Name: Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprenda a monitorar células e tecidos sem contato e sem marcadores usando espectroscopia Raman. Esta técnica laser permite analisar a composição bioquímica de amostras biológicas em tempo real.

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Agradecemos Steffen Koch por seu apoio técnico e Shannon Lee Layland (ambos Fraunhofer IGB Stuttgart) por suas sugestões úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo programa Atrair da Fraunhofer-Gesellschaft e do BMBF (tanto para KS-L.).

1. Preparação da amostra biológica <ol><li> Preparação de células vivas <ol><li> Preparação de células aderentes <ol><li> Sementes em células in vitro-cultivados ou recentemente isolado sobre um prato de fundo de vidro (Greiner BioOne / Alemanha) e incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 até ligação de células é concluída. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar suavemente três vezes com PBS antes de medição. Manter as células cobertas com PBS ou meio de cultura celular em todo o procedimento de medição todo. </li></ol></li><li> Preparação das células em suspensão <ol><li> Retire in vitro em cultura de células de acordo com protocolos comuns (por exemplo, tripsina-EDTA, raspagem célula), centrifugar as células e re-suspender o sedimento celular obtido em PBS ou meio de cultura celular. </li><li> Transferir 100 uL da suspensão de células (concentração: max. 100.000 células / ml) para um prato de fundo de vidro. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de native tecidos <ol><li> Após a colheita dos tecidos, transferi-los para estéril, PBS gelado e mantê-los não mais do que 12 horas a 4 ° C, ou por medição gelo antes. As experiências anteriores demonstram que um tempo de armazenamento prolongado (tempo de isquemia fria de 12 horas a 4 ° C) resultou em alterações espectrais devido aos processos de degradação naturais. </li><li> As medições devem ser realizadas com o tecido coberto em PBS ou meio para evitar danos das proteínas de ECM e células devido a secagem dos tecidos. </li></ol></li></ol> 2. Raman Spectrometer O nosso espectrómetro de Raman personalizado combina um microscópio de fluorescência padrão (Olympus IX 71) com um espectrómetro de Raman, que permite a comparação directa das imagens de campo brilhante e fluorescência com os espectros de Raman. O conjunto de base até consiste de um 784 nm diodo laser (Toptica fotónica AG / Alemanha), um filtro de entalhe para a separação da luz Raman-dispersa a partir da luz de excitação, um microscópio umand a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EUA) com um dispositivo de carga acoplado (CCD da câmera) otimizado para a detecção de informação espectral (F-vista do Soft Systems imagem / Alemanha) 3. Controle da Função Laser <ol><li> Inicie o software Andor Solis (Andor / Reino Unido) e ajustar a temperatura da câmara CCD a -60 ° C para minimizar o ruído causado pelas correntes termicamente induzidas na câmara. </li><li> Colocar uma bolacha de silício sobre a platina do microscópio para o procedimento de calibração. </li><li> Ligar o laser e definir o poder de 85 mW. </li><li> Use o software Célula B (Olympus / Alemanha) para focalizar o laser sobre a bolacha até parece XY. </li><li> Medir a bolacha de silício com um tempo de integração única de 1 seg usando um objectivo ar 60x. </li><li> Alterar a unidade do eixo-x a partir do número de pixels para mudança de Raman (cm -1) no software Solis Andor. </li><li> Variar o foco do laser do pico de silício a 520 cm -1 emo espectro recolhido a fim de encontrar a intensidade máxima possível para esta banda Raman. A quantidade mínima de contagens deve ser superior a 11.000 para ter uma calibração bem sucedida. </li></ol> 4. Raman medições espectroscópicas Todas as medições são realizadas à temperatura ambiente. <ol><li> As definições básicas <ol><li> Usar uma objectiva de imersão em água 60x (Olympus / Alemanha) com uma abertura numérica de 1,2 para recolher o espectro das amostras. </li><li> Alterar as configurações de aquisição a 10 integrações / 10 segundos para um total de 100 segundos por medições. </li></ol></li><li> Medição de células aderentes <ol><li> Pegue o prato com fundo de vidro com as células e colocá-lo no palco microscópio. </li><li> A fim de obter um melhor sinal e garantir a reprodutibilidade, foco do laser sobre o núcleo da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. </li><li> Meça um espectro de referência do fundo emuito espectros 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. É importante considerar que ao mudar o foco um novo fundo devem ser recolhidos para cada profundidade de foco. </li></ol></li><li> Medição de células em suspensão <ol><li> Transferir 100 uL da suspensão de células numa cápsula de fundo de vidro e colocá-la na platina do microscópio. </li><li> Foco do laser sobre o centro da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. </li><li> Meça um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. </li></ol></li><li> Medição dos tecidos nativas <ol><li> Leve a amostra e colocá-lo em um prato fundo de vidro. A região de interesse (RDI) devem ser orientados de frente para o fundo do prato. </li><li> Encha o prato com PBS suficiente para cobrir a amostra. </li><li> Coloque um vidro de cobertura sobre a amostra para evitar qualquer movement da amostra durante as medições. </li><li> Definir o foco do laser na estrutura de interesse (resolução de profundidade é a laser e tecido-dependente) e começar a recolher os espectros. </li><li> Recolher um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10 movendo-se o laser de se concentrar para fora da área do tecido todo. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. </li></ol></li><li> Medição de imunofluorescência (IF)-rotulados criossecções <ol><li> Seção fresco, congelado amostras de tecido usando um cryotom padrão e montá-los em vidros de sílica revestidos de cobertura. </li><li> Manchar os criossecções seguindo um protocolo de rotina para IF, empregando apenas um passo de fixação curto (máximo 10 minutos, com paraformaldeído a 4%) e utilizando anticorpos adequados para a detecção da proteína de interesse. </li><li> Realizar medições Raman centrados na área onde ocorre a fluorescência. </li></ol></li><li> Degradação experimentos elastina <ol><li> Place o ventricularis dos dissecados folhetos aórticos porcinos válvula (elastina-rico, a camada de sangue influxo lado do folheto da válvula cardíaca) voltados para o fundo do prato de fundo de vidro. </li><li> Medir o tecido nativo como um &#39;de controlo não-incubada&#39; menos 30 pontos aleatórios em toda a superfície do tecido todo focagem nas estruturas fibrilares. </li><li> Dividir a amostra em 3 secções e colocá-los em separados 2,5 tubos Eppendorf ml cheios com 2 ml de uma solução de elastase (5 U / ml, Worthington / Alemanha). </li><li> Incubar o tecido para 15 ou 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Após incubação durante 15 ou 30 minutos, remover os tecidos a partir do tubo de Eppendorf e lavar cuidadosamente com PBS, a fim de parar completamente a reacção enzimática. </li><li> Meça cada amostra em 30 pontos aleatórios, concentrando-se nas estruturas fibrilares. </li></ol></li></ol> 5. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Processamento de espectros Raman O pré-tratamento doOs espectros de gerado foi realizada usando software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemanha). <ol><li> A fim de reduzir sinais de interferência a partir do vidro e médio bem como para evitar variações provocadas por alterações no foco durante as medições, subtrair o espectro de fundo correspondente a partir dos espectros recolhidos. </li><li> Reduzir o espectro para a região número de onda entre 400-1800 cm -1, que oferece a maior quantidade de informações. </li><li> Se necessário, normalizar os espectros para o pico máximo. Fatores de normalização fora das flutuações de intensidade e falhas sistemáticas, simplificando a detecção de mudanças estruturais no espectro da amostra. </li><li> Realizar uma correção de linha de base para aumentar a comparabilidade entre diferentes experimentos. </li></ol></li><li> Análise dos espectros Raman Os espectros Raman foram analisados ​​utilizando PCA com o software Unscrambler (CAMO / Noruega). Esta análise multivariada detecta diferenças e semelhanças nos dados espectraisconjuntos. Cada espectro é plotado como um ponto único em um espaço multidimensional com base nas contagens coletados para cada turno Raman. Cada componente de princípio (PC) descreve uma certa quantidade, o total de informação contida nos dados originais. O primeiro PC é a que contém a maior fonte de variação. Cada PC a seguir contém, na ordem, menos informação do que o anterior. Cada variável tem uma pontuação e uma carga em cada PC. Ao traçar PCs (= pontos), correlações importantes amostras podem ser expostos. As cargas descrever a contribuição de cada variável analisada para o PCA. <ol><li> Rotular cada grupo de medidas, criando faixas de linha para cada grupo de amostra. </li><li> Utilize as seguintes definições básicas para o PCA: validação cruzada, o algoritmo NIPALS, sem rotação e iniciar a análise. Essas configurações são espectros dependente. </li><li> Execute o PCA. </li></ol></li></ol> 6. Os resultados representativos Raman spECTRA gerada a partir de células aderentes revelam frequentemente uma relação sinal-ruído baixo e uma intensidade de sinal global baixo (Fig. 1). 11 Devido ao facto de que o foco do laser tem de ser definido perto do fundo do vidro, a influência da interferindo sinal de vidro é bastante elevado, causando mascaramento do sinal de amostra real. Por conseguinte, o sinal da amostra pode ser minimizada ou eliminada, mesmo durante um subsequente fundo subtracção. Assim, nós preferimos usar células em suspensão para a nossa análise espectroscópica de Raman, uma vez que permitem a detecção de uma informação mais detalhada espectral. No entanto, os espectros de células aderentes e suspensão exibem os mesmos picos principais diferindo apenas nas suas intensidades. Para a caracterização de tipos de células diferentes dentro de uma suspensão, sem pré-tratamento é necessário. Os espectros de Raman média e desvio padrão de fibroblastos humanos, células estaminais mesenquimais (MSCs), condrócitos e queratinócitos medido em suspensão sãorepresentado na Figura 2. Todos os espectros de Raman são similarmente estruturado, com picos proveniente de biomoléculas típicos, tais como proteínas, ácidos nucleicos e lípidos (ver Tabela 1). 12 Para estes tipos de células, a região espectral entre 600 e 1800 cm -1 contém mais relevante informação espectral, por qual as diferenças claras são detectáveis ​​entre os diferentes tipos de células (Fig. 2A). Exemplar, destacamos uma região espectral (1280-1350 cm -1) apresentando claras diferenças estruturais, que pode ser atribuído às vibrações moleculares de colágeno e lipídios. Em contraste, as alterações morfológicas não são adequados para a identificação e distinção da maioria das células (Fig. 2B-I). Embora a diferença entre os condrócitos e células da pele é observável (Fig. 2D, H versus B, F e E, I), os fibroblastos e os MSCs são difíceis de separar usando unicamente de campo brilhante micrsocopiar (Fig. 2B, F versus C, G). 13 Análise espectroscópica de Raman do tecido nativo, particularmente das proteínas da MEC, requer que um ROI pode ser visualizado por brilhante-campo de imagem, a fim de ser capaz de se concentrar na respectiva estrutura. Para a atribuição de uma proteína a um espectro de impressão digital específica, geramos espectros Raman de proteínas disponíveis comercialmente puros e criosecções immunohistologically manchadas. Aqui, identificamos os espectros de impressões digitais das fibras elásticas em tecidos nativos comparando elastina liofilizado e imunofluorescência manchadas criosecções empregando um anticorpo contra elastina. No entanto, uma vez que a elastina possui uma autofluorescência elevada, o que se reflecte no espectro de Raman, a análise dos dados é um desafio (Fig. 3A). Para reduzir o fracasso sistemático devido à amostra propriedades específicas, tais como, autofluorescência um processamento adequado dos conjuntos de dados é crucial. Em nossos dados de umalyses, utilizou-se a normalização para eliminar a intensidade do sinal significativamente mais elevado da proteína pura de elastina, e assim, fomos capazes de gerar espectros de Raman comparável (Fig. 3B). A elastina é uma das proteínas de ECM mais estáveis ​​do corpo e é, portanto, muito difícil de se degradar. 14 No nosso conjunto experimental acima, nós induzida degradação da elastina em saudáveis ​​suína folhetos da válvula aórtica através da realização de uma digestão enzimática. Aplicando a análise multivariada PCA, identificou-se diferenças significativas entre os espectros de Raman do enzimaticamente tratados com as amostras e controlos nativas (Fig. 3C). Estas diferenças espectrais foram observados no espectro de carregamento em 861, 1003 e 1664 cm1. Esperados alterações estruturais nas fibras de elastina contendo devido aos tempos de exposição prolongados para elastase foram mostradas através de coloração de Hart (Fig. 4), que foram também se reflecte no mais grupos distintos de pontuação separáveis ​​(Fig. 3C). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figura 1. A média de espectros Raman de fibroblastos destacados e aderente. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figura 2. (A) A média de espectros Raman e desvios-padrão de quatro diferentes tipos de células isoladas primárias (fibroblastos, células mesenquimais, condrócitos e queratinócitos). A armação destaca a região espectral de 1280 - 1350 cm1 com diferenças estruturais. (BE) de campo brilhante imagens de geminadas (B) fibroblastos, (C) MSCs, (D) condrócitos e (E) queratinócitos. Barra de escala é igual a 20 microns. (FI) de campo brilhante imagens de aderentes (F) fibroblastos, (G) MSCs, (H) e condrócitos i) queratinócitos. Barra de escala é igual a 200 mM. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figura 3. (A) Os espectros de Raman sem normalização da lyophilized elastina (linha azul), imunofluorescência (IF)-rotulados criosecções (linha laranja) e fibras elásticas (linha vermelha) medidos dentro folhetos da válvula aórtica nativa. A intensidade de sinal de alta da elastina liofilizado é causada por autofluorescência. (B) Os espectros de Raman após a normalização, a fim de eliminar falhas sistémicas. (C) Resultados e cargas da comparação entre controle não-tratado (vermelho) e enzimaticamente degradado (azul e verde) elásticas fibras dentro do tecido nativo. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figura 4. HART&#39;s manchadas de suínos folhetos da válvula aórtica. As fibras elásticas são visualizados em preto. (A) e (B) mostram controle não-tratado e (C) e (D) mostram amostras de tecido que foram expostos a enzima elastase elastina-degradantes para 30 minutos. <table border="1"><tbody><tr><td> Número de onda em cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Atribuição de 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipídios </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> ADN / ARN bases, Backbone OPO </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanina </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> III amida </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Proteína / lípido </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amida IC = C </td><td> Lipídeos </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Bandas Raman que são detectados dentro de espectros de todos os tipos de células (fibroblastos, MSCs, condrócitos e queratinócitos).

<ol><li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li>
<li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li>
<li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Med.+Devices%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues%3A+implications+for+long-term+graft+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12(1928).</li>
<li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+scattering+of+collagen%2C+gelatin%2C+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li>
<li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li>
<li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li>
<li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Spectroscopy%3A+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+elastic+tissue+biology%3A+elastin+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li>
<li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A espectroscopia Raman é uma ferramenta adequada para analisar amostras biológicas, tais como in vitro em cultura de células e proteínas de ECM, bem como células nos tecidos nativas. 11,15,16 Aqui, foi demonstrado que este contacto não-,-label livre técnica permite que o discriminação de diferentes tipos de células e na detecção de ECM degradação de proteínas exclusivamente com base na composição biomolecular intrínseca dessas amostras biológicas. A principal vantagem da espectroscopia de Raman é a capacidade de não-invasiva quantificar a impressão digital bioquímica de uma amostra por sua espectros Raman resultante. Em contraste com a espectroscopia no infravermelho, o que produz informação semelhante, espectros de Raman podem ser recolhidos a partir de amostras aquosas, como a dispersão de Raman a partir de água é fraca. Além disso, espectroscopia de Raman é unicamente com base na detecção de retroespalhamento de luz monocromática, portanto, não é necessário o processamento da amostra de medição anterior. Estes atributos fazem Raespectroscopia homem uma alternativa promissora para o potencial em aplicações de imagem in vivo. Neste âmbito, coerente anti-stokes espectroscopia Raman (CARS) é uma técnica muito interessante, pois permite mais rápido e mais sensível aquisição de dados com base nos mesmos sinais vibracionais utilizadas em nossos experimentos. 15,16 Outros métodos alternativos, incluindo multifotônica induzida por autofluorescência e de imagem de segunda geração harmónica tenham sido previamente demonstrado ser adequada para a monitorização amostras biológicas não-invasiva ou mínima. 17 No entanto, estes métodos de imagem estão associados com custos muito elevados e são limitados a autofluorescência geradoras de moléculas. Além disso, espectrómetro de Raman é fácil de se combinar com microscópios ópticos convencionais. Estas características tornam a espectroscopia Raman uma ferramenta valiosa para estudar amostras biológicas em ambientes fisiológicos. Uma das limitações atuais do nosso espectroscopia Raman é criadoo foco do laser relativamente pequeno (250 nm máximo meia largura total (FWHM) lateral e 700 nm FWHM axial) que é criado por um objectivo alta abertura numérica (NA = 1,2). Embora uma alta abertura numérica permite cobrir uma boa quantidade de luz emitida Raman rendendo em uma relação sinal-ruído elevado, o NA elevada produz apenas um foco de recolha pequena dentro da amostra que é tipicamente muito menor do que uma célula. A fim de comparar os espectros Raman de células diferentes, a recolha de um espectro representativo é essencial, que é difícil de obter, com uma área de focagem pequeno. Para resolver este problema, estamos trabalhando em um processo para automatizar a coleta de sinal em diferentes pontos dentro da célula (= mapeamento Raman espectroscópica), resultando em uma média espectral e ceder a um espectro representativo. Além disso, esta técnica irá fornecer uma visão geral da distribuição de bandas específicas de Raman, por exemplo da distribuição da proteína dentro de uma célula. BiolAs amostras ogical são altamente complexas e consistem de uma mistura heterogénea de biomoléculas que contribuem para os espectros de Raman recolhidos. Portanto, o padrão espectral é altamente complexa e no controlo de um único tipo de uma molécula dentro de um espectro de Raman é difícil de realizar com a sobreposição de sinais de moléculas diferentes. Além disso, a fluorescência intrínseca da amostra pode mascarar informação valiosa de mais fracos sinais de Raman. Curiosamente, em alguns de nossos estudos anteriores, identificamos autofluorescência nos espectros Raman como o principal fator de diferenciação entre tipos de células (MSCs e fibroblastos), utilizando uma ferramenta de análise apropriado 13. Também identificamos que as mudanças na intensidade do sinal Raman global pode servir como um indicador para o estado de colágeno e fibras de colágeno dentro do ECM de folhetos da válvula aórtica. 9 No entanto, ao analisar o estado de elastina nestes tecidos, não foram capazes de detectar resultados semelhantes. Como mencionado no resultadoseção s, que só foram capazes de detectar alterações específicas de bandas Raman nas amostras tratadas com elastase quando comparados com os controles nativos. Nós não vimos uma diminuição do sinal global Raman nas amostras tratadas enzimaticamente como esperado. Estas observações resultou em uma trama pontuação que não revelou uma formação de aglomerados claro como pode ser visto no estudo anterior. 9 Em contraste, a influência do tratamento enzimático foi detectável dentro dos resultados do APC. Supomos que essas discrepâncias entre as duas proteínas de ECM, elastina e colágeno, são baseadas em diferenças morfológicas e diferentes processos de degradação enzimática: dentro do folheto da válvula aórtica, a zona rica em colágeno (fibrosa) é uma camada contínua que fica solta devido à tratamento enzimático, através do qual o elastina contendo zona (ventricularis) tem uma configuração de rede que aparece fragmentado após a exposição a elastase (Fig. 4). Medições pontuais individuais não eram, portanto, aprocomeu para detectar tais pequenas rupturas dentro da rede de elastina. Aqui, um mapeamento de Raman do tecido iria ajudar a identificar avarias de redes. Um outro desafio em espectroscopia de Raman de amostras biológicas é reduzir os tempos de medição. Uma solução consiste em aumentar a potência do laser, que é adequado, desde que as amostras biológicas não são afectados por foto-danos. Todas as nossas experiências em curso são a prova de princípio de estudos com foco em pesquisa básica, no entanto, nosso objetivo geral é implementar a espectroscopia Raman para aplicações clínicas, incluindo a medicina regenerativa (por exemplo, controle de qualidade do tecido de produtos), pré-transplante de monitorização do enxerto e diagnóstico de câncer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> elastase </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpo anti-elastina </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampão citrato </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> pratos de vidro de fundo </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> O Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sem contato, monitoramento label livre de células e matriz extracelular utilizando espectroscopia raman

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Tecnologias não-destrutiva, sem contato e sem rótulo para monitorar células e culturas de tecidos são necessários no campo da pesquisa biomédica. 1-5 métodos de rotina No entanto, atualmente disponíveis exigem etapas de processamento e alterar a integridade da amostra. A espectroscopia Raman é um método rápido que permite a medição de amostras biológicas sem a necessidade de passos de processamento adicionais. . Esta tecnologia baseada em laser detecta o espalhamento inelástico de luz monocromática 6 Como cada vibração química é atribuído a uma banda específica de Raman (número de onda em cm -1), cada amostra biológica apresenta um padrão típico espectral devido à sua composição bioquímica inerente 7. - 9 Dentro espectros Raman, as intensidades de pico correlacionar com a quantidade das ligações presentes moleculares. 1 semelhanças e diferenças dos conjuntos de dados espectrais pode ser detectado através do emprego de uma análise multivariada (por exemplo, análise de componentes principais (PCA)). 10 </sup&gt; Aqui, nós realizar espectroscopia de Raman de células vivas e tecidos nativas. As células são semeadas quer em pratos de fundo de vidro ou mantidos em suspensão sob condições de cultura de células normais (37 ° C, 5% de CO 2) antes da medição. Tecidos nativos são dissecados e armazenado em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C medições anteriores. Dependendo do nosso conjunto experimental acima, nós então ou focado no núcleo da célula ou da matriz extracelular (ECM) proteínas tais como a elastina e colagénio. Para todos os estudos, um mínimo de 30 células ou 30 pontos aleatórios de interesse dentro do ECM são medidos. Etapas de processamento de dados incluído subtração de fundo e normalização.

A espectroscopia Raman é uma técnica adequada para o contato não, rótulo sem análise de células vivas, tecidos engenharia de construções e tecidos nativos. Fonte específicos impressões digitais espectrais podem ser gerados e analisados ​​utilizando análise multivariada.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Tecnologias não destrutivas, sem contato e livres de marcadores para monitorar culturas de células e tecidos são necessárias no campo da pesquisa biomédica.1-5 No entanto, ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar células e tecidos por meio de um método sem contato e sem marcadores. Isso é alcançado por meio da espectroscopia Raman, uma tecnologia baseada em laser que detecta a dispersão inelástica de luz monocromática, produzindo um padrão espectral típico para cada amostra biológica com base em sua composição bioquímica intrínseca, utilizando um microscópio de fluorescência padrão acoplado a um espectrômetro Raman. A comparação direta de imagens em campo claro e de fluorescência com espectros Raman é usada para monitorar inúmeras amostras biológicas.Cada vibração química é atribuída a uma banda Raman específica, e a intensidade do pico é correlacionada com a quantidade das ligações moleculares presentes. Detectam-se semelhanças e diferenças entre os conjuntos de dados espectrais. Ao utilizar uma análise multivariada, os espectros resultantes podem ser empregados para verificar a integridade dos tecidos após a coleta de uma biópsia ou para comprovar a esterilidade de células isoladas.Além disso, esta técnica permite a caracterização e identificação de diferentes tipos celulares in vitro. Em última análise, a espectroscopia ramam é uma técnica baseada em laser promissora para aplicações em engenharia de tecidos e clínicas. Através de uma análise sem contato e livre de marcadores, o procedimento será demonstrado por Daniel Cabal Barrio, um técnico, e Miriam Tala, uma estudante de doutorado do meu laboratório. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos rotineiros existentes, como histologia e imagem de imunofluorescência, é que não é necessário nenhum processamento da amostra.Embora este método possa fornecer informações sobre o estado de células individuais e componentes da matriz, ele também pode ser aplicado a tecidos e órgãos multicelulares. Para preparar espectros Raman personalizados, utiliza-se um microscópio de fluorescência padrão acoplado a um espectrômetro Raman, o que permite a comparação direta de imagens de fluorescência com espectros Raman. A configuração básica consiste em um laser de diodo de 784 nanômetros, um filtro rejeita-faixa para separar a luz dispersa Raman da luz de excitação, um microscópio e um espectrógrafo com um dispositivo acoplado por carga otimizado para a detecção de informações espectrais.Para controlar a função do laser, inicie o software e ou solace e ajuste a temperatura da câmera CCD para menos 60 graus Celsius para minimizar o ruído causado por correntes termicamente induzidas na câmera. Coloque uma lâmina de silício na platina do microscópio para o procedimento de calibração. Ligue o laser e ajuste a potência para 85 miliwatts.Use a célula de software B para focar o laser sobre a pastilha até que XY apareça. Meça a pastilha de silício com um único tempo de integração de um segundo. Usando um objetivo a ar de 60 X, altere a unidade do eixo X do número de pixel para ramen.O ajuste no software And or Soli varia o foco do laser do pico de silício no número de onda 520 no espectro coletado. Para encontrar a intensidade máxima possível para esta banda Raman, a quantidade mínima de contagens deve ser superior a 11.000 para que a calibração seja bem-sucedida antes da medição espectral; prepare as amostras biológicas conforme indicado no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, todas as medições são realizadas à temperatura ambiente.Usando um objetivo de imersão em água de 60x com uma abertura numérica de 1,2, os espectros devem ser coletados com 10 integrações por 10 segundos, totalizando 100 segundos por medição. Para realizar a medição de células aderentes, coloque uma placa com fundo de vidro contendo as células sobre a platina do microscópio. Para obter um sinal melhor e garantir reprodutibilidade, foque o laser no núcleo celular, desligue a luz do microscópio e inicie a coleta do espectro.Meça um espectro de referência do fundo a cada 10 espectros movendo o foco do laser para fora da célula. É importante considerar que, ao mudar o foco, um novo fundo deve ser coletado para cada profundidade de foco. Alternativamente, para medir células em suspensão, transfira 100 microlitros da suspensão celular para um recipiente de vidro com fundo de vidro.Após colocar na platina do microscópio, foque o laser no centro da célula, desligue a luz do microscópio e comece a coletar o espectro novamente. Meça um espectro de referência do fundo a cada 10 espectros movendo o foco do laser ao lado da célula. Para medir os espectros de tecidos nativos, coloque a amostra em uma placa com fundo de vidro.A região de interesse deve ser orientada de forma a ficar voltada para o fundo da placa. Preencha a placa com PBS suficiente para cobrir a amostra. Coloque um lamínula sobre a amostra para evitar qualquer movimento da mesma.Durante as medições, posicione o foco do laser na estrutura de interesse e inicie a coleta dos espectros. Colete um espectro de referência do fundo a cada 10 espectros, movendo o foco do laser para fora de toda a área do tecido, coletando sempre um novo fundo para cada profundidade de foco na medição espectral de cortes criogênicos marcados por imunofluorescência. Seccione amostras frescas de tecido congelado rapidamente.Usando um criostato padrão, monte-os em lamínulas revestidas com sílica. Realize a coloração das seções criostáticas seguindo um protocolo rotineiro de imunofluorescência, empregando apenas uma etapa breve de fixação e utilizando anticorpos apropriados para a detecção da proteína de interesse. Realize as medições de Raman na região onde ocorre a fluorescência.Para demonstrar experimentos de degradação da elastina, os ventriculos das cúspides valvares aórticas suínas dissecadas são posicionados voltados para o fundo do vidro. Prato inferior. Meça o tecido nativo como controle não incubado em 30 pontos aleatórios ao longo de toda a superfície do tecido.Concentrando-se nas estruturas fibrilares, divida a amostra em duas seções e coloque-as em tubos eppendorf separados de 2,5 mililitros contendo dois mililitros de uma solução de elastase. Incube o tecido por 15 ou 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova os tecidos do tubo eppendorf e lave cuidadosamente com PBS para interromper completamente a reação enzimática.Meça cada amostra em 30 pontos aleatórios, focando nas estruturas fibrilares. O processamento dos espectros Raman começa com o pré-tratamento dos espectros gerados utilizando o software Opus. Primeiro, subtraia o espectro de fundo correspondente dos espectros coletados para reduzir sinais interferentes provenientes do vidro e do meio, bem como para evitar variações causadas por mudanças no foco.Durante as medições, reduza os espectros à região do número de onda entre 401 e 800, que oferece a maior quantidade de informações, se necessário. Normalize os espectros pela normalização do pico máximo, o que elimina as flutuações de intensidade em falhas sistemáticas, simplificando a detecção de mudanças estruturais nos espectros da amostra. Realize uma correção de linha de base para aumentar a comparabilidade entre diferentes experimentos.Analise os espectros Raman utilizando análise de componentes principais ou PCA com o software Unscrambler. Essa análise multivariada detecta diferenças e semelhanças dentro dos conjuntos de dados espectrais. Cada espectro é representado como um único ponto em um espaço multidimensional com base nas contagens coletadas para cada deslocamento Raman.Cada componente principal, abreviado como CP, descreve uma certa quantidade da informação total contida nos dados originais. O primeiro CP é aquele que contém a maior fonte de variação. Cada CP subsequente contém, em ordem, menos informação que o anterior. Cada variável possui um escore e uma carga em cada PC. Ao representar graficamente os PCs, podem ser reveladas correlações importantes entre as amostras. As cargas descrevem a contribuição de cada variável analisada na ACP. Rotule cada grupo de medições criando intervalos de linhas para cada grupo de amostras; utilize as seguintes configurações básicas para a validação cruzada da ACP: algoritmo Nip Al, sem rotação, e inicie a análise.Essas configurações dependem dos espectros. Por fim, realize a ACP em espectros ramânicos brutos gerados a partir de células aderentes, que frequentemente revelam uma baixa relação sinal-ruído e uma baixa intensidade de sinal geral. O foco do laser deve ser ajustado próximo ao fundo de vidro, o que mascara o sinal real da amostra.Consequentemente, o sinal da amostra pode ser minimizado ou até eliminado durante uma subtração subsequente de fundo. Por outro lado, as células em suspensão permitem a detecção de informações espectrais mais detalhadas. No entanto, os espectros de células aderentes e em suspensão exibem os mesmos picos principais, diferindo apenas em suas intensidades, entidades para a caracterização de diferentes tipos celulares dentro de uma suspensão, não sendo necessário nenhum pré-tratamento.Os espectros Raman médios e os desvios padrão de fibroblastos humanos, células-tronco mesenquimais, condrocitos e queratinócitos medidos em suspensão são mostrados aqui. Todos os espectros Raman apresentam estrutura semelhante, com picos originados de biomoléculas típicas, como proteínas, ácidos nucleicos e lipídios. Para esses tipos celulares, a região espectral entre os números de onda 601 e 800 contém as informações espectrais mais relevantes, pelas quais diferenças claras podem ser detectadas entre os diferentes tipos celulares.Uma região espectral exemplar exibe diferenças estruturais claras, que podem ser atribuídas a vibrações moleculares do colágeno e dos lipídios. Em contraste, as análises morfológicas não são adequadas para a identificação e distinção da maioria das células. Embora a diferença entre condrócitos e células da pele seja observável, é difícil separar fibroblastos e células-tronco mesenquimais.Utilizando exclusivamente microscopia de campo claro para a atribuição de tecido nativo a um espectro de impressão digital específico, foram gerados espectros de Raman de proteínas puras comercialmente disponíveis e de cortes criostáticos imuno-histoquimicamente corados. Aqui, espectros de impressão digital de fibras elásticas foram identificados em tecidos nativos mediante comparação com amostras liofilizadas de elastina e cortes criostáticos imunofluorescentemente marcados, utilizando um anticorpo contra elastina. No entanto, como a elastina apresenta alta autofluorescência, a qual se reflete nos espectros de Raman, a análise dos dados é desafiadora, sendo crucial reduzir falhas sistemáticas decorrentes de propriedades específicas da amostra, como a autofluorescência, e realizar um processamento adequado dos conjuntos de dados.No análise dos dados, foi utilizada normalização para eliminar a intensidade de sinal significativamente mais alta da proteína de elastina pura, resultando em espectros de Raman comparáveis. A elastina é uma das proteínas da matriz extracelular mais estáveis do corpo e, por isso, é muito difícil de degradar. Aqui.A degradação da elastina foi induzida em folhetos valvares aórticos suínos saudáveis mediante digestão enzimática, e, aplicando-se análise multivariada (PCA), identificaram-se diferenças significativas entre os espectros Raman de amostras tratadas enzimaticamente e controles nativos. Essas diferenças espectrais foram observadas no espectro de carregamento nos números de onda 861, 1003 e 1.664. As alterações estruturais esperadas nas fibras contendo elastina, decorrentes de tempos prolongados de exposição à elastase, refletiram-se em agrupamentos de escores mais distintamente separáveis. Os agrupamentos mostrados aqui correspondem aos escores da comparação entre o controle não tratado e as fibras elásticas degradadas enzimaticamente no tecido nativo. Essas alterações estruturais esperadas também são evidentes nos folhetos valvares aórticos suínos corados do coração, conforme visualizado neste detalhe ao comparar o controle não tratado com as amostras de tecido expostas à enzima elastina-integradora elastase por 30 minutos.Essa técnica abre caminho para pesquisadores nas áreas de biologia celular e matricial, bem como na medicina regenerativa e engenharia de tecidos, a realizarem não apenas análise em tempo real do fenótipo celular, mas também a identificarem interações cruciais entre célula-célula e célula-matriz em Z dois dentro de um ambiente nativo.

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