Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

O objetivo deste procedimento é capturar aptidões quantitativas de cultura microbiana em paralelo em uma escala ampla do genoma de maneira precisa e de alto rendimento. Isso é feito pela primeira biblioteca de Turing e matriz de colônias microbianas em placas de 96 poços e pelo crescimento da cultura até a saturação. Em seguida, as culturas saturadas são diluídas em água e depois colocadas em placas de ágar sólido.

Em seguida, as placas sólidas de garf são fotografadas periodicamente e até que o crescimento da colônia microbiana esteja saturado. Finalmente, as fotografias do curso de tempo do crescimento de cada cultura são convertidas em medidas quantitativas de densidade celular e as curvas de crescimento observadas com modelos de crescimento e medidas quantitativas de aptidão microbiana são resumidas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram evidências de interações genéticas, demonstrando que as cepas microbianas têm aptidões diferentes quando combinadas com diferentes mutações ou cultivadas em diferentes condições.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como métodos de fixação de alta densidade, como SGA ou experimentos de competição de código de barras, é que as medições de aptidão são mais precisas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento de medicamentos contra o câncer, como quais genes e processos são importantes na resposta a danos no DNA e controle do ciclo celular, entendendo e traduzindo essas pesquisas e microrganismos básicos na forma de potenciais alvos de drogas em células cancerígenas humanas. Embora este método possa fornecer informações sobre a função e a visibilidade dos telômeros.

Também pode ser aplicado a outras áreas da biologia de leveduras ou mesmo a qualquer área onde os fenótipos de aptidão possam fornecer informações sobre a biologia microbiana. Esperamos que o QFA possa ser aplicado a muitos outros organismos microbianos para os quais existem bibliotecas de arrays. Por exemplo, povi e coli, excedente de orilla A partir de culturas saturadas durante a noite reproduzidas até 96 cepas de levedura independentes em volumes de 200 microlitros de meio líquido rico.

Em um prato bem cultivado de 96, esterilize um prato de réplica manual de 96 pinos, um oitavo de polegada de diâmetro, mergulhando-o primeiro em 100% de etanol, depois queimando-o e deixando-o esfriar, 200 microlitros de água estéril nos poços de um vórtice de placa de 96 poços saturou culturas de levedura e dilua mergulhando a ferramenta de pino esterilizado nas cepas três vezes. Em seguida, uma vez na placa que contém a água, esterilize a ferramenta de alfinetes e deixe-a esfriar antes de mergulhá-la três vezes nas culturas diluídas. Em seguida, transfira o pino para uma placa de ágar sólida.

Depois de incubar as placas de ágar, use um gerador de imagens SP de robótica s e p para obter imagens manualmente para cultura automatizada. Comece com uma matriz retangular de cepas de levedura independentes cultivadas em ágar sólido. Neste exemplo, as cepas iniciais são o resultado do cruzamento de uma mutação de consulta sensível à temperatura com a coleção de deleção de levedura.

1.536 culturas representando quatro réplicas de 384 cepas de leveduras independentes são cultivadas em placas SGA usando um robô com uma transferência de ferramenta de pino estéril de 96 pinos e um milímetro de diâmetro 384 das 1.536 cepas em 4 96. Placas de cultura de poço contendo 200 microlitros de meio seletivo aumentam as culturas a 20 graus Celsius até a saturação. Para detectar as culturas de levedura saturadas, comece transferindo-as para um robô de manuseio de líquidos e suspendendo-as em um agitador magnético, dilua as culturas para cerca de um a 70 usando uma ferramenta de pino robótico estéril de 96 pinos para fixar em 200 microlitros de água estéril.

Depois de limpar e esterilizar a ferramenta de pinos, coloque as culturas diluídas em placas de ágar. Em 384, o formato do poço transfere as placas para uma incubadora umidificada com temperatura controlada com um carrossel automático e escotilha de acesso. Para obter imagens das culturas, use um gerador de imagens robótico automatizado, que remove repetidamente as placas da incubadora, remove as tampas, as transfere para um espaço uniformemente iluminado sob uma câmera de 35 milímetros, captura uma imagem em 5, 184 por 3, 456.

A resolução de pixels substitui a tampa e, em seguida, os retorna ao carrossel da incubadora para rastrear os locais de cultura nas placas e os tratamentos aplicados a eles. As placas são automaticamente codificadas de acordo com o nome da incubadora, temperatura, número de lote sequencial exclusivo e posição na incubadora. Os nomes das imagens são uma concatenação do nome da placa e do carimbo de data/hora e são gerados automaticamente após a captura da imagem.

As placas também são frequentemente rotuladas manualmente para garantir que permaneçam na mesma ordem ao transferir entre carrosséis de robôs. Os arquivos de metadados são arquivos de texto delimitados por tabulação, que são gerados manualmente. O arquivo de descrição experimental FT dois.

A tabela um é exclusiva para cada experimento, mas a descrição da biblioteca FT três, tabela um pode ser reutilizada extensivamente. Uma vez construído, o experimento é descrito no arquivo de descrição experimental FT duas tabelas, uma contendo colunas para código de barras ou nome de placa gerado automaticamente experimento iniciando o tratamento da placa de carimbo de data/hora conteúdo do meio de ágar sólido nome de tela, número da placa da biblioteca para bibliotecas com várias placas e um número de quadrante de repetição para reduzir de 1.536, formato do poço para 384. Bem, a biblioteca de cepas é descrita com um arquivo de descrição da biblioteca FT três, tabela um informando o genótipo cultivado em cada local de cultura.

Em cada placa de uma biblioteca, ela contém as colunas quatro, nome da biblioteca, ORF, placa de número da placa, coluna da placa de linha e uma coluna de notas opcional. Um arquivo opcional de nome de gene padrão pode ser fornecido FT quatro, tabela um descrevendo o nome do gene padrão associado a cada número ORFY sistemático, identificando as cepas que estão sendo rastreadas. Este arquivo contém duas colunas, ORF e nome do gene para analisar os dados.

O fluxo de trabalho computacional QFA requer acesso a uma estação de trabalho de computador multi-core razoavelmente poderosa na qual está instalada. A ferramenta de software de análise de imagens do colonizador e o pacote QFAR, ambos documentados online, estão disponíveis gratuitamente e são executados em uma variedade de sistemas operacionais. Execute o colonizador com cada uma das imagens de placa capturadas como entrada gerando um arquivo de saída do colonizador FT cinco, tabela um para cada imagem capturada arquivos de saída do colonizador, especifique estimativas de densidade de cultura, cultura, área, forma e cor.

Para cada um dos 384 locais na placa de imagem, um nome de arquivo de saída é copiado automaticamente do nome do arquivo de imagem de origem. O pacote QFAR contém funções que sepõem os cursos de tempo para cada cultura para ajustar modelos populacionais logísticos generalizados às observações e ao gráfico. Ambos veem as figuras dois e três como exemplos.

Os valores de parâmetro ajustados são gravados em arquivos de parâmetros logísticos QFA. O pacote QFAR também contém funções para controle de qualidade. As colônias de borda são descartadas devido à maior disponibilidade de nutrientes nas bordas da placa e à dificuldade de análise de imagens.

Perto das paredes das placas e culturas, que falharam no SGA e genótipos exibindo ligação com genes marcadores específicos da tela são retirados da análise. Várias medidas quantitativas de aptidão são derivadas de parâmetros do modelo logístico da população para cada cultura. Isso inclui taxas máximas de duplicação da população e número de divisões da inoculação à saturação para cada conjunto de culturas replicadas e para cada definição de aptidão.

Várias estatísticas resumidas de estimativas de aptidão são calculadas média e média de aptidão, desvio padrão de aptidão e número de réplicas observadas. As estatísticas resumidas são enviadas para os arquivos de resumo de aptidão QFA FT oito, tabela um para análise posterior. Por exemplo, cálculos de pontuações de interação genética FT nove tabela um.

Esta figura mostra uma curva de crescimento típica em uma escala logarítmica OUTTA 384 QFA. Culturas crescendo a 20 graus Celsius em ágar sólido, quantificado pelo colonizador, com um aumento na densidade celular detectável pela primeira vez após aproximadamente dois dias. Esse atraso é provavelmente um efeito combinado de uma fase de atraso da cultura após a inoculação em meio sólido e um limite inferior de detecção para a densidade celular.

Aqui, 308 curvas de crescimento semelhantes foram capturadas de uma única placa. Observe que as cepas que produziram uma linha plana estavam muito doentes ou mortas. Esta figura demonstra a comparação de duas triagens QFA de todo o genoma para inferir as forças da interação genética.

O pacote QFAR também inclui funções para produzir o valor anterior da curva de crescimento e para produzir listas classificadas de genótipos examinados e estimativas de força de interação genética. Juntamente com um valor Q para a significância do GIS observado, uma vez dominado um QF completo de quatro réplicas em todo o genoma. Um experimento pode ser concluído em três semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser organizado no rastreamento e nomeação de todas as placas e imagens.

Todas as placas devem ser inoculadas e localizadas na orientação e ordem corretas. A análise dos dados depende da exatidão dos arquivos de texto auxiliares construídos pelo cientista experimental. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estimar a aptidão de milhares de culturas microbianas independentes.

As fitas são estimadas fotografando repetidamente culturas manchadas, crescendo em placas de ágar sólidas, convertendo as imagens capturadas em estimativas de densidade celular e gerando curvas de crescimento. A modelagem matemática das curvas de crescimento fornece estimativas quantitativas de aptidão, que podem ser usadas para deduzir relações funcionais entre produtos gênicos em uma escala ampla do genoma.