Name: Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a fabricar misturadores microfluídicos para estudar o dobramento de proteínas com mistura em aproximadamente 8 microssegundos. Esta técnica utiliza detecção por espectroscopia de fluorescência e FRET.

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Este trabalho é apoiado pela National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) e IDBR (NSF DBI-0754570). Este trabalho foi parcialmente financiado por fundos da National Science Foundation Grant FIBR 0623664 administrado pelo Centro de Biophotonics, uma Ciência NSF e Centro de Tecnologia, gerido pela Universidade da Califórnia, em Davis, nos termos do Acordo de Cooperação PHY 0120999. A pesquisa de Lisa Lapidus, Ph.D. é apoiado em parte por um Prémio Carreira na Interface Científica do Fundo de Bem-vindo Burroughs.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

A mistura rápida tem sido uma meta de desenvolvimento para o campo de enovelamento de proteínas por muitos anos porque ele tem sido reconhecido que os processos moleculares de biomoléculas ocorrem em escalas de tempo que variam de picosegundos de segundos. Convencionais stopped-flow misturadores têm tempos mortos de 1-5 ms, que é limitada principalmente pela turbulência. Turbulentos misturadores de fluxo contínuo com tempos de mistura de 30-300 mS têm sido desenvolvidos nos últimos 15 anos por um pequeno número de grupos, mas geralmente exigem altas taxas de fluxo para atingir estes tempos de mistura e, portanto, usar um monte de amostra 6-8. Este protocolo descreve o uso de microfluídicos fichas de mistura para alcançar uma rápida diluição no regime de fluxo laminar. Existem múltiplas vantagens para trabalhar dentro deste regime, mas um um primário é a capacidade para simular todo o processo de mistura com elevada precisão, que permite uma para modificar a resposta de mistura. T-misturadores desenvolvidos por outros grupos com geom simplesetries demonstraram tempos de mistura de 100-200 mS que foram principalmente limitada pelo tamanho da canais 9-10. Por dimensionar o tamanho dos canais a 10 uM Cavaleiro reduziu o tempo de mistura a ~ 10 microsiemens 11. Yao e Bakajin mostraram que pequenas mudanças na geometria poderia levar a melhorias significativas no tempo de mistura 4. No entanto, que o trabalho mostrou que a aceleração da mistura pode também conduzir a fases mais lentas também. O desenho utilizado neste trabalho 12-13 é um compromisso entre os dois melhores modelos em referência 4 para minimizar o mais lento de decaimento exponencial na concentração de desnaturante e também para fazer a característica mais reprodutível em condicionamento DRIE. Tem havido alguma controvérsia no campo de ultra-rápida misturados durante a definição do tempo de mistura. É importante reconhecer a diferença entre &quot;tempo de mistura&quot; e &quot;tempo morto&quot;. O tempo morto é definido num misturador turbulento como o tempo durante o qual uma MEDIÇÃOt não pode ser feita, e pode de facto ser significativamente mais longo do que o tempo real de mistura. É tipicamente determinada por fazer várias medições de uma reacção bimolecular pseudo-primeira ordem (tais como supressão da fluorescência de triptofano por N bromosuccinate) a várias concentrações. Os decai observados exponenciais estão equipados para convergir em um único valor assumido como sendo t = 0 S e que o tempo entre o ponto eo primeiro ponto medido é o tempo morto. Para misturadores de fluxo laminar, as medições podem ser feitas durante o processo de mistura para que não haja tempo morto, apenas um tempo de mistura. O tempo de mistura é simplesmente o tempo de combinar duas soluções até uniformidade suficiente é atingido. Nós previamente definido o tempo de mistura para ser um tempo 90/10, o tempo para a concentração de desnaturante para diminuir de 90% a 10% do valor não misturado. No entanto, a forma da curva de mistura não é perfeitamente simétrica com a cauda do decaimento tendo um pequeno componente exponencial. Além disso, dobrar a proteína tem umaltamente dependência não-linear da concentração de desnaturante de modo que a dobragem pode, muitas vezes mesmo se iniciar o desnaturante só é reduzido por duas vezes. Portanto, temos, mais recentemente, o tempo de mistura definido como o tempo para reduzir a concentração de desnaturante de 80%. Certamente outras definições podem ser usados, dependendo dos requisitos da experiência. A utilização deste misturador para estudar enrolamento de proteínas tem consistentemente revelou resultados surpreendentes. Folding de citocromo c e apomyoglobin têm sido estudadas para ter várias etapas de dobramento e os resultados iniciais com misturadores de fluxo contínuo mostrou queda para ocorrer no ~ 100 mS prazo 10,14-15. Os nossos medições com este misturador mostrou que haja pelo menos 2 passos nesta escala de tempo, uma muito rápida, provavelmente não específica colapso, (como medido por Trp mudança de fluorescência espectral) dentro do tempo de mistura do misturador seguido por uma fase mais lenta (como medido pela têmpera do total de emissão Trp), que é provável que o first formação da estrutura nativa 5. Observamos, também, um processo de 50 mS no domínio da proteína L B1, derrubando a interpretação convencional que essa proteína é uma pasta 2-estado 13. Uma vantagem deste misturador rápido é que ele pode sondar a dobragem dos mais rápidos proteínas de dobragem que geralmente têm sido apenas mensurável por nanossegundos T salto-instrumentos. T-salto tipicamente requer a observação de dobragem / desdobramento relaxamento perto da temperatura de fusão da proteína e, portanto, nunca se segue a dobra de toda a população. Com esta mesa vimos a dobra de γ-repressor (λ 6-86) com ambos emissão total Trp e mudança espectral e encontraram evidências de que a proteína tem nenhuma barreira para dobrar sob fortes condições dobráveis ​​que não eram acessíveis a T anteriores -pular medições 12. Finalmente, medimos o dobramento da headpiece vilina HP-35, um dos tele mais rápidos pastas ainda medidos e verificou que a taxa de dobragem medido após a mistura é de ~ 5 vezes mais lento do que medido por T-jump sob as mesmas condições de 16. Isto sugere que a cinética de dobragem depende das condições de partida, a capotagem um pressuposto importante no campo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> AZ P4110 Photoresist </td><td> Materiais AZ eletrônicos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 Desenvolvedor K </td><td> Materiais AZ eletrônicos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 Stripper fotorresiste </td><td> Performance Materials Avantor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Technologies </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 wafer de cobertura mM </td><td> SENSOR Prep Serviços </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,5 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados </td></tr><tr><td> 170 wafer de cobertura mM </td><td> SENSOR Prep Serviços </td><td> 7980 Wafers 2G </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espessura: 0,17 mm ± 0,025 milímetros Tolerâncias padrão (exceto quando indicado) Revestimento de superfície: SI: 4-8a; SII: 8-12a Flats: Um primária de DST-SEMI; Um Scribe Limpa e polida, os dois lados </td></tr><tr><td> Etcher iônica reativa profunda para os óxidos </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Argon Laser Ion </td><td> Cambridge Laser Laboratories </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> lambda = 258 nm </td></tr><tr><td> Argon Laser Ion </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> lambda = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Objetiva do microscópio </td><td> Thor Labs </td><td> RLO LMU-UVB 40X-0.5 NA </td><td> lambda = 258 nm </td></tr><tr><td> Objetiva do microscópio </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> lambda = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio Tradução Motorizada </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-12-6436 Series </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon Contador </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Andor Tecnologia </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

misturadores microfluídicos para estudar o dobramento de proteínas

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

O processo pelo qual um dobras de proteínas em sua conformação nativa é altamente relevante para a biologia e saúde humana mas ainda pouco compreendido. Uma razão para isso é que a dobragem tem lugar durante um vasta gama de escalas de tempo, a partir de nanosegundos em segundos ou mais, dependendo da proteína 1. Convencionais stopped-flow misturadores têm permitido a medição da cinética de dobragem a partir de cerca de 1 ms. Recentemente, desenvolvemos um misturador de microfluídica que dilui desnaturante ~ 100 vezes em ~ 8 mS 2. Ao contrário de um misturador de stopped-flow, este misturador opera no regime de fluxo laminar em que a turbulência não ocorre. A ausência de turbulência permite simulação numérica precisa de todos os fluxos dentro do misturador com excelente concordância para experimentar 3-4. O fluxo laminar é conseguida por números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluções aquosas, isto requer geometrias escala mícron. Nós usamos um substrato duro, tal como silício ou sili fundidaca, para fazer canais iM 5-10 de largura e 10 uM de profundidade (ver Figura 1). As menores dimensões, na entrada para a região de mistura, são da ordem de 1 mícron de tamanho. O chip é selado com um fino ou de vidro de sílica fundida lamela para o acesso óptico. Típicos totais taxas de fluxo linear são ~ 1 m / s, Re rendendo ~ 10, mas o consumo de proteínas é apenas ~ 0,5 nL / s ou 1,8 uL / hr. A concentração de proteína depende do método de detecção: Para triptofano fluorescência a concentração típica é de 100 uM (para 1 Trp / proteína) e para FRET a concentração típica é de ~ 100 nM. O processo de dobragem é iniciada por diluição rápida de desnaturante a partir de 6 M a 0,06 M de hidrocloreto de guanidina. A proteína em desnaturante alta flui para baixo de um canal central e está reuniu-se em ambos os lados na região de mistura por tampão sem desnaturante movendo ~ 100 vezes mais rápido (ver Figura 2). Esta geometria faz com que a constrição do fluxo rápido de proteína em uma estreitajet ~ 100 nm de largura. A difusão das moléculas de luz desnaturantes é muito rápida, enquanto que a difusão das moléculas de proteína pesados ​​é muito mais lenta, difundindo menos do que 1 mícron de 1 ms. A diferença de difusão constante do desnaturante e os resultados de proteína em diluição rápida do desnaturante a partir do fluxo de proteínas, reduzindo a concentração eficaz do desnaturante em torno da proteína. O jacto de proteína flui a uma taxa constante para baixo o canal de observação e de fluorescência da proteína durante a dobragem pode ser observada usando um microscópio confocal de varredura 5.

Neste trabalho, explicar a fabricação ea utilização de um misturador microfluídico capaz de mistura de duas soluções em ~ 8 mS. Nós também demonstrar a utilização destes misturadores com detecção de fluorescência utilizando espectroscopia de UV e de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

O processo pelo qual uma proteína se dobra em sua conformação nativa é extremamente relevante para a biologia e para a saúde humana, porém ainda é pouco compreendido. Uma razão...

O objetivo geral deste procedimento é misturar rapidamente duas soluções para iniciar uma reação bioquímica na escala de tempo de microssegundos. Isso é realizado primeiramente fabricando um misturador microfluídico. O segundo passo é ligar um chip a um vidro de cobertura para selar os canais.Em seguida, o chip é montado em um manifold que contém os reservatórios da solução. O passo final é obter imagens da solução mista utilizando microscopia de fluorescência confocal. Em última análise, a reação bioquímica é capturada na escala de tempo de microssegundos ao converter a distância ao longo do canal de saída em tempo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a mistura por parada de fluxo, é que a mistura não é limitada pela turbulência e ocorre em poucos microssegundos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da dobragem de proteínas, como por exemplo: quando ocorre o colapso hidrofóbico? Demonstrará o procedimento ling woo, pós-doutoranda do meu laboratório, para iniciar a fabricação de chips microfluídicos de mistura.Primeiro, limpe as pastilhas de silício com solução de piranha fresca, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, utilize um forno de deposição química por vapor a baixa pressão para aplicar um revestimento de polissilício com aproximadamente um mícron de espessura para cada 10 mícrons de profundidade pretendida nos canais microfluídicos finais. Após tratamento adicional das pastilhas conforme descrito no texto, faça a aplicação por centrifugação de uma camada de 900 nanômetros de espessura de fotoresina Z 52 14, seguida de pré-assamento a 90 graus Celsius diretamente em uma placa aquecedora por um minuto ou em forno a 110 graus Celsius por 30 minutos.Após alinhar uma máscara fotográfica, faça um contato duro e a vácuo expondo primeiro o fotoresiste à luz ultravioleta por vários segundos. Em seguida, desenvolva o padrão no fotoresiste conforme listado no protocolo escrito. Inspecione as características na pastilha com um microscópio e faça uma cura térmica a 115 graus Celsius diretamente sobre uma placa aquecedora por dois minutos.Em seguida, submeta as pastilhas ao tratamento com plasma de oxigênio ou Asher por 2,5 minutos, com potência de RF de 100 watts. Utilizando um gravador reativo por íons profundo, grave a camada de polissílica até atingir completamente a sílica fundida abaixo. Remova o fotoresistente remanescente e trate a pastilha conforme orientado no texto.Meça a profundidade da corrosão para garantir que ela atravesse completamente o revestimento de poli. Utilizando um gravador a plasma reativo profundo com capacidade de óxido, grave a sílica fundida até uma profundidade de aproximadamente 10 mícrons por mícron de espessura do revestimento de poli. Limpe a pastilha com o aparelho de cinzaseração por matriz durante quatro minutos, com potência de RF de 100 watts, e remova o polissilício com um gravador de fluoreto de xenônio antes de perfurar os orifícios na pastilha. Aplique por centrifugação uma nova camada de um mícron de resistência fotossensível para proteger os canais durante o manuseio subsequente.Em seguida, monte a pastilha com a face ativa voltada para baixo sobre uma placa de vidro sacrificial usando Aqua Bond 55. Tendo o cuidado de manter o bonder livre de bolhas, utilize uma broca de ponta de diamante controlada por computador e com refrigeração, juntamente com a solução de limpeza micro 90. Isso evita que pequenos fragmentos de vidro aderem aos canais, o que poderia entupir o chip durante o uso.Prossiga para perfurar furos de entrada e saída em cada chip. Enxágue a pastilha com água desionizada usando uma seringa para injetar água em cada furo. Em seguida, mergulhe em água com sabão por uma hora após a remoção da foto.Resist e adesivo conforme descrito no texto. Enxágue a pastilha com água desionizada e água morna com sabão. Enxágue novamente cada orifício com uma seringa, evitando as estruturas gravadas após passar nitrogênio pela pastilha.Continue a secar em estufa a vácuo ajustada a 120 graus Celsius. Inspecione os orifícios para garantir que estejam livres de partículas abrasivas e repita os passos de limpeza conforme necessário. Os seguintes passos devem ser realizados na sala limpa.Meça a profundidade dos canais com um perfilador de superfície óptico ou mecânico. Limpe a pastilha e um vidro de cobertura de sílica fundida conforme descrito no texto em uma sala limpa. Seque bem a pastilha com gás nitrogênio por pelo menos cinco minutos.Em seguida, posicione a pastilha com a face funcional voltada para cima sobre uma pilha de três a quatro panos de limpeza de sala limpa colocados sobre uma superfície plana e rígida, como uma pequena placa de vidro. Repita o procedimento com o vidro de cobertura. Segure o vidro de cobertura pela borda e vire-o de modo que a face polida fique voltada para baixo sobre a pastilha.Alinhe cuidadosamente as bordas planas, solte o lamínula sobre a pastilha e permita que ela assente; apenas empurre horizontalmente para ajustar o alinhamento. Pressione para baixo com um dedo no centro da pastilha. Deve-se observar um frente de ligação começando a se propagar para fora.Se necessário, aplique pressão adicional em outras posições ao redor da pastilha para promover a propagação da frente de ligação. Após colocar as pastilhas seladas em uma estufa de alta temperatura programada com o perfil de temperatura indicado no texto, corte a pastilha com uma serra de corte de pastilhas em chips individuais. O manifold para segurar o chip de mistura e as soluções pode ser fabricado em plástico, como lexan ou plexiglass, ou em alumínio.Para controle de temperatura, fixe o chip ao manifold usando pequenas o-rings e segure no lugar com um anel de retenção que permita uma visão óptica clara do centro do chip. Os sulcos para as o-rings devem ser mais rasos que o padrão para garantir um bom encaixe sem aplicar pressão excessiva sobre o chip. Após o chip ser montado, adicione soluções aos reservatórios central e laterais, tomando cuidado para liberar quaisquer bolhas aprisionadas na parte inferior dos poços.Coloque o manifold em um microscópio invertido e examine a região de mistura pela ocular ou pela saída da câmera. Uma lanterna incandescente colocada sobre o manifold fornecerá luz suficiente. Utilize um corante ou solução de alto índice de refração no canal central para visualizar o jato.Como os volumes utilizados neste misturador são tão pequenos, o fluxo pode ser controlado com pressão de ar aplicada acima dos poços da solução. Para visualizar o jato, comece com a pressão do canal lateral em zero libras por polegada quadrada e aumente lentamente até igualar à pressão do canal central. Se um dos canais laterais estiver entupido, o jato será empurrado contra uma das paredes do canal de saída.Se aparecer uma obstrução visível, ela pode ser removida aplicando pressão ou vácuo ao canal de saída com uma seringa. Se a proteína ou outro material orgânico obstruir o chip, ele pode ser limpo mediante imersão em solução piranha durante a noite. Introduza um feixe de laser revestido em um microscópio de pesquisa utilizando um espelho dicróico interno ou logo fora do microscópio.Alinhe o laser para que o foco possa ser visto na ocular ou câmera aproximadamente próximo à região de mistura. A fluorescência da proteína no misturador é coletada pela objetiva e enviada através do espelho dicróico, focalizada por uma lente até um orifício de pino e projetada em um contador de fótons. Varra o chip utilizando um scanner piezoelétrico em x e y para obter a imagem da região de mistura.Escolha uma posição no jato e faça uma varredura em X e Y para encontrar o foco no centro do canal na direção vertical. A profundidade de campo do microscópio é muito menor que a profundidade do canal, e a taxa de fluxo é uniforme no interior do canal, exceto dentro de um mícron das paredes. Portanto, a resolução temporal da fluorescência observada é determinada principalmente pelo tamanho do ponto confocal.Varra horizontalmente dentro do canal de saída em incrementos de 100 micrômetros ao longo do jato, observando por aproximadamente um milissegundo por posição. Mova o estágio do microscópio entre 80 e 90 micrômetros ao longo do jato para capturar tempos posteriores. Alternativamente, a luz pode ser detectada por um espectrógrafo e CCD após o espelho dicróico, utilizando uma lente para focalizar a luz na fenda de entrada.Como a coleta de dados é mais lenta do que no caso do contador de fótons, normalmente o jato é primeiro imageado com o contador de fótons e, em seguida, pontos ao longo do jato são medidos com o espectrógrafo. Os dados do contador de fótons são analisados somando-se três a cinco pixels ao redor do jato em cada posição, criando-se um gráfico de intensidade versus distância. O tempo é calculado a partir da distância, utilizando-se uma velocidade calculada com base nas pressões aplicadas.Como etapa final, analise os dados do espectrógrafo utilizando um dos métodos descritos no texto. Aqui é mostrado um gráfico de contorno da intensidade na região de mistura medida pelo contador de fótons. O fundo no canal de saída fora do jato deve estar próximo ao nível de ruído do detector e normalmente não é subtraído.Um fundo mais alto pode indicar má alinhamento ou que a proteína está aderindo às paredes do canal. Por outro lado, um jato com aparência entortado ou irregular, especialmente próximo à região de mistura, indica uma gravação inadequada das ponteiras. Um espectro resolvido no tempo é mostrado para a proteína ACell coenzyme a binding protein ou A CBP marcada com Alexa 4 88 e Alexa 6 47.Os retângulos verde e vermelho indicam os comprimentos de onda designados como canais doador e aceitador, respectivamente. Esses dados tiveram o fundo subtraído para remover a carga escura e o sinal do laser. O sinal de fundo foi obtido com a pressão do canal central ajustada para zero libras por polegada quadrada.O tempo de mistura pode ser medido por meio da análise de uma reação rápida que seja muito mais rápida do que a mistura, como o rebaixamento da fluorescência de triptofano pelo iodeto de potássio. Como o jato é menor do que a resolução óptica do microscópio, ocorre uma grande queda na intensidade na região de mistura. À medida que o jato se forma, essa resposta do instrumento pode ser removida realizando-se uma medição controle na qual não há alteração nas condições da solução.A razão entre experimentos de mistura e não mistura da fluorescência do amido de N-acetil triptofano é exibida nesta figura. A linha mostra a concentração prevista de iodeto de potássio a partir de modelagem e simulações multiphysics de console. O tempo de mistura, medido como o tempo necessário para a concentração diminuir 80%, é de oito microssegundos.Este gráfico mostra as alterações no fret da proteína A CBP após a diluição do desnaturante de seis molares para 0,06 molares. Estes dados não requerem um experimento controle. Como o fret já é uma razão e a resposta do instrumento já foi removida, o salto rápido próximo a T igual a zero representa uma mudança rápida no sinal de fret dentro do tempo de mistura.Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de dobramento de proteínas explorarem as etapas iniciais na formação da estrutura proteica.

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Bioengineering

Bioengenharia

Aqui, descrevemos um procedimento que emprega a técnica schlieren em microescala para medir a heterogeneidade da mistura em um dispositivo microfluídico. Por meio da calibração, a distribuição do gradiente de concentração pode ser derivada da imagem micro-schlieren.

Analisando falta de homogeneidade de mistura em um dispositivo micro, pela técnica Microscale Schlieren

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Demonstramos a fabricação e o uso de um dispositivo microfluidic que permite múltiplas partículas microrheology medições para estudar os efeitos reológicos de transições de fase repetidas em matéria mole de rastreamento.

Combinando microfluídica e Microrheology para determinar as propriedades reológicas de matéria mole durante as transições de fase repetidas

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

O protocolo aqui apresentado descreve o uso do Spotiton, um novo sistema robótico, para entregar duas amostras de interesse em uma grade de nanofios que se misturam por um mínimo de 90 ms antes da vitrificação em criogen líquido.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Este protocolo combina fotometria de massa com um novo sistema microfluídico para investigar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Essa abordagem é baseada na rápida diluição de complexos altamente concentrados em solução, o que permite medições de baixa afinidade e amplia a aplicabilidade da fotometria de massa.

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

A fabricação de um dispositivo de bicamada à base de polidimetilsiloxano (PDMS) para a produção de bibliotecas combinatórias em emulsões de água em óleo (plugs) é apresentada aqui. O hardware e o software necessários para automatizar a produção de plugues são detalhados no protocolo, e a produção de uma biblioteca quantitativa de plugues fluorescentes também é demonstrada.

Dispositivo microfluídico bicamada para produção de plugue combinatório

Este protocolo detalha o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico adequado para investigar a mecânica do polímero de microtúbulos. A síntese de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Neste artigo, apresentamos um método baseado em microfluídicos para o confinamento de partículas com base no fluxo hidrodinâmico. Demonstramos prendendo partículas estáveis ​​em um ponto de estagnação de fluidos utilizando um mecanismo de controle feedback, permitindo assim confinamento e micromanipulação de partículas arbitrário em um microdispositivo integrado.

A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

Aprenda a fabricar misturadores microfluídicos para estudar o dobramento de proteínas com mistura em aproximadamente 8 microssegundos. Esta técnica utiliza detecção por espectroscopia de fluorescência e FRET.

Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

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