Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

O objetivo deste procedimento é capturar, de maneira precisa e de alto rendimento, aptidões quantitativas de culturas microbianas em paralelo, em escala genômica. Isso é realizado primeiramente transformando uma biblioteca em matriz de colônias microbianas em placas de 96 poços e cultivando as culturas até a saturação. Em seguida, as culturas saturadas são diluídas em água e então depositadas em placas sólidas de ágar.

Em seguida, as placas sólidas com ágar são fotografadas periodicamente até que o crescimento da colônia microbiana esteja saturado. Por fim, as fotografias da evolução temporal do crescimento de cada cultura são convertidas em medidas quantitativas da densidade celular, e as curvas de crescimento observadas são comparadas com modelos de crescimento, sendo resumidas em medidas quantitativas do condicionamento microbiano. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram evidências de interações genéticas, ao mostrar que linhagens microbianas apresentam diferentes níveis de aptidão quando combinadas com diferentes mutações ou cultivadas sob condições distintas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como métodos de pinagem de alta densidade, por exemplo SGA, ou experimentos de competição por códigos de barras, é que as medições de aptidão são mais precisas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de desenvolvimento de fármacos contra o câncer, como quais genes e processos são importantes na resposta ao dano no DNA e no controle do ciclo celular, além de compreender e traduzir tais pesquisas e microrganismos básicos na forma de alvos farmacológicos potenciais em células cancerígenas humanas. Embora este método possa fornecer informações sobre a função dos telômeros e visi.

Também pode ser aplicado a outras áreas da biologia de leveduras ou, de fato, a qualquer área em que fenótipos de aptidão possam fornecer insights sobre a biologia microbiana. Esperamos que a QFA possa ser aplicada a muitos outros organismos microbianos para os quais existam bibliotecas em matriz. Por exemplo, povi e coli, orilla surplus A partir de culturas saturadas de overnight, foram semeadas até 96 cepas independentes de levedura em volumes de 200 microlitros de meio líquido rico.

Em uma placa de cultura estéril de 96 poços, esterilize um replicador manual de 96 pinos com diâmetro de um oitavo de polegada mergulhando-o primeiro em etanol 100%, depois flamejando-o e deixando-o esfriar. Adicione 200 microlitros de água estéril nos poços de uma placa de 96 poços, vortexe culturas saturadas de levedura e dilua-as mergulhando a ferramenta de pinos esterilizada nas cepas três vezes. Em seguida, uma vez na placa contendo a água. Esterilize novamente a ferramenta de pinos e deixe-a esfriar antes de mergulhá-la três vezes nas culturas diluídas. Transfira então o pin para uma placa de ágar sólida.

Após a incubação das placas de ágar, utilize um leitor robótico SP s e p para imagens manuais com finalidade de cultivo automatizado. Inicie com uma matriz retangular de linhagens independentes de levedura cultivadas em ágar sólido. Neste exemplo, as linhagens iniciais são o resultado do cruzamento de uma mutação condição-dependente com a coleção de deleções de levedura.

1.536 culturas representando quatro réplicas de 384 linhagens independentes de levedura são cultivadas em placas SGA usando um robô com uma ferramenta estéril de transferência de 96 pinos com diâmetro de um milímetro, transferindo 384 das 1.536 linhagens para 4 placas de cultura de 96 poços contendo 200 microlitros de meio seletivo; cultive as culturas a 20 graus Celsius até a saturação. Para semear as culturas saturadas de levedura, comece transferindo-as para um robô de manipulação de líquidos e Resus, suspendendo-as em um agitador magnético, dilua as culturas para aproximadamente um para 70 usando uma ferramenta robótica estéril de 96 pinos para pinar em 200 microlitros de água estéril.

Após limpar e esterilizar a ferramenta de pinos, aplique as culturas diluídas em placas de ágar. Em formato de 384 poços, transfira as placas para um incubador controlado por temperatura e umidificado, equipado com carrossel automático e escotilha de acesso. Para imagens das culturas, utilize um imagemador automatizado robótico, que retira repetidamente as placas do incubador, remove as tampas, transfere-as para um espaço uniformemente iluminado sob uma câmera de 35 milímetros e captura uma imagem com resolução de 5.184 por 3.456.

A resolução do pixel substitui a tampa e, em seguida, devolve as placas ao carrossel do incubador para rastrear as localizações das culturas nas placas e os tratamentos aplicados a elas. As placas são codificadas automaticamente com código de barras com base no nome do incubador, temperatura, número sequencial único do lote e posição no incubador. Os nomes das imagens são uma concatenação do nome da placa e do carimbo de data/hora e são gerados automaticamente no momento da captura da imagem.

As placas são frequentemente rotuladas manualmente para garantir que permaneçam na mesma ordem durante a transferência entre carrosséis de robôs. Os arquivos de metadados são arquivos de texto delimitados por tabulação, gerados manualmente. O arquivo de descrição experimental FT dois.

A tabela um é exclusiva para cada experimento, mas a descrição da biblioteca FT três, tabela um pode ser amplamente reutilizada. Uma vez construído, o experimento é descrito no arquivo de descrição experimental FT dois, tabela um, contendo colunas para código de barras ou nome da placa gerado automaticamente, carimbo de data/hora de início do experimento, tratamento da placa, conteúdo do meio sólido de ágar, nome da triagem, número da placa da biblioteca para bibliotecas com múltiplas placas e um número de quadrante de repetição para redução do formato de 1.536 poços para o formato de 384 poços. A biblioteca de cepas é descrita com um arquivo de descrição da biblioteca FT três, tabela um, indicando o genótipo cultivado em cada local de cultura.

Em cada placa de uma biblioteca, há as colunas quatro, nome da biblioteca, ORF, número da placa, linha da placa e coluna da placa, e uma coluna opcional de observações. Pode-se fornecer um arquivo opcional de nomes padrão de genes FT quatro, tabela um, descrevendo o nome padrão do gene associado a cada número sistemático de ORFY, identificando as linhagens que estão sendo analisadas. Esse arquivo contém duas colunas, ORF e nome do gene, para análise dos dados.

O fluxo de trabalho computacional de QFA exige acesso a uma estação de trabalho multi-core razoavelmente potente na qual esteja instalada a ferramenta de análise de imagens colonizer e o pacote QFAR, ambos documentados online, gratuitamente disponíveis e compatíveis com diversas plataformas operacionais. Execute o colonizer utilizando cada uma das imagens das placas capturadas como entrada, gerando um arquivo de saída do colonizer FT cinco, tabela um, para cada imagem; os arquivos de saída do colonizer especificam estimativas de densidade de cultura, área da cultura, forma e cor.

Para cada um dos 384 locais na placa de imagem, um nome de arquivo de saída é copiado automaticamente do nome do arquivo de imagem de origem. O pacote QFAR contém funções seldens para cursos temporais de cada cultura, a fim de ajustar modelos populacionais logísticos generalizados aos dados observados e gerar gráficos. Veja as figuras dois e três para exemplos.

Os valores dos parâmetros ajustados são escritos nos arquivos de parâmetros logísticos QFA. O pacote QFAR também contém funções para controle de qualidade. Colônias das bordas são descartadas devido à maior disponibilidade de nutrientes nas bordas da placa e à dificuldade com a análise de imagem.

Próximo às bordas das placas e culturas que falharam o SGA, bem como genótipos que exibem ligação com genes marcadores específicos da triagem, são excluídos da análise. Várias medidas quantitativas de aptidão são derivadas dos parâmetros do modelo populacional logístico para cada cultura. Estas incluem as taxas máximas de duplicação populacional e o número de divisões desde a inoculação até a saturação para cada conjunto de culturas replicadas e para cada definição de aptidão.

São calculadas várias estatísticas resumidas das estimativas de aptidão: média e mediana da aptidão, desvio padrão da aptidão e número de réplicas observadas. As estatísticas resumidas são exportadas para arquivos resumidos de aptidão QFA FT oito, tabela um, para análises adicionais. Por exemplo, cálculos de escores de interação genética FT nove, tabela um.

Esta figura mostra uma curva de crescimento típica em escala logarítmica OBTIDA POR 384 QFA. Culturas crescendo a 20 graus Celsius em ágar sólido, conforme quantificado pelo colonizador, com aumento na densidade celular primeiramente detectável após aproximadamente dois dias. Esse atraso é provavelmente um efeito combinado da fase de latência da cultura após a inoculação em meio sólido e de um limite inferior de detecção para a densidade celular.

Aqui, 308 curvas de crescimento semelhantes foram obtidas a partir de uma única placa. Observe que as linhagens que apresentaram uma linha plana estavam muito doentes ou mortas. Esta figura demonstra a comparação de duas telas QFA em todo o genoma para inferir forças de interação genética.

O pacote QFAR também inclui funções para produzir a figura da curva de crescimento anterior e para gerar listas classificadas de genótipos examinados e estimativas da intensidade da interação genética. Juntamente com um valor Q para a significância da GIS observada, uma vez dominado, um experimento completo de quatro réplicas em todo o genoma QF.A pode ser concluído em menos de três semanas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter organizado o rastreamento e a nomeação de todas as placas e imagens.

Todas as placas devem ser inoculadas e as amostras aplicadas na orientação e ordem corretas. A análise dos dados depende da exatidão dos arquivos de texto auxiliares elaborados pelo pesquisador experimental. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimar a aptidão de milhares de culturas microbianas independentes.

As aptidões são estimadas por meio da fotografia repetida de culturas com manchas, crescendo em placas de ágar sólido, conversão das imagens capturadas em estimativas de densidade celular e geração de curvas de crescimento. A modelagem matemática das curvas de crescimento fornece estimativas quantitativas de aptidão, que podem então ser usadas para deduzir relações funcionais entre produtos gênicos em escala genômica.