS das outras bactérias indica que RFDEC é altamente seletivo para e coli para determinar o tempo mínimo de cultura necessário para detectar uma única célula de e coli e coli diluída em uma UFC por mililitro em 100 microlitros cultivados com meio de crescimento por 4, 8, 12, 16 e 24 horas. O CEMS resultante misturado com R-F-D-E-C um e clivagem foi avaliado por dage como mostrado aqui.

Uma imagem do ensaio Dage indica que o R-F-D-E-C não produziu o produto de clivagem esperado. Quando reagiu com CEM. ECS coletado em quatro e oito horas de crescimento, indicando que o tempo de cultivo de 12 horas é necessário Uma vez dominado.

O principal componente desta técnica é que o ensaio baseado na enzima DA pode ser feito em 60 minutos se for realizado corretamente após este desenvolvimento. O procedimento abriu caminho para os pesquisadores no campo da análise biológica explorarem enzimas alogênicas de DNA para a detecção de uma ampla gama de patógenos bacterianos.