Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é misturar rapidamente duas soluções para iniciar uma reação bioquímica na escala de tempo de microssegundos. Isso é feito fabricando primeiro um misturador microfluídico. O segundo passo é colar um chip a uma tampa de vidro para selar os canais.

Em seguida, o chip é montado em um coletor que contém os reservatórios da solução. A etapa final é obter imagens da solução mista usando microscopia de fluorescência confocal. Em última análise, a reação bioquímica é capturada na escala de tempo de microssegundos, convertendo a distância ao longo do canal de saída em tempo.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a mistura de fluxo de parada, é que a mistura não é limitada pela turbulência e ocorre em alguns microssegundos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de dobramento de proteínas, como quando ocorre um colapso hidrofóbico? Demonstrando o procedimento estará ling woo, um pós-doutorado para o meu laboratório Para iniciar a fabricação de chips de mistura microfluídica.

Primeiro, limpe wafers de sílica FU de quatro polegadas com solução de piranha fresca, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, use um forno de deposição de vapor químico de baixa pressão para aplicar um revestimento de polissilício com aproximadamente um mícron de espessura por cada profundidade pretendida de 10 mícrons dos canais microfluídicos finais. Após um tratamento mais aprofundado das bolachas, conforme descrito no texto, gire a camada das bolachas com uma camada de 900 nanômetros de espessura de uma foto Z 52 14 Resista e leve ao forno a 90 graus Celsius diretamente em uma chapa quente por um minuto ou em um forno a 110 graus Celsius por 30 minutos.

Depois de alinhar uma máscara fotográfica, faça um contato rígido e a vácuo expondo primeiro a fotorresistência à luz ultravioleta por vários segundos. Em seguida, desenvolva o padrão na fotorresistência conforme listado no protocolo escrito. Inspecione as características do wafer com um microscópio e leve ao forno a 115 graus Celsius diretamente em uma placa quente por dois minutos.

Em seguida, faça o DCU dos wafers com Asher ou plasma de oxigênio por 2,5 minutos a 100 watts de potência de RF. Usando um íon reativo profundo, grave a camada de sílica poli até a sílica fundida abaixo. Retire a foto restante, resista e trate o wafer conforme indicado no texto.

Meça a profundidade de gravação para garantir que ela esteja em todo o revestimento de polietileno. Usando um íon reativo profundo capaz de óxido, a gravura em àgua forte fundiu a sílica a uma profundidade de aproximadamente 10 mícrons pela espessura do mícron do revestimento poli. Limpe o wafer com a matriz Asher por quatro minutos, uma potência de RF de 100 watts e retire o polissilício com um gravador de xenônio di fluoreto antes de fazer furos na camada de rotação do wafer com uma nova camada de um mícron de fotorresistência para proteger os canais durante o manuseio subsequente.

Em seguida, monte o wafer com o lado voltado para baixo em uma placa de vidro sacrificial usando Aqua Bond 55. Tomando cuidado para manter o colante livre de bolhas, resfriador de broca de ponta de diamante controlada por computador com solução de limpeza micro 90. Isso evita que pequenos pedaços de vidro grudem nos canais, que obstruem o chip durante o uso.

Prossiga para perfurar, fazer furos de entrada e saída em cada cavaco. Enxágue o wafer com água deionizada usando uma seringa para injetar água em cada orifício. Em seguida, mergulhe em água com sabão por uma hora após a remoção da foto.

Resista e se una conforme descrito no texto. Enxágue o wafer com água deionizada e água morna com sabão. Enxágue cada orifício novamente com uma seringa, evitando as características gravadas após fluir nitrogênio sobre o wafer.

Continue a secar em um forno a vácuo ajustado para 120 graus Celsius. Inspecione os orifícios para garantir que estejam livres de areia e repita as etapas de limpeza conforme necessário. As etapas a seguir devem ser executadas na sala limpa.

Meça a profundidade dos canais com um perfilador de superfície óptico ou mecânico. Limpe o wafer, bem como um fusível de sílica Cubra o vidro conforme descrito no texto em uma sala limpa. Seque bem o wafer com gás nitrogênio por pelo menos cinco minutos.

Em seguida, coloque o wafer com o lado voltado para cima em cima de uma pilha de três a quatro lenços umedecidos colocados em cima de uma superfície plana e dura, como um pequeno painel de vidro. Repita com a lamínula. Pegue o vidro de cobertura pela borda e inverta-o de forma que o lado do polimento fique voltado para baixo sobre o wafer.

Alinhe as bordas planas com cuidado, solte a lamínula no wafer e deixe-o assentar horizontalmente apenas para ajustar o alinhamento. Empurre para baixo com um dedo no centro do wafer. Deve-se ver uma frente de ligação começar a irradiar para fora.

Se necessário, aplique pressão adicional em outras posições ao redor do wafer para avançar a frente de colagem. Depois de colocar os wafers selados em um forno de alta temperatura programado com o perfil de temperatura listado no texto, corte o wafer em cubos com uma serra de corte em cubos de wafer em chips individuais. O coletor para segurar o chip de mistura e as soluções pode ser feito de plástico, como lexan ou plexiglass ou alumínio.

Para controle de temperatura, faça o chip no coletor por pequenos anéis de vedação e segure no lugar com um anel de retenção que permite uma visão óptica clara do centro do chip. As ranhuras do O-ring devem ser mais rasas do que o padrão para garantir um bom acoplamento sem aplicar muita pressão no cavaco. Uma vez montado o cavaco, adicione soluções aos reservatórios central e lateral, tomando cuidado para liberar quaisquer bolhas presas no fundo dos poços.

Coloque o coletor em um microscópio invertido e examine a região de mistura com a ocular ou a saída da câmera. Uma lanterna incandescente colocada no topo do coletor fornecerá luz suficiente. Use um corante ou solução de alto índice de refração no canal central para visualizar o jato.

Como os volumes usados neste misturador são tão pequenos, o fluxo pode ser controlado com a pressão do ar aplicada acima dos poços de solução. Para visualizar o jato, comece com a pressão do canal lateral em zero libras por polegada quadrada e aumente lentamente para a mesma pressão com o canal central. Se um canal lateral estiver entupido, o jato será empurrado contra uma das paredes do canal de saída.

Se um entupimento visível aparecer, ele pode ser desalojado aplicando pressão ou vácuo no canal de saída com uma seringa. Se a proteína ou outro material orgânico entupir o chip, ele pode ser limpo por imersão e solução de piranha durante a noite. Traga um feixe de laser revestido para um microscópio de grau de pesquisa usando um espelho dicróico dentro ou fora do microscópio.

Alinhe o laser de modo que o foco possa ser visto na ocular ou na câmera um pouco perto da região de mistura. A fluorescência da proteína no misturador é coletada pela objetiva e enviada através do espelho dicróico focalizado por uma lente para um orifício e fotografado em um contador de fótons. Digitalize o chip usando um scanner elétrico pizo em x e y para obter imagens da região de mistura.

Escolha uma posição no jato e escaneie X e Y para encontrar o foco no centro do canal verticalmente. A profundidade de campo do microscópio é muito menor que a profundidade do canal e a taxa de fluxo é uniforme no canal, exceto dentro de um mícron das paredes. Portanto, a resolução temporal da fluorescência observada é determinada principalmente pelo tamanho do ponto confocal.

Varra horizontalmente dentro do canal de saída em incrementos de 100 mícrons ao longo do jato, observando por aproximadamente um milissegundo por posição. Mova a platina do microscópio em 80 a 90 mícrons ao longo do jato para capturar tempos posteriores. Alternativamente, a luz pode ser detectada por um espectrógrafo e CCD após o espelho dicróico usando uma lente para focalizar a luz na fenda de entrada.

Como a coleta de dados é mais lenta do que para o contador de fótons, normalmente o jato é fotografado primeiro com o contador de fótons e, em seguida, os pontos ao longo do jato são medidos com o espectrógrafo. Os dados do contador de fótons são analisados somando de três a cinco pixels ao redor do jato em cada posição para criar um gráfico de intensidade versus distância. O tempo é calculado a partir da distância usando uma velocidade calculada com base nas pressões aplicadas.

Como etapa final, analise os dados do espectrógrafo usando um dos métodos descritos no texto. Aqui é mostrado um gráfico de contorno da intensidade na região de mistura medida pelo contador de fótons. O fundo no canal de saída fora do jato deve estar próximo ao nível de ruído do detector e normalmente não é subtraído.

Um fundo mais alto pode indicar mau alinhamento ou que a proteína está aderindo às paredes do canal. Por outro lado, um jato que parece torcido ou torto, especialmente perto da região de mistura, indica uma gravação ruim dos bicos. Um espectro resolvido no tempo é mostrado a partir da proteína ACell, coenzima a, uma proteína de ligação ou A CBP marcada com Alexa 4 88 e Alexa 6 47.

Os retângulos verde e vermelho mostram os comprimentos de onda designados como canais doadores e aceitos, respectivamente. Esses dados foram subtraídos em segundo plano para remover a carga escura e o sinal do laser. O sinal de fundo foi obtido com a pressão do canal central, como zero libras por polegada quadrada.

O tempo de mistura pode ser medido medindo uma reação rápida que é muito mais rápida do que a mistura, como a extinção da fluorescência do triptofano por iodeto de potássio. Como o jato é menor que a resolução óptica do microscópio, há uma grande queda de intensidade na região de mistura. À medida que o jato se forma, essa resposta do instrumento pode ser removida fazendo uma medição de controle na qual nenhuma condição de solução muda.

A proporção de experimentos de mistura e não mistura de fluorescência de N-acetil triptofano amida é exibida nesta figura. A linha mostra a concentração prevista de iodeto de potássio a partir de modelagem e simulações multifísicas de console. O tempo de mistura medido no tempo para a concentração diminuir 80% é de oito microssegundos.

Este gráfico mostra as mudanças de traste na proteína A CBP após a diluição da desnaturação de seis molares para 0,06 molar. Esses dados não precisam de um experimento de controle. Como o traste já é uma razão e a resposta do instrumento já foi removida, o salto rápido próximo a T igual a zero representa uma mudança rápida no sinal do traste dentro do tempo de mixagem.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do dobramento de proteínas explorarem os primeiros passos na formação da estrutura da proteína.