A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Olá e bem-vindo ao Grupo de Biologia Estrutural e Funcional de Membranas. Meu nome é Martin Caffery. Este é mais um artigo de uma série da JO sobre a cristalização de proteínas de membrana para determinação estrutural utilizando o método in meso ou da fase cúbica lipídica.

No primeiro artigo, JoVE 1 7 1 2, demonstramos como preparar a fase cúbica carregada com proteína e como dispensar manualmente a fase viscosa e adesiva de misa em placas de vidro tipo sanduíche para ensaios de cristalização. Este artigo em vídeo descreverá métodos para utilizar um robô de cristalização in meso. Um robô oferece as vantagens de velocidade, exatidão, precisão, miniaturização e capacidade de operar por períodos prolongados em condições desfavoráveis, como no escuro ou em baixas temperaturas.

Robôs, quando usados corretamente, podem melhorar significativamente a produtividade na pesquisa de estrutura e função de proteínas de membrana. Neste artigo em vídeo, demonstramos o uso de três robôs comercialmente disponíveis. O primeiro robô foi desenvolvido no grupo de biologia estrutural e funcional de membranas e é descrito em detalhes na referência um.

Os outros dois só recentemente se tornaram disponíveis e estão incluídos aqui para completude. Preparar a placa de cristalização para realizar um ensaio de cristalização roboticamente começa com a preparação da placa-base do dispositivo de cristalização em sanduíche de vidro descrito em detalhes; em referência à placa-base, esta deve primeiro ser silanizada e o espaçador perfurado adesivo duplo que cria os poços deve ser aplicado à placa. Os materiais necessários para isso são mostrados aqui.

Eles incluem uma placa de base de cristalização de vidro, um espaçador perfurado com duplo adesivo, papel-toalha ou rolo, e um béquer com água UE. A placa é colocada sobre uma toalha de papel em uma bancada. Algumas gotas da solução silenciosa são aplicadas e, em seguida, distribuídas uniformemente sobre a superfície da placa com um papel-toalha.

A placa é lavada para remover o excesso de solução silanizante mergulhando-a completamente em um béquer com água. A placa é retirada do béquer e colocada sobre uma toalha de papel seca, com o lado silanizado voltado para cima, e sua superfície exposta é seca com leves toques usando toalhas de papel.

Em seguida, a cobertura protetora do espaçador perfurado com adesivo dupla face é removida e o espaçador é aplicado à superfície silanizada da placa de vidro. É importante que o espaçador seja posicionado corretamente na placa de base, com o canto superior esquerdo e os dois lados adjacentes do espaçador e da placa coincidentes. Um rolo ou cilindro é usado para aplainar o espaçador sobre a placa de base e para criar um selamento firme entre eles.

Entre parênteses, observamos que placas com compartimentos separados, completas com espaçadores perfurados, estão disponíveis comercialmente, conforme descrito na seção de referências. Após preparar a placa-base de cristalização, passamos a montar e utilizar o robô in meso. Como mencionado a seguir, demonstramos o uso de três robôs in meso.

Em todos os casos apresentados, os robôs são configurados e utilizados em uma sala com temperatura controlada, ajustada em 20 graus Celsius, no meso robot um, o primeiro meso robot a ser demonstrado neste vídeo. O artigo foi desenvolvido no laboratório do pesquisador principal e está agora disponível comercialmente. Detalhes completos podem ser encontrados na seção de referências.

Os materiais e o equipamento necessários para montar um experimento de cristalização roboticamente são mostrados aqui. Eles incluem um caderno de laboratório, alíquotas de proteína recém-preparadas conforme descrito no JoVE Artigo 1 7 1 2 e acondicionadas em uma seringa Hamilton. Placas de base silanizadas com espaçadores e lamínulas correspondentes, garrafa de água e lenços de papel, e o robô in meso.

A primeira visão é do robô com sua plataforma limpa. A próxima visão é do robô completo, com estação de estacionamento do umidificador, placa-base de cristalização e bloco de poços profundos contendo soluções de precipitante. Iniciamos a configuração colocando a placa-base na plataforma do robô.

Ele possui sua própria plataforma, claramente marcada com posições de poços para fins de alinhamento da placa-base. A placa deve ser claramente rotulada para fins de identificação. O bloco de 96 poços contendo as soluções precipitantes é fixado em sua própria plataforma na bancada do robô, ao lado da placa de cristalização.

O bloco é aberto removendo cuidadosamente sua tampa plástica superior. O fluxo de umidade do umidificador é direcionado para passar sobre e através da placa de base no compartimento do robô, durante a configuração do robô. O robô é inicializado seguindo as instruções do fabricante.

Não demonstraremos isso em detalhes aqui, porque os protocolos exatos mudarão com o tempo. Essencialmente, o que ocorre durante a inicialização é que o braço dispensador de mease do robô recebe posições de referência em três direções ortogonais, x, Y e Z. Em seguida, a fase de meza contendo proteína em uma seringa Hamilton, completa com agulha dispensadora, é fixada ao braço um do robô. Os detalhes completos sobre como preparar a fase de meza e a seringa são descritos no Artigo 1 7 1 2 da JoVE e na referência um. A ponta da agulha da seringa dispensadora deve agora ser alinhada com o fundo e o centro do poço mais superior no canto esquerdo da placa de cristalização. Isso corresponde ao identificador do poço A um, alinhando-se com o fundo do poço A um como primeira etapa.

Isso é feito ajustando a altura ou a coordenada Z após o braço dispensador, observando-se quão próxima a ponta da agulha chega ao fundo do poço. Pode-se julgar se a ponta está apenas tocando o fundo do poço movendo-se manualmente a placa de um lado para o outro na plataforma, ao mesmo tempo em que se ajusta levemente a altura do braço dispensador; a coordenada Z do braço dispensador, na posição em que a ponta toca a placa, é inserida no computador. A dispensação é programada para ocorrer com a ponta da agulha situada a várias micrometros dessa posição Z de referência, a qual corresponde à superfície da placa-base. Em seguida, o robô é ativado para executar uma série de etapas acionadas pelo usuário, com o objetivo de posicionar a ponta da agulha no centro do poço A1.

A coordenada XY de referência do braço dispensador, na qual a ponta é centralizada, é armazenada no computador que controla o robô. Ela é usada para definir o centro das demais poças da placa. Após definir essas coordenadas de referência no computador, instrui-se o braço dispensador mease a retornar à sua posição inicial, preparando a seringa.

A seringa de dispensação deve agora ser escorvada. Isso é feito para garantir que o mease fresco preencha a agulha de dispensação e que o primeiro poço da placa receba sua quantidade completa de mease. Há um comando de escorvamento no programa que aciona o robô.

Isso faz com que o êmbolo na seringa avance de forma escalonada sob controle do usuário. Enquanto isso ocorre, a ponta da agulha é examinada para verificar se aparece mease extrudada; a fase meza é removida com um tecido. Isso conclui o processo de escorva do robô.

O robô está agora pronto para funcionar em modo automático, iniciando a execução. O programa XAP do robô inicia uma série de etapas de lavagem, nas quais as ponteiras de dispensação de precipitante no braço dois do robô são limpas e preparadas para aspirar soluções de precipitante do bloco de poços profundos. A ativação da função de dispensação no robô coloca em movimento o carregamento sequencial dos poços com mease contendo proteína, primeiro oito poços de cada vez, seguidos por soluções de precipitante entre as dispensações. O braço dispensador de mease retorna a uma posição de estacionamento, onde a extremidade da agulha é colocada em uma esponja umedecida para evitar que o mease na ponteira seque.

Normalmente, os valores utilizados nos ensaios de cristalização realizados no grupo de biologia estrutural e funcional são 50 nanolitros de mease e 800 nanolitros de solução precipitante. O programa que controla o robô nesta demonstração foi configurado de modo que os dois braços se movam simultaneamente.

Dessa forma, é possível concluir o carregamento de uma placa de 96 poços com a amostra e o precipitante em cinco minutos. Imediatamente após a placa ser preenchida, os braços robóticos retornam às suas posições de repouso. A placa é removida da base do robô e colocada sobre uma superfície plana e sólida.

Uma lamínula é colocada suavemente sobre a placa de base, em contato com a superfície adesiva superior do espaçador. É importante garantir que todos os 96 poços estejam completamente cobertos, que a lamínula esteja alinhada corretamente com a placa de base e que nenhuma parte da lamínula se estenda além da área da placa de base. Um rolo ou cilindro é usado para criar um selo firme e uniforme entre a lamínula e o espaçador.

A placa deve ser inspecionada nesta etapa para garantir que a montagem ocorreu conforme o esperado. O que se procura é uma aparência semelhante à de um ovo frito em uma frigideira. Em cada poço, a gema do ovo corresponde à fase meza.

A clara do ovo é a solução precipitante, e a borda da panela é o perímetro da cristalização. Bem, idealmente, os três são concêntricos. O prato agora está pronto para ser colocado em uma área de armazenamento com temperatura controlada para o crescimento do cristal.

Se não houver mais placas para serem montadas, o bloco de precipitante deve ser removido da plataforma do robô, devidamente selado e devolvido ao armazenamento. A seringa contendo o mease é removida do braço dispensador do robô, desmontada em suas várias partes, incluindo a agulha dispensadora e o ferial. Deve ser cuidadosamente lavada com metanol e seca, em preparação para o próximo uso no robô In Meso two mosquito LCP.

O próximo trecho de vídeo mostra o robô LCP de mosquito que pode ser usado no preparo de ensaios de cristalização em mesofase. Ele incorpora um sistema de dispensação de fase semelhante ao descrito anteriormente neste artigo. Para o robô um, no entanto, o precipitante é dispensado utilizando ponteiras descartáveis.

O próprio instrumento é mostrado aqui. Ele inclui uma plataforma sobre a qual a placa de cristalização e o bloco de precipitante são posicionados, além de uma câmara com janelas para controle de umidade. Nesta vista, as janelas da câmara de umidade foram abertas, juntamente com um carretel com ponteiras de dispensação, um braço de dispensação de mease, e um sensor baseado em laser para determinar a posição da agulha de dispensação da fase meph.

Uma plataforma elevada sobre a qual repousa a placa de cristalização e uma plataforma rebaixada para acomodar o bloco de tela de precipitante. Nesta sequência, o robô executa uma série de ações de inicialização quando o instrumento é ligado. Um software de programação é utilizado para configurar o instrumento para trabalhar com placas de cristalização e blocos de precipitante específicos, e para dispensar volumes definidos de enzima e precipitante em uma sequência determinada.

Esses detalhes são fornecidos pelo fabricante e não serão mostrados aqui. O uso do robô para montar uma placa de cristalização começa da seguinte forma: uma seringa Hamilton completa, com agulha e preenchida com meio contendo proteína, é preparada conforme descrito acima na seção sobre robô in meso um e no JoVE 1 7 1 2. A seringa é fixada em posição sob o braço de dispensação do robô.

As coordenadas X e y da agulha na seringa de dispensação são estabelecidas usando o sensor a laser montado na plataforma. Este é um passo importante necessário para garantir que a mease seja dispensada com precisão no centro de cada poço na placa de cristalização. Com o toque de um botão no painel de controle, a seringa é preparada para expelir a mease pela ponta da agulha.

O mease extrudido é então removido com um tecido, em preparação para o uso do robô no carregamento das cavidades antes de montar a placa de cristalização sobre a plataforma do robô. A superfície da plataforma é umedecida com algumas gotas de água para manter a placa no lugar. Por capilaridade, a tampa protetora é removida da placa e esta é colocada firmemente sobre sua plataforma para garantir boa aderência.

Existem três marcadores fiduciais na plataforma sobre os quais estão centralizados os três poços nos cantos, garantindo assim o posicionamento adequado da placa em relação à ponta da agulha de dispensação. O instrumento está agora pronto para entrar em um ciclo de configuração. Este processo começa com um segundo passo de escorvamento, no qual o mease é dispensado sobre uma pequena placa de vidro, imediatamente antes de prosseguir para o carregamento da placa com mease fresco. Nesta sequência, vemos o robô primeiro carregando com mease uma coluna vertical de oito poços na placa e, em seguida, utilizando ponteiras descartáveis para dispensar a solução precipitante sobre o bolus de mease.

Esse processo é repetido 11 vezes ao longo do comprimento da placa até que todos os poços estejam preenchidos. O processo inteiro leva cerca de cinco minutos para ser concluído. Neste vídeo específico, foram dispensados 50 nanolitros de Mease e 800 nanolitros de solução precipitante em cada poço.

A placa preenchida é removida da plataforma do robô colocada sobre uma bancada. O lamínula é aplicado e a placa é selada com um sutiã conforme descrito acima em miso robot one. A placa devidamente rotulada pode agora ser colocada em um ambiente com temperatura controlada para o crescimento de cristais no Meso robot three, o Griffin LCP.

Este último clipe de vídeo mostra o robô Griffin LCP em uso, montando ensaios de cristalização em mesofase. O Griffin incorpora um sistema de dispensação de fase mefásica semelhante ao descrito acima para o robô um. Neste caso, no entanto, todas as 96 soluções de precipitante são dispensadas simultaneamente.

O próprio instrumento é mostrado aqui. Ele inclui uma plataforma na qual a placa de cristalização e o bloco de precipitante são colocados, um braço dispensador de reagentes e uma cabeça de ponteiras Phoenix 96. Para a dispensação de soluções precipitantes, o robô em ação é mostrado nesta sequência final de vídeo.

A cabeça com 96 ponteiras é primeiro carregada com a solução precipitante. Um atraso definido pelo usuário é fornecido para facilitar a aspiração de precipitantes viscosos. A fase MEA é dispensada sequencialmente nos 96 poços em um processo que leva cerca de um minuto para ser concluído.

Por fim, a cabeça com 96 ponteiras dispensa simultaneamente as 96 soluções precipitantes sobre as bolhas da fase MEA nos poços de cristalização. Todo o processo de carregamento da placa é concluído em dois minutos. A placa preenchida é removida da bancada do robô, selada com um lamínula e colocada em armazenamento sob condições controladas de temperatura para o crescimento dos cristais.

As próximas etapas no processo geral de determinação estrutural por cristalografia de macromoléculas são colher e resfriar criogenicamente os cristais, além de registrar e processar a difração de raios X proveniente deles. Esses tópicos são abordados em artigos de procedimento separados desta série.I.