Estabelecimento de Culturas Microbianas enriquecimento eucarióticas a partir de um quimicamente estratificada Antarctic Lake e Avaliação do Potencial de Fixação de Carbono

O objetivo geral deste procedimento é produzir culturas enriquecidas com protistas a partir do Lago Bonnie antártico e medir a fixação de carbono como parte de um indicador inicial da diversidade metabólica. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de água do lago em profundidades do Lago Bonnie que correspondem a picos conhecidos de protistas e fitoplâncton. As amostras de água do lago são então inoculadas em diversos meios de crescimento e incubadas em uma câmara de crescimento equipada com regulador de temperatura e luzes por quatro a seis semanas.

Os cultivos podem ser transportados conforme necessário a quatro graus Celsius. O próximo passo é extrair lisados celulares brutos dos cultivos de enriquecimento. O passo final deste procedimento é avaliar o potencial de fixação de carbono no lisado celular utilizando um ensaio com radioisótopo para a ribulose um cinco-bisfosfato, carboxilase, oxigenase, ou atividade RubisCo.

No fim das contas, os cultivos de enriquecimento de pro mostram uma variação no potencial de fixação de carbono na comunidade natural de protistas. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a ecologia microbiana de lagos, por exemplo, o papel dos eucariotos microbianos no ciclo do carbono em várias etapas em lagos antárticos estratificados.

Embora a coleta de amostras na coluna de água para gerações subsequentes de culturas de enriquecimento seja uma técnica frequentemente utilizada, este método contém modificações para operar em um ambiente extremamente frio, onde podem ocorrer complicações imprevistas. Tive esta ideia pela primeira vez ao pensar em formas de testar o ensaio Redisco em amostras naturais de lago. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de coleta são difíceis de imaginar, já que os locais de amostragem estão em um ambiente estranho para muitos pesquisadores.

As amostras são coletadas do Lago Bonnie, um dos inúmeros lagos permanentemente cobertos de gelo localizados nos vales secos de McMurdo na Antártida, um dia antes da coleta na coluna d'água. Escolha e prepare o local de amostragem. Isso permitirá que as camadas estratificadas da coluna d'água se reorganizem após a perturbação causada pela perfuração e pelo derretimento do buraco no gelo. Identifique a localização do local de perfuração por GPS para acessar a coluna d'água.

Comece perfurando um buraco no gelo com um aguçador Jiffy acoplado a uma extensão de hélice de quatro polegadas e uma broca cortante para evitar o congelamento da broca no orifício. Tente evitar perfurar até a água líquida, interrompendo a perfuração aproximadamente quatro a seis polegadas acima do topo da coluna de água. O orifício da perfuração deve ser alargado de um diâmetro de seis polegadas para dois pés para coleta de amostras.

Isso é realizado por meio de um derretedor de furos modelo mar quente que circula polietileno glicol aquecido através de um furo em tubo de cobre. A fusão geralmente leva até 18 horas no dia anterior à coleta da coluna de água. Certifique-se de que todos os equipamentos necessários e recipientes de armazenamento de amostras estejam montados no local de coleta.

Os materiais para amostragem incluem uma garrafa NICU com capacidade de cinco a dez litros, um guincho com cabo calibrado em profundidade, frascos amostrais suficientes para cada profundidade de coleta, um mensageiro e caixas térmicas para o transporte das amostras. Inicie a amostragem cedo no dia, por volta das 5:00 da manhã, pois a filtração da água do lago deve ser concluída no mesmo dia da coleta. Utilize um amostrador tipo kin conectado a um guincho manual calibrado.

Colete amostras de água de um a cinco litros das profundidades desejadas para este estudo. As profundidades de amostragem são seis metros, 15 metros e 18 metros medidas a partir do nível de água simétrico do PI no furo no gelo. Armazene as amostras do lago em isopores e transporte-as do local de coleta até o laboratório de campo.

Usando um trenó acoplado a um A TV, as amostras devem ser processadas ou estabilizadas no laboratório de campo. Imediatamente após a coleta, o cultivo de culturas de enriquecimento deve ser iniciado assim que as amostras forem transportadas para o laboratório de campo. Concentre 0,5 a um litro de água do lago em membranas de 47 milímetros com porosidade de 0,45 mícron.

Filtre suavemente usando filtros de sulfona de poliéter. Se deseja-se a diversidade da comunidade natural, filtre uma segunda amostra em membranas de 47 milímetros e 0,45 mícron de tamanho de poro.

Os filtros de sulfona de poliéter são congelados rapidamente em nitrogênio líquido. Transfira cada filtro para um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo cerca de 20 mililitros de água de lago filtrada, coletada na mesma profundidade de amostragem do filtro.

Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura celular estéril de 25 centímetros quadrados para enriquecimentos em diferentes meios de cultura. Prepare múltiplas réplicas para cada profundidade de amostragem. Adicione a cada frasco de cultura 50 x soluções estéreis dos seguintes meios de cultura: bold basil, meio BG 11 e F dois.

Se o cultivo de organismos mixotróficos for necessário, prepare dois frascos F2 suplementados e adicione dois a três grãos de arroz estéril a um dos frascos de cultura, incubando em temperatura baixa e baixa radiação em um incubador de crescimento com temperatura controlada por pelo menos quatro semanas antes do envio ao laboratório dos EUA. Transfira as culturas de enriquecimento para tubos estéreis Falcon de 50 mililitros. Solicite no formulário de envio que os materiais não sejam congelados e devem ser mantidos frios. Após a chegada aos EUA, transfira cinco mililitros de cada cultura de enriquecimento para 45 mililitros de meio de crescimento apropriado em um frasco de 125 mililitros.

Erlenmeyer estéril tampado com uma esponja estéril. Manter as culturas de enriquecimento como culturas estáticas em câmara de crescimento ambiental com controle de temperatura a quatro graus Celsius e menor radiação, transferindo as culturas para meio fresco a cada 30 dias. Para iniciar o procedimento de extração do lisado celular, filtre cinco litros de cultura de enriquecimento em um filtro GFF Watman de 25 milímetros utilizando vácuo suave.

Em seguida, corte o filtro em quatro a cinco seções com tesoura de aço estéril. Depois, use pinça estéril para transferir os pedaços para um tubo com tampa de rosca de dois mililitros cheio até um quinto da capacidade com diâmetro de 0,1 milímetro.

Esferas de sílica de zircônia. Adicione 1,25 mililitros de tampão de extração por filtração ao tubo e, em seguida, rompa as células usando um agitador de esferas miniatura por 30 segundos em uma velocidade de 48 e, depois, resfrie no gelo por um minuto. Repita a agitação com esferas por mais duas vezes, com incubações no gelo de um minuto entre cada agitação, para evitar o aquecimento da amostra durante a centrifugação.

Filtre a suspensão por dois minutos a 3000 vezes G a quatro graus Celsius. Para formar um coágulo solto de fibras do filtro GFF e resíduos da parede celular. Remova uma alíquota de 200 microlitros do sobrenadante e imerja em 800 microlitros de acetona a 90%, gelada.

Transfira o sobrenadante remanescente para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Meça a clorofila A extraível em um espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 664 nanômetros e 647 nanômetros após centrifugar. O sobrenadante SUP remanescente por dois minutos a 15.000 ×g a quatro graus Celsius.

Transfira o S para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, evitando o pellet de membranas celulares insolúveis e as fibras remanescentes do filtro GFF. Este lisado celular solúvel pode agora ser usado no ensaio de atividade da rubisco carboxilase, que será demonstrado a seguir. Para iniciar este ensaio, transfira 125 microlitros de cada lisado solúvel para um tubo de microcentrífuga com tampa rosqueável de 1,5 mililitro previamente resfriado em gelo.

Para amostras de controle negativo, adicione 125 microlitros de lisado solúvel a um tubo de microcentrífuga com tampa rosqueável de 1,5 mililitro, mas não adicione o substrato. Posteriormente, realize reações em duplicata para todas as amostras e controles negativos. Prepare 10 mililitros de tampão de ensaio, fresco e resfriado em gelo.

Coloque quantidade suficiente do tampão do ensaio para todas as amostras e controles negativos em um tubo de cinco mililitros. A partir daqui, todos os passos devem ser realizados sob capela. Adicione bicarbonato de sódio marcado com C 14 ao tampão alocado e mantenha o tampão em gelo.

Remova 10 microlitros do tampão de ensaio contendo C 14 e dilua em um mililitro do tampão de ensaio invertido. Para homogeneizar, adicione 100 microlitros da mistura diluída a três mililitros do coquetel de contagem cintiladora Bios Safe Two em um frasco de cintilação e inverta para misturar. Meça as contagens de C 14 com um contador Beckman LS 6,500; as contagens cintiladoras devem ser superiores a 18.000 contagens por minuto antes de prosseguir com o ensaio.

Quando uma quantidade suficiente de bicarbonato de sódio marcado com C 14 tiver sido adicionada ao tampão do ensaio, transfira os tubos de reação para um banho seco pré-ajustado a 25 graus Celsius e incube por três a cinco minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão do ensaio aos lisados e incube a 25 graus Celsius por cinco minutos. Após cinco minutos, adicione ribulose bisfosfato a cada amostra e deixe a reação prosseguir por cinco a 10 minutos a 25 graus Celsius.

Para interromper a reação, adicione 100 microlitros de ácido probiótico a 100% e centrifugue por uma hora a 2000 vezes G para remover o C 14 não incorporado. Por fim, transfira o volume total das amostras para frascos de cintilação contendo três mililitros de bios. Adicione dois mililitros de coquetel de contagem para cintilação e determine as contagens por minuto da fração estável ao ácido.

Produtos finais por contagem de cintilação. O cultivo de enriquecimento foi utilizado para isolar novos protistas fototróficos e mixotróficos adaptados ao frio do Lago Bonnie antártico em três profundidades. Vários tipos de meios de crescimento foram usados para selecionar uma maior diversidade de organismos, meios boldo, meio basílico ou BBMF dois si, meio marinho e meio BG 11.

A concentração de nutrientes e a radiação fotossinteticamente ativa ou PAR mostradas nesta tabela representam as condições no momento da coleta das amostras. A inspeção visual das culturas enriquecidas por microscopia de luz revelou que as culturas eram dominadas por protozoários fototróficos, indicado pela presença de pigmento clorofiliano na maioria das células. As culturas também abrigavam uma variedade de morfologias celulares, dependendo da profundidade de amostragem da qual o inóculo foi obtido e do tipo de meio utilizado na cultura.

As taxas máximas de atividade da carboxilase catalisada pela enzima rubis foram medidas nas culturas enriquecidas como um indicador da fixação de carbono. A abundância potencial de clorofila A também foi monitorada como uma estimativa da biomassa de protistas fototróficos, conforme mostrado aqui.

Apesar do cultivo de todas as culturas sob a mesma temperatura, o regime de luz, o potencial de fixação de carbono e a biomassa fototrófica variam drasticamente entre as culturas de enriquecimento. A atividade máxima de rubisCO foi observada nas culturas de enriquecimento quatro e seis crescendo em meio BBM e nas culturas de enriquecimento 13 e 14 crescendo em meio BG-11. Em contraste, as culturas 19, 21 e 23 enriquecidas em meio de crescimento F/2 exibiram atividades máximas de carboxilase que foram de quatro a 34 vezes menores.

Essas diferenças não foram devidas a níveis mais baixos de biomassa nos cultivos F dois, pois a atividade da carboxilase foi expressa com base na clorofila a. Além disso, uma análise de correlação de Pearson revelou que a atividade da rubisco não se correlacionou com a concentração de clorofila a. Os cultivos de BBM foram inoculados com água do lago de seis metros e 15 metros.

O fórum cinco do enriquecimento apresentou os níveis mais altos de clorofila A, enquanto todas as outras culturas exibiram clorofila a relativamente baixa, independentemente da atividade da enzima rubis. Uma vez dominadas, as técnicas de coleta em lagos levam cerca de duas horas para serem realizadas. Dependendo do número de amostras coletadas, o ensaio de carboxilase também leva cerca de duas horas quando realizado corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como o ensaio de atividade enzimática heterotrófica, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como em qual profundidade o heterótrofo ocorre. Ok, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como coletar amostras de lago, enriquecê-las para produção e realizar o ensaio de atividade da carboxilase rubis.