A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Olá e bem-vindo ao Grupo de Biologia Estrutural e Funcional da Membrana. Meu nome é Martin Caffery. Este é mais um de uma série de JO de artigos sobre a cristalização de proteínas de membrana para determinação estruturada usando o método de fase cúbica em meso ou lipico.

No primeiro artigo, JoVE 1 7 1 2, demonstramos como a fase cúbica carregada de proteínas é preparada e como a fase misa viscosa e pegajosa é dispensada manualmente em placas sanduíche de vidro para testes de cristalização. Este artigo em vídeo descreverá métodos para usar um robô de cristalização em meso. Um robô oferece as vantagens de velocidade, precisão, miniaturização de precisão e capacidade de trabalhar por longos períodos em condições desconfortáveis, como no escuro ou em baixas temperaturas.

Os robôs, quando usados corretamente, podem melhorar muito a produtividade da estrutura da proteína da membrana e a pesquisa de função. Neste artigo em vídeo, demonstramos o uso de três robôs disponíveis comercialmente. O primeiro robô foi desenvolvido no grupo de biologia estrutural e funcional da membrana e é descrito em detalhes na referência um.

Os outros dois foram disponibilizados recentemente e estão incluídos aqui para fins de completude. A preparação da placa de cristalização para fazer um teste de cristalização roboticamente começa com a preparação da placa de base da placa de cristalização sanduíche de vidro descrita em detalhes em referência à placa de base deve primeiro ser siloizada e o espaçador de vara dupla perfurado que cria os poços deve ser aplicado à placa. Os materiais necessários para isso são mostrados aqui.

Eles incluem uma placa de base de cristalização de vidro, uma solução espaçadora de dupla haste perfurada, um rolo ou lenços de papel brayer e um copo de água UE. O prato é colocado sobre uma toalha de papel em uma bancada. Algumas gotas de solução silenciosa são aplicadas e, em seguida, distribuídas uniformemente sobre a superfície da placa com um lenço de papel.

A placa é lavada do excesso de solução por imersão total num copo de água. O prato é removido do copo colocado sobre uma toalha de papel seca. Com o lado siloizado para cima e sua superfície exposta é seca limpando levemente com toalhas de papel.

Em seguida, a tampa protetora do espaçador de dupla face perfurado é removida e o espaçador é aplicado na superfície siloizada da placa de vidro. É importante que o espaçador esteja posicionado corretamente na placa de base com o canto superior esquerdo e os dois lados adjacentes do espaçador e da placa coincidentes. Um rolo ou brayer é usado para achatar o espaçador na placa de base e criar uma vedação firme entre eles.

Entre parênteses, notamos que placas siloizadas completas com espaçadores perfurados estão disponíveis comercialmente, conforme descrito na seção de referência. Depois de preparar a placa de base de cristalização, passamos a configurar e usar o robô in meso. Conforme observado a seguir, demonstramos o uso de três em meso robôs.

Em todos os casos mostrados, os robôs são configurados e usados em uma sala com temperatura controlada definida em 20 graus Celsius no meso robô um, o primeiro no meso robô a ser demonstrado neste vídeo. O artigo foi desenvolvido no laboratório do PI e agora está disponível comercialmente. Detalhes completos podem ser encontrados na seção de referência.

Os materiais e equipamentos necessários para configurar um teste de cristalização roboticamente são mostrados aqui. Incluem um caderno de laboratório, mease carregado de proteínas, recém-preparado conforme descrito no artigo 1 7 1 2 e alojado em uma seringa Hamilton. Placas de base siloizadas com espaçadores e vidro de cobertura correspondente, garrafa de água e lenços de papel, e o robô de missô.

A primeira visão é do robô com o convés limpo. A próxima vista é do robô completo com estação de parque umidificador, placa de base de cristalização e bloco de poço profundo contendo soluções precipitantes. Começamos a configuração colocando a placa de base no convés do robô.

Possui plataforma própria, claramente marcada com posições de poços para fins de alinhamento da placa de base. A placa deve ser claramente rotulada para fins de identificação. O bloco de 96 poços contendo soluções precipitantes é fixado em sua própria plataforma no convés do robô próximo à placa de cristalização.

O bloco é aberto retirando cuidadosamente a tampa plástica do teto. O fluxo de umidade do umidificador é direcionado para fluir sobre e através da placa de base no convés do robô Configurando o robô. O robô é inicializado seguindo as instruções do fabricante.

Não demonstraremos isso em detalhes aqui porque os protocolos exatos mudarão com o tempo. Essencialmente, o que acontece durante a inicialização é que o braço dispensador de mease no robô é fornecido com posições de referência em três direções ortogonais, x, Y e Z.Em seguida, a fase meza carregada de proteínas em uma seringa Hamilton completa com agulha dispensadora é anexada ao braço um dos detalhes completos do robô de como preparar a fase meza e a seringa são descritos em Jo do Artigo 1 7 1 2 e na referência um, A ponta da agulha da seringa dispensadora deve agora estar alinhada com a parte inferior e o centro do poço superior no canto esquerdo da placa de cristalização. Isso corresponde ao identificador de poço A alinhado com a parte inferior do poço A como a primeira ordem do dia.

Isso é feito ajustando a altura ou a coordenada Z após o braço de distribuição enquanto observo o quão perto a ponta da agulha chega ao fundo do poço. Que a ponta está apenas tocando o fundo do poço pode ser julgado movendo a placa manualmente de um lado para o outro na plataforma enquanto ajusta levemente a altura do braço de distribuição, a coordenada Z do braço de distribuição onde a ponta entra em contato com a placa é inserida na distribuição do computador é programada para ocorrer com a ponta da agulha a vários micrômetros desta posição Z de referência, que corresponde à superfície da placa de base. Em seguida, o robô é ativado para passar por uma série de etapas solicitadas pelo usuário para posicionar a ponta da agulha no centro do poço A.

A coordenada XY de referência do braço de distribuição onde a ponta está centralizada é armazenada no computador que controla o robô. É usado para definir o centro dos poços restantes na placa. Depois de definir essas coordenadas de referência no computador, o braço dispensador de mease é instruído a retornar à sua posição inicial, preparando a seringa.

A seringa dispensadora deve agora ser preparada. Isso é feito para garantir que a mease fresca encha a agulha dispensadora e que o primeiro poço na placa receba seu complemento total de mease. Há um comando de priming no programa que executa a ativação do robô.

Isso faz com que o êmbolo na seringa avance passo a passo sob o controle do usuário. Enquanto isso acontece, a ponta da agulha é examinada para verificar se a fase meza extrudada é removida com um lenço de papel. Isso conclui o processo de escorva executando o robô.

O robô agora está pronto para funcionar no modo automático iniciando a corrida. O programa Robot XAP inicia uma rodada de etapas de lavagem onde as pontas de distribuição de precipitante no braço dois do robô são lavadas e preparadas para aspirar soluções precipitantes do bloco de poço profundo, ativando a função de distribuição no robô em movimento, o carregamento sequencial de poços com mease carregado de proteínas primeiros oito poços de cada vez, seguido por soluções precipitantes Entre entregas. O braço dispensador de mease retorna a uma posição de estacionamento onde a extremidade da agulha é colocada em uma esponja umedecida para evitar que o mease na ponta seque.

Mais comumente, os valores usados em testes de cristalização realizados na membrana. O grupo de biologia estrutural e funcional é de 50 nanolitros de mease e 800 nanolitros de solução precipitante. O programa que executa o robô nesta demonstração foi configurado para que os dois braços se movam simultaneamente.

Desta forma, é possível completar o carregamento de uma placa de 96 poços com mease e precipitante em cinco minutos. Imediatamente a placa é preenchida e os braços do robô retornam às suas posições de estacionamento. A placa é removida do convés do robô e colocada em uma superfície plana e sólida.

Uma lamínula é colocada suavemente no topo da placa de base em contato com a superfície adesiva superior do espaçador. É importante garantir que todos os 96 poços estejam totalmente cobertos, que a lamínula esteja alinhada com a placa de base e que nenhuma das lamínulas se estenda além da área ocupada pela placa de base. Um rolo ou brayer é usado para criar uma vedação firme e uniforme entre a lamínula e o espaçador.

A placa deve ser inspecionada nesta fase para ter certeza de que a configuração correu como deveria. O que se procura é um ovo frito na aparência de uma frigideira. Em cada poço, a gema do ovo corresponde à fase meza.

A clara do ovo é a solução precipitante e a borda da panela é o perímetro da cristalização. Bem, idealmente, os três são concêntricos. A placa agora está pronta para ser colocada em uma área de armazenamento com temperatura controlada para o crescimento de cristais.

Se não for necessário instalar mais placas, o bloco de precipitante deve ser removido do convés do robô, devidamente selado e colocado de volta no armazenamento. A seringa contendo o mease é removida do braço dispensador do robô, desmontada em suas várias partes, incluindo agulha dispensadora e ferial. Lavado cuidadosamente com metanol e seco em preparação para o próximo uso no robô Meso dois mosquitos LCP.

Este próximo videoclipe mostra o robô LCP do mosquito que pode ser usado na configuração de testes de mesocristalização. Ele incorpora um sistema de distribuição de fase meph semelhante ao descrito anteriormente neste artigo. Para o robô um, no entanto, o precipitante é dispensado usando pontas descartáveis.

O instrumento em si é mostrado aqui. Inclui um convés sobre o qual a placa de cristalização e o bloco de precipitante estabelecem uma câmara com janelas para controle de umidade. Nesta vista, as janelas da câmara de umidade foram abertas, um carretel com pontas de distribuição, um braço de distribuição de mease, um sensor baseado em laser para estabelecer a localização da agulha de distribuição da fase meph.

Uma plataforma elevada sobre a qual a placa de cristalização assenta uma plataforma afundada para segurar o bloco de tela do precipitante. Nesta sequência, o robô viu passar por uma sequência de inicialização de ações quando o instrumento é ligado. O software de programação é usado para configurar o instrumento para trabalhar com placas de cristalização e blocos de precipitante específicos e para dispensar volumes definidos de mease e precipitante em uma sequência especificada.

Esses detalhes são fornecidos pelo fabricante e não serão mostrados aqui. O uso do robô para configurar uma placa de cristalização começa da seguinte forma: Uma seringa Hamilton completa com agulha e preenchida com mease carregada de proteína é preparada conforme descrito acima em meso robô um e em Jo de 1 7 1 2. A seringa é presa na posição sob o braço dispensador do robô.

As coordenadas X e y da agulha na seringa dispensadora são estabelecidas usando o sensor laser montado no convés. Esta é uma etapa importante necessária para garantir que a mease seja dispensada com precisão no centro de cada poço na placa de cristalização. Com o toque de um botão no painel de controle, a seringa é preparada para expelir o mease da ponta da agulha.

A mease extrudada é então removida com um lenço de papel em preparação para usar o robô para carregar poços antes de montar a placa de cristalização no convés do robô. A superfície da plataforma é umedecida com algumas gotas de água para manter a placa no lugar. Por capilar, a capa protetora é removida da placa e a placa é colocada firmemente em sua plataforma para garantir uma boa aderência.

Existem três fiduciais na plataforma sobre os quais os três poços de canto são centralizados em breve para garantir o posicionamento adequado da placa em relação à ponta da agulha dispensadora, o instrumento agora está pronto para entrar em um ciclo de configuração. Isso começa com uma segunda etapa de preparação, onde Mease é dispensado em um pequeno prato de vidro imediatamente antes de passar para carregar o prato com mease fresco. Nesta sequência, vemos o robô primeiro carregando com mease, uma coluna vertical de oito poços na placa e, em seguida, usando as pontas descartáveis para dispensar a solução precipitante em cima do bolo de mease.

Este processo é repetido 11 vezes ao longo do comprimento da placa até que todos os poços estejam cheios. Todo o processo leva cerca de cinco minutos para ser concluído. Neste vídeo em particular, 50 nanolitros de Mease e 800 nanolitros de solução precipitante foram dispensados em cada poço.

A placa cheia é removida da plataforma do robô colocada em uma bancada. A lamínula é aplicada e a placa é selada com um sutiã conforme descrito acima no robô de missô um. A placa devidamente rotulada agora pode ser colocada em um ambiente com temperatura controlada para o crescimento de cristais no robô Meso três, o Griffin LCP.

Este videoclipe final mostra o robô Griffin LCP em uso em testes de mesocristalização. O Griffin incorpora um sistema de distribuição de fase meph semelhante ao descrito acima para o robô um. Neste caso, no entanto, todas as 96 soluções precipitantes são dispensadas simultaneamente.

O instrumento em si é mostrado aqui. Inclui um convés no qual ficam a placa de cristalização e o bloco de precipitante, um braço dispensador de mease e uma cabeça de ponta Phoenix 96. Para a distribuição de soluções precipitantes, o robô em ação é mostrado nesta sequência de vídeo final.

A cabeça de 96 pontas é primeiro carregada com solução precipitante. Um atraso definido pelo usuário é fornecido para facilitar a aspiração de precipitantes viscosos. A fase MEA é dispensada sequencialmente nos 96 poços em um processo que leva cerca de um minuto para ser concluído.

Por fim, a cabeça de 96 pontas dispensa todas as 96 soluções precipitantes simultaneamente sobre os bolus da fase MEA nos poços de cristalização. Todo o processo de carregamento da chapa é concluído em dois minutos. A placa cheia é removida do convés do robô e a placa é selada com uma lamínula e armazenada em condições controladas de temperatura para o crescimento do cristal.

Os próximos passos no processo geral de determinação estruturada por cristalografia macromolecular são colher e resfriar os cristais e registrar e processar a difração de raios-x a partir deles. Esses tópicos são abordados em artigos de trabalho separados nesta série.