Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated In situ Hibridação
28 de junho de 2012
As montagens do genoma baseadas em tecnologias de sequenciamento de DNA massivamente paralelas são geralmente altamente fragmentadas. O desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens do genoma. Aqui, demonstramos abordagens inovadoras para preparação cromossômica, hibridização in situ fluorescente e imagens que aumentam significativamente o rendimento do desenvolvimento do mapa físico.
O objetivo geral deste procedimento é mapear sondas de DNA para cromossomos polytan de mosquitos usando uma preparação cromossômica de alta pressão, seguida de fluorescência automatizada em hibridização C dois e imagem automatizada. Isso é feito preparando primeiro os spreads do cromossomo polytan usando um método de alta pressão. O próximo passo do procedimento é preparar sondas fluorescentes rotulando o DNA genômico com o fluorocromo usando um protocolo de tradução Nick.
O terceiro passo é realizar hibridização fluorescente em C dois usando sistemas automatizados de coloração de lâminas. A etapa final é escanear e fotografar os cromossomos marcados usando um sistema automático de imagem fluorescente. Em última análise, as imagens podem mostrar a localização de uma sonda de DNA marcada com fluorescência no policromossomo.
A principal vantagem dessa técnica ou dos métodos existentes, como um protocolo de hibridização in situ manual padrão, é que o protocolo de mapeamento físico de maior rendimento produz resultados mais consistentes e reduz drasticamente o tempo prático. Este protocolo começa dissecando fêmeas de meia gravidade e oly cerca de 25 horas após a alimentação com sangue para coletar seus ovários quando estão no estágio três de Christopher. Nesta fase, a área transparente com células enfermeiras dentro dos folículos deve ter uma forma redonda, coletar ovários de cinco fêmeas e fixá-los em 500 microlitros de solução de ruído de carro modificada recém-feita.
Eles podem então ser armazenados em temperatura ambiente por até 24 horas ou por mais tempo a menos 20 graus Celsius. Em seguida, pouco antes de fazer as lâminas de dissecção do ovário, prepare a solução de ruído do carro e o ácido propiônico a 50%. Coloque cada par de ovários em uma gota de solução fresca de ruído automotivo em uma lâmina sem poeira sob um microscópio de dissecação.
Divida os ovários com a agulha de dissecação. Transfira todos os pedaços do ovário para seis lâminas limpas com 50% de ácido propiônico. Separe os folículos uns dos outros usando agulhas de dissecação.
Em seguida, limpe todos os lenços restantes com uma toalha de papel. Adicione outra gota de ácido propônico a 50% e aguarde de três a cinco minutos. Legenda, os folículos ficam em 50% de ácido propônico por três a cinco minutos melhora significativamente a disseminação do cromossomo.
Em seguida, aplique uma lamínula e aguarde mais um minuto para espalhar os núcleos. Enrole a lâmina com papel de filtro e plástico. Defina uma Dremel entre três e 5.000 RPM e, por cerca de um minuto, gire levemente uma ponta giratória da dremel contra a lamínula.
Confirme a qualidade da propagação com um microscópio de fase e aplique a dremel por mais tempo, se necessário, para achatar os cromossomos. Coloque uma segunda lamínula adjacente à primeira e, em seguida, coloque as lamínulas com outro microscópio. Deslize em seguida, embrulhe as lâminas com uma folha de plástico e com papel de filtro, coloque as lâminas de embrulho em um torno para apertar as lâminas entre 85 e 120 libras de polegada.
Depois de achatar os cromossomos em todos os seis slides, desembrulhe os slides e remova os slides extras para achatar ainda mais os cromossomos. Incube as lâminas a 55 graus Celsius por 10 a 15 minutos em um sistema de hibridização de desnaturação de lâminas. Em seguida, mergulhe uma lâmina em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos ou até que o borbulhar pare.
Em seguida, remova rapidamente a lamínula com uma lâmina de barbear e coloque imediatamente a lâmina fria, 50% de etanol por cinco minutos. Repita esse processo para cada slide sequencialmente. Desidrate as lâminas em um banho de 70% a 90% e 100% de etanol.
Mergulhe-os em cada banho por cinco minutos. Finalmente, depois que as lâminas secam ao ar, elas estão prontas para os peixes colorirem. Um dispositivo automatizado executa a maioria das etapas do procedimento, exceto a rotulagem da sonda.
Portanto, antes de carregar o dispositivo, prepare a sonda fluorescente rotulando o DNA com o fluorocromo usando um protocolo comercial de tradução NIC com a sonda preparada, carregue as lâminas e os reagentes nas lâminas automatizadas. Sistema de coloração e programe o sistema para executar as seguintes etapas. Primeiro, forneça 800 microlitros de um XPBS por 20 minutos.
Em segundo lugar, seque as lâminas. Terceiro, fixe as lâminas com 450 microlitros de 4% de formalina em um XPBS por um minuto. Em seguida, lave as lâminas com etanol a 100% por um segundo, duas vezes e por dois minutos.
Uma vez após o banho de etanol, seque novamente as lâminas. Agora aqueça as lâminas a 45 graus Celsius por dois minutos para evitar borbulhar. Em seguida, aplique 20 microlitros da sonda de DNA, seguido por uma gota de óleo mineral e uma lamínula em seguida, na natureza, os cromossomos a 90 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, defina os slides para hibridizar a 42 graus Celsius por 14 horas. Após a hibridização, defina as lavagens rigorosas por dois minutos a 42 graus Celsius, seguidas por quatro aplicações consecutivas de um segundo de dois XSSC e secagem. Em seguida, aplique 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 graus Celsius por 10 minutos duas vezes, seguido por mais uma lavagem e dois XSSC a 25 graus Celsius por 10 minutos.
Agora aplique a mancha de 50 microlitros de ioiô seguido de óleo mineral e lamínulas. Incube as lâminas a 25 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, remova as lamínulas.
Lave as lâminas em dois XSSC quatro vezes por um segundo por lavagem e seque as lâminas. Por fim, aplique 15 microlitros de reagente antidesbotamento dourado prolongado em cada lâmina e cole novas lamínulas. Ligue o sistema de varredura automatizada Accord plus, começando com a fonte de alimentação Olympus UGFLT para uma lâmpada halógena.
Em seguida, o computador e, por último, o microscópio com um acessório de câmera. Agora abra o pacote de software duet primeiro, configure uma pré-varredura de 10 x. Clique no botão online, insira um novo ID de caso e atribua um ID de slide.
Clique no ponto rotulado bf. Esta é a opção de campo claro. Selecione uma opção de digitalização para 10 x pré-digitalização.
Selecione 2.500 x círculo, 10.000 x círculo ou retângulo. Clique em definir e executar. E então, ok, siga as instruções para ajustar a digitalização corretamente e clique em concluir.
Para iniciar a verificação, pressione a guia principal para voltar à tela principal. Agora clique no botão offline, encontre o ID do caso e o ID do slide que foi atribuído. E clique offline.
Digitalize na caixa preta na área superior esquerda. Clique em uma seta e selecione 10 x pré-digitalização. Use as setas para percorrer as imagens digitalizadas depois de encontrar uma imagem de interesse.
Clique duas vezes na tela no meio da região de destino e pressione snap. Isso terá como alvo uma imagem para captura posteriormente, após selecionar todos os alvos. Clique com o botão direito em cada imagem, clique em classificar, selecione 10 x pré-digitalização e selecione polytan.
Retorne ao menu principal e configure a pré-varredura 40 x. Selecione online novamente e selecione um slide. Altere BF para ffl e altere o nome da tarefa para revisitar o traço X 40 traço rg.
Altere a seção logo abaixo da última configuração para revisitar o traço. Em seguida, execute o programa e siga as instruções. Para configurar a automação, clique no botão iniciar visualizações correspondentes para corresponder imagens 10 x e 40 x.
Clique em concluir para iniciar a verificação. Uma vez feito isso, clique em classificar e veja as imagens. Preparações de cromossomos politan de células enfermeiras ovarianas da anomalia feminina Gâmbia foram feitas usando a técnica de alta pressão.
Este método não danifica ou altera a maior parte da estrutura cromossômica. Ele achata os cromossomos dobrados e, portanto, revela faixas finas ocultas que não são vistas em preparações regulares. O cromossomo foi sondado com clones de DNA obtidos da anomalia S Gâmbia e Tam back library.
A biblioteca foi gerada a partir de machos e fêmeas primeiro em larvas estelares da cepa de pragas da anomalia S Gâmbia. Seguindo este procedimento, um mapeamento físico automatizado de alto rendimento pode ser realizado para facilitar o rápido desenvolvimento de montagens de genoma baseadas em cromossomos.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo de alto rendimento para mapeamento de sondas de DNA em cromossomos politan de mosquitos. Ao utilizar preparação de cromossomos sob alta pressão e técnicas de imagem automatizadas, o método aumenta a eficiência e a consistência do desenvolvimento de mapas físicos.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Mapeamento de Cromossomos
- Hibridização In Situ Fluorescente
Fundamentos
- Montagens de genoma a partir de sequenciamento de DNA são frequentemente fragmentadas.
- Mapas físicos de cromossomos podem melhorar a qualidade das montagens de genoma.
- Técnicas inovadoras podem aumentar o rendimento em mapeamento físico.
- Sistemas automatizados podem reduzir o tempo de trabalho manual em procedimentos laboratoriais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de alto rendimento para mapeamento de cromossomos.
- Demonstrar a eficácia da imagem automatizada no desenvolvimento de mapas físicos.
- Melhorar a consistência dos resultados em comparação com métodos tradicionais.
Métodos Utilizados
- Preparação de cromossomos sob alta pressão a partir de ovários de mosquitos.
- Marcação de sondas fluorescentes usando protocolo de Nick translation.
- Hibridização in situ fluorescente automatizada.
- Imagem automatizada para localização de cromossomos.
Principais Resultados
- O protocolo produz espalhas de cromossomos consistentes e de alta qualidade.
- Sistemas automatizados reduzem significativamente o tempo necessário para mapeamento físico.
- As imagens mostram efetivamente a localização de sondas de DNA marcadas fluorescentemente.
- O método aumenta o rendimento em comparação com protocolos manuais.
Conclusões
- Este protocolo de alto rendimento é um avanço significativo no mapeamento de cromossomos.
- A automação melhora a eficiência e a consistência no mapeamento físico.
- As técnicas demonstradas podem ser aplicadas a outros estudos genômicos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-throughput physical chromosome mapping addresses a critical bottleneck in genome assembly quality, directly impacting downstream genomic analyses and evolutionary studies. By enabling rapid, consistent localization of DNA probes, this approach supports de-risking of target validation and improves predictive confidence in comparative genomics workflows. The integration of automation reduces hands-on time and enhances reproducibility, positioning the method as a scalable capability for large-scale sequencing projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic architecture and clarification of gene localization relative to phenotypic traits.
- Operational Value: Reduces ambiguity in gene annotation by assigning contigs to specific chromosomal locations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by improving confidence in gene function inference through accurate physical mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-resolution chromosome spreads suitable for reproducible FISH-based assays.
- Operational Value: Automated staining and imaging systems increase throughput and reduce variability in probe localization detection.
- Assay Readiness: Generates quantifiable spatial outputs that enable comparison across genetic variants or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates evolutionary analysis and phylogenetic reconstruction by assigning orientation and location to sequencing contigs.
- Preclinical Model Relevance: Supports vector competence studies by enabling comparative genomics in disease-transmitting versus non-transmitting species.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves genome annotation quality, reducing false positives in target identification pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early genome sequencing through annotation and comparative analysis, particularly when physical map resolution is needed to resolve assembly gaps or misassemblies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding gene order, synteny, and chromosomal evolution in disease-relevant models.
- Screening: Enables standardized, automated FISH workflows for high-throughput probe validation and localization screening.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based readouts that allow quantitative comparison of probe binding across chromosomes or samples.
- Translational Research: Connects physical mapping to evolutionary inference and biomarker discovery in comparative genomics studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for physical mapping applicable across multiple species and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene annotation and reduces mechanistic ambiguity in genomic data interpretation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation of staining, hybridization, and imaging steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by enhancing genome assembly reliability and reducing biological false leads.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genomic targets through improved assembly quality and evolutionary insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome preparation, FISH protocols, and automated imaging systems.
- Dependent on access to high-pressure preparation tools, automated slide stainers, and motorized fluorescence microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for probe labeling, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of chromosome spreading and denaturation steps.
- Practical limitations include dependency on high-quality polytene chromosomes and suitability primarily for dipteran genomes with polytene stages.
