Name: Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated In situ Hibridação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda mapeamento físico de alta capacidade de cromossomos usando hibridização in situ automatizada. Este protocolo utiliza preparação de alta pressão e imagem automatizada para mapear sondas de DNA em cromossomos politênicos de mosquitos.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão dos National Institutes of Health 1R21AI094289 concedida a Igor V. Sharakhov. O Sistema Automatizado de Coloração de Lâminas Xmatrx e o Sistema de Escaneamento Automatizado ACCORD PLUS foram adquiridos com o auxílio do programa Equipment Trust Fund, do Fralin Life Science Institute, do Departamento de Entomologia e do Departamento de Bioquímica da Virginia Tech.

1. Preparação de cromossomos politênicos de alta pressão a partir de células-nursas ovarianas
<ol>
	<li>Disseque fêmeas de Anopheles meio-grávidas 25 horas após a alimentação com sangue sob um microscópio de dissecação e fixe os ovários em solução de Carnoy modificada fresca com metanol (metanol 100%: ácido acético glacial, 3:1). Nesta fase, os ovários estão no estágio III de Christophers de desenvolvimento, quando os folículos têm forma oval e uma área transparente com células-nursa dentro dos folículos apresenta forma arredondada13. Coloque os ovários de aproximadamente cinco fêmeas em 500 μl de solução de Carnoy modificada em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e mantenha-os à temperatura ambiente por 24 horas. Transfira os ovários para -20 °C para armazenamento de longo prazo.</li>
	<li>Prepare a solução de Carnoy modificada com etanol (etanol 100%: ácido acético glacial, 3:1) e ácido propiônico a 50% logo antes de preparar as lâminas. Coloque um par de ovários sobre uma lâmina livre de poeira em uma gota de solução de Carnoy modificada. Divida os ovários em aproximadamente seis seções com agulhas de dissecação e coloque-os em gotas de ácido propiônico a 50% sobre lâminas limpas sob um estereomicroscópio Leica MZ6. Utilize uma lâmina separada para cada seção.</li>
	<li>Seccione os folículos com agulhas e remova os tecidos residuais com papel filtro ou papel toalha sob um microscópio de dissecação. Adicione uma nova gota de ácido propiônico a 50% aos folículos e deixe repousar por 3-5 minutos à temperatura ambiente. Coloque uma lamínula sobre a gota de ácido propiônico a 50%. Deixe a lâmina repousar por aproximadamente 1 minuto.</li>
	<li>Envolva a lâmina com papel filtro e plástico. Usando uma ferramenta rotativa Dremel 200 com acoplamento de haste flexível e ponta de plástico macio ajustada entre 3000-5000 RPM, esprema os folículos girando a ponta em círculos e pressionando levemente a lamínula para espalhar uniformemente os núcleos. Este passo deve durar aproximadamente 1 minuto. Verifique a qualidade do espalhamento com um microscópio de contraste de fase Olympus CX41 utilizando uma objetiva de 20x.</li>
	<li>Monte um "sanduíche" colocando uma lamínula adicional ao lado da lamínula que cobre os cromossomos e cubra ambos com uma segunda lâmina de microscopia. Isso reduz a chance de esmagar a lâmina na morsa. Envolva as lâminas com uma folha plástica proveniente de recipientes de lâminas de vidro e papel filtro para manter o conjunto fixo e proteger a lâmina contra arranhões causados pela morsa.</li>
	<li>Aplicar pressão às lâminas por meio de uma morsa mecânica. Uma pressão de 85-120 polegadas-libra é suficiente e pode ser alcançada usando uma chave de torque. Este passo é necessário para achatamento máximo dos cromossomos.</li>
	<li>Remova a segunda lâmina de microscopia e a lamínula adicional. Aqueça a lâmina com a lamínula cobrindo os cromossomos a 55 °C em um sistema de desnaturação/hibridização de lâminas por 10-15 minutos para achatá-los ainda mais. Mergulhe a lâmina em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos e, quando as bolhas cessarem, remova rapidamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Coloque imediatamente as lâminas em etanol a 50% frio por 5 minutos. Desidrate as lâminas em etanol a 70%, 90% e 100%, por 5 minutos cada. Deixe as lâminas secar ao ar.</li>
</ol>
2. FISH Utilizando um Sistema Automatizado de Coloração de Lâminas
O programa é configurado com o sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx para executar os seguintes passos, exceto a marcação da sonda. O protocolo detalhado de marcação por nick-translation está descrito na documentação fornecida com a DNA polimerase da Fermentas.
<ol>
	<li>Antes da FISH, prepare as sondas fluorescentes marcando o DNA genômico de BAC com um fluorocromo usando um protocolo de nick-translation. Misture 1 μg de DNA, 0,05 mM de cada dATP, dCTP e dGTP não marcado e 0,015 mM de dTTP, 1 μl de dUTP marcado com Cy3 ou Cy5, 0,05 mg/ml de BSA, 5 μl de tampão 10x para nick-translation, 20 unidades de DNA polimerase I, 0,0012 unidades de DNase I e água livre de nucleases até completar 25 μl. A proporção entre DNA polimerase I e DNase I é escolhida empiricamente para obter sondas com tamanho entre 300 e 500 pb. Incube a mistura a 15 °C por 1 hora.</li>
	<li>Coloque as lâminas e os reagentes no sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx e inicie o programa para executar os seguintes passos. Aplique 800 μl de PBS 1x por 20 min. Seque as lâminas com ar. Realize a fixação com formalina aplicando 450 μl de formalina 4% em PBS 1x por 1 min, seguido de lavagens com etanol 100% por 1 segundo duas vezes e por 2 minutos uma vez. Seque as lâminas com ar.</li>
	<li>Aqueça as lâminas a 45 °C por 2 min para evitar formação de bolhas ao aplicar as sondas. Aplique 20 μl das sondas de DNA, adicione gotas de óleo mineral para evitar evaporação da solução de hibridização e coloque uma lamínula sobre a lâmina. Desnature os cromossomos e as sondas de DNA aquecendo as lâminas a 90 °C por 10 min.</li>
	<li>Para hibridização, incube as lâminas a 42 °C por 14 horas com as lamínulas posicionadas. A solução de hibridização consiste em 2x SSC, 100 mM de fosfato de sódio, solução Denhardt's 1x, 100 μg/ml de azida de sódio e 10% de sulfato de dextrana em formamida.</li>
	<li>Para as lavagens de stringência, aqueça as lâminas a 42 °C por 2 min, remova as lamínulas e lave as lâminas em SSC 2x por 1 segundo quatro vezes. Seque as lâminas com ar. Aplique 800 μl de SSC 0,4x a 42 °C por 10 min duas vezes. Lave as lâminas em SSC 2x a 25 °C por 10 min.</li>
	<li>Realize a coloração cromossômica aplicando 50 μl de YOYO-1 1 μM em PBS 1x. Adicione gotas de óleo mineral para evitar evaporação da solução de coloração, coloque lamínulas e incube a 25 °C por 10 min. Remova as lamínulas, lave as lâminas em SSC 2x por 1 segundo quatro vezes. Seque as lâminas com ar. Aplique 15 μl do agente antifade ProLong Gold. Coloque lamínulas.</li>
</ol>
3. Leitura de lâminas com um sistema automatizado de imagem fluorescente
Esta seção detalha o uso do software Duet, que acompanha padrão com o sistema de digitalização automatizado ACCORD PLUS. As instruções iniciam-se após ligar nesta ordem: fonte de alimentação Olympus U-RFL-T para lâmpada de halogênio, computador Dell Precision T3500, microscópio Olympus BX61 com câmera conectada Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Para configurar a pré-análise em 10x, abra o software Duet no sistema de digitalização automatizado ACCORD PLUS. Clique no botão "Online". Insira um novo ID de caso e atribua um ID de lâmina. Clique no ponto marcado como "BF". Esta é a opção de campo claro. Defina a opção de digitalização como "10x Prescan". Use "2500x circle", "10000x circle" ou "rectangle". Clique em "Set&amp;run" para iniciar a pré-análise em 10x.</li>
	<li>Clique no botão "OK" para executar a pré-análise em 10x. Siga as instruções para ajustar corretamente a digitalização. Clique em "Finish" para iniciar a varredura. Pressione a aba "Main" para retornar à tela principal. Clique no botão "Offline". Localize o ID de caso e o ID de lâmina atribuídos e clique em "Offline Scan". Na caixa preta na área superior esquerda, clique em uma seta e selecione "10x Prescan". Utilizando as setas (&lt; || Δ &gt;, também conhecidas como botões "voltar", "pausar", "reproduzir", "avançar"), percorra as imagens digitalizadas.</li>
	<li>Após encontrar uma imagem de interesse, clique duas vezes no centro da região-alvo na tela e pressione "Snap". Isso marcará a imagem para captura posterior. Após selecionar todos os alvos, clique em "Classify". Selecione "10x Prescan". Clique com o botão direito em uma imagem e terá a chance de classificá-la. Selecione "Polytene".</li>
	<li>Configure a pré-análise em 40x no software Duet. Clique em "Main" para retornar ao menu principal. Selecione novamente "Online". Escolha uma lâmina. Altere "BF" para "FL". Mude o nome da tarefa para "Revisit-X40-RG". Altere a seção logo abaixo da última configuração para "Revisit-ALL". Clique em "Set&amp;Run". Pressione "OK". Siga novamente as instruções para configurar a automação. Clique no botão "Start matching views" para alinhar as imagens em 10x e 40x. Clique em "Finish" para iniciar a digitalização. Após concluída, clique em "Classify" e examine as imagens.</li>
</ol>
4. Resultados Representativos
Figura 1 representa graficamente o esquema do preparo de cromossomos em alta pressão. Esta etapa envolve o processo de esmagamento e achatamento dos cromossomos utilizando uma ferramenta Dremel e uma morsa mecânica, bem como a visualização dos cromossomos por meio de microscópio de contraste de fase. Figura 2 ilustra a hibridização de uma sonda marcada com fluoróforo ao DNA-alvo em lâminas de cromossomos, utilizando um sistema automatizado de coloração de lâminas, o uso de um microscópio de varredura automatizado para visualizar e mapear as sondas após o experimento de FISH, e o posicionamento e orientação de scaffolds genômicos nos cromossomos.
Preparações de cromossomos politênicos de células nodrizas ovarianas de fêmeas de An. gambiae foram realizadas utilizando a técnica de alta pressão. Este método não danifica nem altera a maior parte da estrutura cromossômica (Figura 3). Ele aplaina cromossomos curvados e, assim, revela finas bandas ocultas que não são visíveis em preparações convencionais (Figura 4).
As sondas utilizadas neste protocolo são clones de DNA BAC genômicos obtidos de uma biblioteca BAC ND-TAM gerada a partir do DNA da linhagem PEST de An. gambiae. O DNA genômico para esta biblioteca foi extraído de larvas recém-eclodidas do primeiro estágio de ambos os sexos. Figura 5 mostra os resultados da hibridização in situ fluorescente (FISH) utilizando clones BAC hibridizados a cromossomos politênicos de An. gambiae. Este procedimento foi realizado utilizando o sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx. Utilizando um fotomapa citogenético para An. gambiae10, dois clones BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) e BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), foram localizados nas subdivisões 16C e 16D do braço 2R, respectivamente. No entanto, a busca BLAST contra o conjunto AgamP3 da linhagem PEST de An. gambiae14 identificou as sequências homólogas a 102B24 e 142O19 nas subdivisões 16B e 17A do braço 2R, respectivamente (Tabela 1). Portanto, a correspondência entre as coordenadas genômicas e as subdivisões citogenéticas pode agora ser ajustada de acordo com nossos dados de mapeamento. A busca BLAST contra os conjuntos genômicos das formas M e S de An. gambiae revelou que os dois clones BAC estão localizados em contigs diferentes, mas nos mesmos scaffolds dentro de cada forma (Tabela 1). Os contigs identificados podem agora ser associados a localizações cromossômicas específicas. Além disso, os scaffolds identificados podem agora ser corretamente orientados dentro das subdivisões citológicas 16CD. Curiosamente, as distâncias entre as sequências 102B24 e 142O19 nos scaffolds são de 1.892.981 pb, 1.658.391 pb e 1.688.426 pb nas montagens genômicas da linhagem PEST, forma M e forma S, respectivamente. Como a linhagem PEST é um híbrido entre as formas M e S, essa diferença provavelmente se deve à montagem incorreta do genoma PEST.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(aceder)</td>
			<td>Estirpe PEST 
			AgamP3 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Contigs do 
			forma M 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Scaffolds do 
			forma M 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Contigs do 
			forma S 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Scaffolds do 
			forma S 
			 
			Coordenadas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43,681,342- 
			43,681,874</td>
			<td>ABKP020247 
			53.1 
			 
			32,513- 
			33,045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1,858,377- 
			1,858,909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4,299- 
			4,832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215,891- 
			216,424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43,788,213- 
			43,788,969</td>
			<td>ABKP020247 
			51.1 
			 
			24,816- 
			25,575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1,772,683- 
			1,773,442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27,782- 
			28,540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305,514- 
			306,272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45,428,580- 
			45,429,264</td>
			<td>ABKP020247 
			01.1 
			 
			2,499- 
			3,185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315,806- 
			316,492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49,242- 
			49,942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,791,625- 
			1,792,325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45,560,099- 
			45,574,323</td>
			<td>ABKP020220 
			17.1 
			 
			30,971- 
			32,469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200,518- 
			202,016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27,760- 
			28,508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,903,569- 
			1,904,317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Resultados do BLAST das sequências das extremidades do BAC contra os montagens do genoma de An. gambiae.
<img alt="Dissecação de ovário de mosquito; microscópio estereoscópico; preparação de cromossomos; microscopia de contraste de fase." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Representação esquemática da preparação de cromossomos sob alta pressão. Ovários de mosquito são mostrados no estágio correto de desenvolvimento.
<img alt="Rotulagem de sonda para mapeamento cromossômico com hibridização automatizada em lâmina e microscópio de varredura." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Esquema representando a FISH automatizada, varredura de lâmina e mapeamento cromossômico de scaffolds genômicos.
<img alt="Estrutura do cromossomo politênico, imagem de microscópio, análise de padrão de bandas de DNA, pesquisa genética." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. Um espalhamento do cromossomo politênico 3 de An. gambiae obtido utilizando a técnica de alta pressão. 3L e 3R marcam os braços esquerdo e direito em seus telômeros. PH e IH indicam heterocromatina pericêntrica e intercalar, respectivamente.
<img alt="Imagem microscópica comparando os padrões de bandamento dos cromossomos 3R/3L sob diferentes pressões." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Comparação dos cromossomos politênicos de An. gambiae preparados utilizando a técnica tradicional (superior) e a técnica de alta pressão (inferior). As imagens abrangem as subdivisões 29A-30E do braço 3R (A) e 43D-46D do braço 3L (B).
<img alt="Mapeamento cromossômico, marcadores fluorescentes e locos genéticos em cromossomos politênicos de Drosophila, diagrama." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 5"> 
Figura 5. FISH de clones BAC em cromossomos politênicos de An. gambiae. A) Hibridização de 102B24 (sinal vermelho) com o braço 2R. B) FISH em dupla coloração de 102B24 (sinal vermelho) e 142O19 (sinal azul) nas subdivideções 16C e 16D do braço 2R esticado, respectivamente. Setas indicam os sinais de hibridização dos clones BAC marcados com Cy3 (vermelho) e Cy5 (azul). C – região centromérica. a/+ mostra a inversão heterozigota 2La. Os cromossomos foram contrastados com o fluoróforo YOYO-1.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
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<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

A etapa mais crítica do procedimento de alta pressão é a prensagem adequada das células-nursas ovarianas isoladas no estágio III de Christophers do desenvolvimento ovariano13. Uma prensagem inadequada pode resultar em cromossomos insuficientemente espalhados, o que pode causar problemas ao tentar determinar as localizações das sondas após a FISH. Se os cromossomos forem excessivamente prensados, podem se romper ou alongar a ponto de os padrões de bandamento se perderem. A produção de múltiplas lâminas deve levar a uma consistência ao tentar prensar as lâminas usando a ferramenta Dremel, o que aumentará a eficiência geral da produção de lâminas. A técnica de alta pressão foi inicialmente desenvolvida para glândulas salivares recém-isoladas de D. melanogaster9. No entanto, os ovários de mosquitos são rotineiramente preservados em solução fixadora de Carnoy modificada (3 metanol : 1 ácido acético glacial em volume) antes de serem utilizados para preparações cromossômicas. Portanto, modificamos o protocolo existente de alta pressão para torná-lo adequado aos cromossomos politênicos de células-nursas ovarianas fixadas do mosquito da malária An. gambiae. Como a alta pressão é aplicada usando um torno de precisão que possui uma superfície de trabalho altamente paralela em toda a extensão da lâmina, o tempo necessário para preparar a preparação em esmagamento cromossômico é significativamente menor do que ao usar a técnica tradicional de batidas com a borracha de um lápis.
Outras etapas importantes incluem a imersão suficiente dos folículos em ácido propiônico a 50% e o aquecimento da lâmina. Ambas as etapas são essenciais para ajudar a achatamento dos cromossomos. Se forem negligenciadas, os cromossomos podem parecer brilhantes após a desidratação, o que potencialmente leva a um excesso de fundo que pode ser confundido com um sinal em FISH. A técnica de esmagamento sob alta pressão também funciona bem utilizando as mesmas soluções ao preparar cromossomos mitóticos. A espalhamento e achatamento adicionais ajudam a melhorar a liberação dos cromossomos a partir de seus núcleos. A aplicação de pressão uniforme deve achatá-los adequadamente, permitindo medições e potencialmente uma resolução mais nítida das bandas visíveis após coloração. Os detalhes sobre o isolamento de cromossomos mitóticos de mosquitos são fornecidos em outro lugar15. Embora preparações de esmagamento convencionais sejam suficientes para muitas finalidades, incluindo FISH 16 e imunomarcação17, o método de alta pressão não apenas reduz a variação potencial entre lâminas, mas também aumenta a qualidade geral dos cromossomos, resultando em maior detalhamento ao mapear cromossomos. Este procedimento também pode ser usado para preparar lâminas de membrana com cromossomos politênicos para microdissecção a laser.
As limitações do método de alta pressão incluem a quebra das lâminas e o excessivo alongamento dos cromossomos. A quebra da lâmina, causada pelo excesso de pressão aplicada pela morsa, é possível, mas é reduzida mediante o uso das pressões indicadas no artigo. No caso do excessivo alongamento dos cromossomos, se a ferramenta Dremel for aplicada à lâmina por um período prolongado, há a possibilidade de os cromossomos ficarem excessivamente esticados e perderem resolução. Isso pode ser corrigido aplicando a ferramenta por um breve período, verificando ao microscópio e, caso os cromossomos não estejam suficientemente espalhados, aplicando mais tempo com a ferramenta Dremel.
Um protocolo tradicional de FISH inclui várias etapas de lavagem e incubação, que geralmente duram de 5 a 20 minutos e exigem atenção quase constante do pesquisador durante toda a duração do experimento. Além disso, o número de lâminas que podem ser manipuladas manualmente é normalmente limitado a poucas lâminas em um dado experimento. Em contraste, um sistema automatizado de coloração de lâminas realiza todas as etapas (incluindo lavagem, incubação, aplicação da sonda, desnaturação, hibridização, aplicação e remoção do lamínula) automaticamente. Isso libera de 6 a 8 horas de trabalho para o pesquisador em um experimento de FISH. Além disso, um sistema automatizado de FISH pode aumentar significativamente o rendimento. Por exemplo, o sistema Xmatrx é capaz de processar até 40 ensaios em lâminas de preparação simples e até 80 ensaios em lâminas de dupla preparação simultaneamente. Entre as limitações desse sistema está o fato de que ele não é eficiente para um pequeno número de experimentos de FISH, pois exige o preparo de grandes volumes de soluções. Além disso, o protocolo de FISH programado no sistema pode exigir modificações e ajustes para novas aplicações.
Um sistema de digitalização de lâminas é uma versão automatizada de um microscópio fluorescente. O movimento automatizado da platina e um painel de controle simples do microscópio liberam o tempo do pesquisador e tornam a operação do microscópio extremamente fácil. Por exemplo, o software do sistema de digitalização ACCORD PLUS permite a captura fácil de múltiplos canais de fluorescência e uma aquisição de imagens fácil de gerenciar. Um exemplo disso é a inclusão da captura de z-stacks, em vez de uma única imagem; o software captura uma pilha de imagens em z configurável para garantir que pelo menos uma imagem permaneça em foco. Embora este sistema seja mais adequado para a aquisição de múltiplas imagens (muitas células em uma única lâmina), ele ainda facilita muito a localização de cromossomos na lâmina em comparação com a navegação manual pela lâmina.
Tanto o sistema automatizado de coloração de lâminas quanto o sistema de digitalização são rotineiramente utilizados em clínicas de citogenética para diagnósticos FISH de anomalias cromossômicas em células humanas. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo que utiliza esses sistemas automatizados para uma aplicação em pesquisa básica. O protocolo automatizado de mapeamento físico de alto rendimento pode facilitar o desenvolvimento rápido de mapas cromossômicos físicos para qualquer espécie de interesse. Embora neste relatório tenhamos utilizado cromossomos politênicos para o mapeamento físico, cromossomos mitóticos também podem ser utilizados com esses sistemas. Seria útil adaptar o protocolo para cromossomos mitóticos, pois a maioria dos organismos não desenvolve cromossomos politênicos legíveis. No entanto, quando disponíveis, os cromossomos politênicos podem fornecer informações úteis sobre a correspondência entre domínios funcionais do genoma e a estrutura cromossômica com a mais alta resolução. Os princípios organizacionais dos cromossomos politênicos, como os padrões de bandas e interbandas, foram recentemente comparados aos dos cromossomos regulares não politênicos (em interfase)18. Portanto, o mapeamento físico detalhado realizado em preparações cromossômicas de alta pressão tem o potencial de associar sequências de DNA a estruturas cromossômicas específicas, tais como bandas, interbandas, alças, centrômeros, telômeros e heterocromatina; criando, assim, montagens genômicas baseadas em cromossomos.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de microscopia 22x22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscopia 18x18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta rotativa Dremel 200 com acessório de haste flexível</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Mini esmerilhadeira de bancada multifuncional (com limitador de velocidade)</td></tr><tr><td>Pontas plásticas especialmente projetadas de 200 &amp;mu;l (bordas plásticas com rebarbas) para ferramenta Dremel</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Recortar e aquecer a extremidade grossa das pontas de pipeta</td></tr><tr><td>Grampo rápido revestido com estanho</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Quadrado retificado com precisão e paralelo dentro de 0,00025</td></tr><tr><td>Chave de torque</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ThermoBrite de desnaturação/hibridização de lâminas</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas com barreira de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizado de coloração de lâminas Xmatrx</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico MZ6 Leica</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Pode-se usar um microsscópio estereoscópico diferente</td></tr><tr><td>Microsscópio de contraste de fase Olympus CX41</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Pode-se usar um microsscópio de fase diferente</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de digitalização ACCORD PLUS</td><td>BioView (EUA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>FNF a 10% (formalina tamponada neutra)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formamida a 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrana, sal sódico</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Tampão SSC 20x</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Denhardt 50x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodeto de YOYO-1 1 mM (491/509) em DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase I de DNA</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando automated<em&gt; in situ</em&gt; hibridação

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projetos para obter sequências de genoma inteiro de 10.000 espécies de vertebrados1 e de 5.000 espécies de insetos e artrópodes relacionados2 devem ocorrer nos próximos 5 anos. Por exemplo, o sequenciamento dos genomas de 15 espécies de mosquitos transmissores de malária está atualmente sendo realizado usando uma plataforma Illumina3,4. Este grupo de espécies de Anopheles inclui tanto vetores quanto não vetores da malária. Quando os montagens genômicas estiverem disponíveis, os pesquisadores terão a oportunidade única de realizar análises comparativas para inferir alterações evolutivas relevantes para a capacidade vetorial. No entanto, tem-se demonstrado difícil utilizar leituras de sequenciamento de nova geração para gerar montagens genômicas de novo de alta qualidade5. Além disso, as montagens genômicas existentes para Anopheles gambiae, embora obtidas usando o método Sanger, apresentam lacunas ou são fragmentadas4,6.
O sucesso das análises genômicas comparativas será limitado se os pesquisadores lidarem com inúmeros contigs de sequenciamento, em vez de montagens genômicas baseadas em cromossomos. Sequências fragmentadas e não mapeadas criam problemas para as análises genômicas porque: (i) lacunas não identificadas causam anotação incorreta ou incompleta das sequências genômicas; (ii) sequências não mapeadas levam à confusão entre genes parálogos e genes de diferentes haplótipos; e (iii) a ausência de atribuição cromossômica e orientação dos contigs de sequenciamento impede a reconstrução da filogenia de rearranjos e o estudo da evolução cromossômica. Desenvolver mapas físicos de alta resolução para espécies com genomas recém-sequenciados é um investimento oportuno e economicamente eficaz que facilitará a anotação do genoma, a análise evolutiva e o resequenciamento de genomas individuais de populações naturais7,8.
Aqui, apresentamos abordagens inovadoras para o preparo de cromossomos, hibridização fluorescente in situ (FISH) e obtenção de imagens que facilitam o desenvolvimento rápido de mapas físicos. Utilizando An. gambiae como exemplo, demonstramos que o desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar os montagens genômicos e, consequentemente, a qualidade das análises genômicas. Primeiro, utilizamos um método de alta pressão para preparar espalhamentos de cromossomos politênicos. Esse método, originalmente desenvolvido para Drosophila9, permite ao usuário visualizar mais detalhes nos cromossomos do que a técnica convencional de esmagamento10. Segundo, um sistema automatizado de ponta é usado para mapeamento físico de genomas em alta produtividade. O sistema automatizado de coloração de lâminas executa múltiplos ensaios simultaneamente e reduz drasticamente o tempo de manipulação manual11. Terceiro, um sistema automatizado de imagem fluorescente, que inclui uma platina motorizada para lâminas, escaneia e fotografa automaticamente os cromossomos marcados após a FISH12. Esse sistema é especialmente útil para identificar e visualizar múltiplas placas cromossômicas na mesma lâmina. Além disso, o processo de escaneamento capta um resultado de FISH mais uniforme. No geral, o protocolo automatizado de mapeamento físico em alta produtividade é mais eficiente do que um protocolo manual convencional.

Montagens genômicas baseadas em tecnologias de sequenciamento de DNA em massa paralela são geralmente altamente fragmentadas. O desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens genômicas. Aqui, demonstramos abordagens inovadoras para o preparo de cromossomos, hibridização fluorescente in situ e imageamento que aumentam significativamente o rendimento no desenvolvimento de mapas físicos.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projetos para obter sequências de genoma completo de 10.000 espécies de vertebrados1 e de 5.000 espécies de insetos e artrópodes relacionados2 devem ocorrer ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear sondas de DNA em cromossomos politênicos de mosquito utilizando uma preparação cromossômica de alta pressão, seguida por hibridização fluorescente automatizada em C dois e imagem automatizada. Isso é realizado primeiramente preparando lâminas com espalhamento de cromossomos politênicos usando um método de alta pressão. A próxima etapa do procedimento é preparar sondas fluorescentes rotulando DNA genômico com o fluorocromo utilizando um protocolo de tradução Nick.O terceiro passo é realizar a hibridização fluorescente in C dois usando sistemas automatizados de coloração de lâminas. O passo final é escanear e fotografar os cromossomos marcados utilizando um sistema automático de imagem fluorescente. Em última análise, as imagens podem mostrar a localização de uma sonda de DNA marcada com fluorescência no poli cromossomo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como um protocolo-padrão manual de hibridização in situ, é que o protocolo de mapeamento físico de maior produtividade gera resultados mais consistentes e reduz drasticamente o tempo de manipulação. Este protocolo começa com a dissecção de fêmeas semigrávidas e oly cerca de 25 horas após a alimentação com sangue, para coletar seus ovários quando estiverem no estágio três de Christopher. Neste estágio, a área transparente com células de nutrição nos folículos deve ter formato arredondado; colete ovários de cinco fêmeas e fixe-os em 500 microlitros de solução modificada de carnoy recém-preparada.Em seguida, eles podem ser armazenados à temperatura ambiente por até 24 horas ou por períodos mais longos a menos 20 graus Celsius. Em seguida, logo antes de preparar as lâminas de dissecação de ovário, prepare a solução de carnoisa e ácido propiônico a 50%. Coloque cada par de ovários em uma gota de solução de carnoisa fresca sobre uma lâmina livre de poeira sob um microscópio de dissecação.Divida os ovários com a agulha de dissecação. Transfira todos os fragmentos ovarianos para seis lâminas limpas com ácido propiônico a 50%. Separe os folículos uns dos outros utilizando agulhas de dissecação.Em seguida, remova quaisquer tecidos remanescentes com uma toalha de papel. Adicione outra gota de ácido propiônico a 50% e aguarde de três a cinco minutos. Diz a lenda que os folículos permanecem em ácido propiônico a 50% por três a cinco minutos, o que melhora significativamente a dispersão dos cromossomos.Em seguida, aplique uma lamínula e aguarde mais um minuto para espalhar os núcleos. Envolva a lâmina com papel de filtro e plástico. Ajuste um Dremel entre três e 5.000 rpm e, durante cerca de um minuto, gire levemente a ponta do Dremel em movimento contra a lamínula.Confirme a qualidade da espalhamento com um microscópio de contraste de fase e aplique o dremel por mais tempo, se necessário, para achatamento dos cromossomos. Coloque um segundo lamínula adjacente ao primeiro, depois empilhe as lamínulas com outro microscópio. Em seguida, envolva as lâminas com uma folha de plástico e com papel de filtro, coloque as lâminas envolvidas em um torno para comprimi-las entre 85 e 120 polegadas-libra.Após achatamento dos cromossomos em todos os seis lâminas, desembrulhe os lâminas e remova os lâminas extras para achatamento adicional dos cromossomos. Incube os lâminas a 55 graus Celsius por 10 a 15 minutos em um sistema de desnaturação e hibridização de lâminas. Em seguida, mergulhe um lâmina em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos ou até que a borbulhagem cesse.Em seguida, remova rapidamente a lamínula com uma lâmina de barbear e coloque imediatamente a lâmina em etanol a 50% frio por cinco minutos. Repita este processo para cada lâmina sequencialmente. Desidrate as lâminas em banhos de etanol a 70%, 90% e 100%.Mergulhe-os em cada banho durante cinco minutos. Por fim, após as lâminas secarem ao ar, estarão prontas para a hibridização por fluorescência para coloração. Um dispositivo automatizado realiza a maioria das etapas do procedimento, exceto a marcação da sonda.Antes de carregar o dispositivo, prepare a sonda fluorescente marcando novamente o DNA com o fluorocromo, utilizando um protocolo comercial de tradução NIC. Com a sonda preparada, carregue as lâminas e os reagentes no sistema automatizado de lâminas. Configure o sistema para realizar os seguintes passos. Primeiro, forneça 800 microlitros de 1x PBS por 20 minutos.Segundo, seque os lâminas com secador. Terceiro, fixe os lâminas com 450 microlitros de formalina 4% em um XPBS por um minuto. Em seguida, lave os lâminas com etanol 100% por um segundo, duas vezes, e por dois minutos.Após o banho de etanol, sopre os lâminas novamente. Agora aqueça os lâminas a 45 graus Celsius por dois minutos para evitar a formação de bolhas. Em seguida, aplique 20 microlitros da sonda de DNA, seguido por uma gota de óleo mineral e uma lamínula. Em seguida, desnature os cromossomos a 90 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, deixe as lâminas hibridizarem a 42 graus Celsius por 14 horas. Após a hibridização, realize as lavagens de restrição por dois minutos a 42 graus Celsius, seguidas por quatro aplicações consecutivas de um segundo de dois XSSC e secagem. Em seguida, aplique 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 graus Celsius por 10 minutos, duas vezes, seguido por mais uma lavagem e dois XSSC a 25 graus Celsius por 10 minutos.Aplique agora a coloração: 50 microlitros de Yo-Yo-1, seguidos por óleo mineral e lamínulas. Incube as lâminas a 25 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, remova as lamínulas.Lave as lâminas em duas XSSC quatro vezes, durante um segundo por lavagem, e seque-as com ar. Por fim, aplique 15 microlitros de reagente antidesvanecimento prolongado de ouro a cada lâmina e coloque lamínulas novas. Ligue o sistema automatizado de digitalização Accord plus, começando pela fonte de alimentação Olympus U-R-F-L-T para uma lâmpada de halogênio.Em seguida, o computador e, por último, o microscópio com um acessório de câmera. Agora, abra primeiro o pacote de software duet, configure uma pré-visualização de 10x. Clique no botão online, insira um novo ID de caso e atribua um ID de lâmina.Clique no ponto marcado como bf. Esta é a opção de campo claro. Selecione uma opção de digitalização para pré-digitalização de 10 x.Selecione 2, 500 x círculo, 10 000 x círculo ou retângulo. Clique em definir e executar. Em seguida, ok, siga as instruções para ajustar corretamente a digitalização e depois clique em finalizar.Para iniciar a varredura, pressione a guia principal para voltar à tela principal. Agora, clique no botão offline, localize o ID do caso e o ID da lâmina que foram atribuídos e clique em offline.Realize a varredura na caixa preta na área superior esquerda. Clique em uma seta e selecione a pré-varredura 10 x. Use as setas para percorrer as imagens escaneadas após encontrar uma imagem de interesse.Clique duas vezes na tela no centro da região selecionada e pressione capturar. Isso definirá uma imagem para captura posterior após a seleção de todos os alvos. Clique com o botão direito em cada imagem, clique em classificar, selecione pré-escaneamento de 10 x e selecione politano.Retorne ao menu principal e configure a pré-varredura de 40 x. Selecione online novamente e escolha uma lâmina. Altere BF para ffl e mude o nome da tarefa para revisit dash X 40 dash rg.Altere a seção logo abaixo da última configuração para revisitar todos os traços. Em seguida, execute o programa e siga as instruções. Para configurar a automação, clique no botão iniciar correspondência de visualizações para corresponder as imagens de 10 x e 40 x.Clique em finalizar para iniciar a varredura. Após concluir, clique em classificar e examine as imagens. Preparações de cromossomos politênicos de células nodais ovarianas de fêmeas de Anopheles gambiae foram feitas utilizando a técnica de alta pressão.Este método não danifica nem altera a maior parte da estrutura cromossômica. Ele aplaina os cromossomos dobrados e, assim, revela bandas finas ocultas que não são vistas em preparações convencionais. O cromossomo foi hibridizado com clones de DNA retroprojetados obtidos da biblioteca Tam back de S. Gambia.A biblioteca foi gerada a partir de larvas estrela do primeiro estágio de machos e fêmeas da linhagem de praga Anopheles gambiae. Após este procedimento, pode-se realizar um mapeamento físico automatizado de alto rendimento, a fim de facilitar o desenvolvimento rápido de montagens genômicas baseadas em cromossomos.

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Research

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