Name: Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a Análise Quantitativa de Fitness (QFA) usando abordagens experimentais e computacionais para estimar a aptidão de culturas microbianas em escala genômica. Este método melhora a precisão das medições de fitness em comparação com técnicas tradicionais.

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Agradecemos a todos os membros de nosso laboratório e do Centro de Biologia do Sistema Integrado de Envelhecimento e Nutrição (CISBAN) para apoio e discussões úteis. Este estudo foi apoiado pelo Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) e do Wellcome Trust (075294, 093088).

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

QFA é em muitos sentidos, um descendente directo de três estabelecidas bancada em escala de técnicas microbiológicas: cultura de diluição testes da série 9 no local, a determinação da curva de crescimento em culturas líquidas gasosas 9 e revestimento réplica 13. Estes três métodos são resumidos e comparados com QFA e outras técnicas de alto rendimento na Tabela 2. Considerando que os ensaios de diluição no local da série definir aptidão uma estirpe como a sua capacidade para formar colónias em uma série de culturas crescidas a partir de uma gama de diluições de inóculo, QFA aptidão estirpe medidas por observações repetidas de uma única cultura para construir uma curva de crescimento. A quantificação aptidão a partir de culturas única permite muitas estirpes mais a ser examinados simultaneamente, sob condições idênticas. Replicando matrizes de culturas permite testes repetidos de coleções de tensão, mais útil ao testar as diferenças de cultura de fitness em ambientes diferentes ou fundos genéticos. O protocolo apresentado QFAaqui usa equipamento caro robótico para replicar, inocular, incubar e placas de agar de imagem, apropriado para a observação de crescimento de milhares de culturas independentes (QFA robótico, Tabela 2). No entanto, desde QFA baseia-se na estabelecidas, técnicas de laboratório tradicionais, pode também ser efectuada muito mais barato, substituindo assistência robô com passos manuais (Manual QFA, Tabela 2). Manual do QFA envolve replicação e inoculação de culturas em ágar usando uma ferramenta de pino manual e transferência manual de placas de e para uma incubadora para a fotografia. O fluxo de trabalho mesma análise computacional pode ser aplicado para gerar curvas de crescimento a partir de qualquer desenho experimental. Estimativas QFA aptidão parecem ser relativamente preciso. Na Figura 4, as aptidões médios de quatro exemplo, agregados de funcionalmente deleções de genes relacionados são realçados. A proximidade de membros de cada classe de genes funcionalmente relacionados em duas inderentes origens genéticas (ura3Δ e CDC13-1) indica a reprodutibilidade das estimativas QFA fitness. Por exemplo, apenas 3 a deleção do gene (de um 4.300 possível) separar os três membros do complexo MRX conservada. Alto rendimento alternativas para QFA para testar as características de crescimento de estirpes microbianas incluem PIG 5,6, telas de concorrência em bibliotecas de código de barras 11,12 e telas de captura cinética de densidade óptica em leitores espectrofotométricos placa 10, que estão resumidos na Tabela 2 e descrito mais completamente em outro lugar 8 . QFA e placas de PIG, onde as culturas crescem em superfícies sólidas de ágar (ágar métodos baseados, Tabela 2) pode ser tratada de forma rápida e fácil pelo robô. Culturas de superfície sólida de agar são bem arejadas todo o crescimento e as células podem crescer em culturas fixas, permitindo que os micróbios sociáveis ​​a crescer em uma comunidade 14. Deixado intacto, comunidades microbianas umffect suas próprias micro-ambientes, toxinas secretoras, tais como etanol, e possivelmente de sinalização entre as células. No entanto, contínua mistura de culturas líquidas, necessárias para alcançar aeração adequada, artificialmente perturba comunidades microbianas e os seus micro-ambientes que possam afetar seus modos de crescimento. A contaminação cruzada é uma preocupação menor em métodos de ágar sólido uma vez que há menos oportunidades para líquidos salpicados transportando células entre as culturas. Se ocorrer contaminação por estrangeiros transportados pelo ar micróbios em ensaios de agar sólidos, que muitas vezes podem ser detectado por inspecção visual das placas de agar sólido e representaram ou removido. Rendimento QFA é significativamente mais elevada do que a de paralelas métodos líquidos de duas maneiras. Primeiro de tudo, no QFA (e SGA) placas, culturas inoculadas são embalados em conjunto de forma mais densa, dando culturas mais independentes por placa. Em QFA existem normalmente 308 culturas, não contando com culturas não experimentais de ponta (Figura 1) COMcomparação em paralelo culturas líquidas com 96 ou 100 culturas por placa. Em segundo lugar, as experiências QFA pode ser dimensionada para um número muito maior de pratos. Considerando que o número de placas analisados ​​numa experiência QFA único é limitada apenas pelo espaço disponível na sala de incubadora ou quente, a frequência de captura de imagem e mínima permitida a frequência de captura máxima alcançável, o número de placas em uma experiência de crescimento líquido é fortemente limitada pela capacidade do leitor de placas (tipicamente um ou dois pratos), ou do empilhador ligado ao leitor de placas (tipicamente 25-50 placas). Recentemente, realizou uma experiência totalmente automatizado QFA em 123 placas, cada uma com 308 culturas experimentais, dando 37,884 culturas simultâneas. Nós estimamos que o número máximo possível de culturas independentes que crescem em líquido é 96 (culturas / placa) x 50 (placas / empilhador) = 4800, que é de cerca de dez vezes menor do que o nosso rendimento QFA. Uma alternativa para as telas de cultura líquido é utilizar muitos automatizado grodispositivos wth em paralelo (Tabela 1 a partir da revisão por Blomberg 8), cada um tendo uma capacidade de um ou dois pratos. Controle de temperatura em cada dispositivo é independente, e assim as condições não são idênticas, mas assumindo que eles são, este fluxo de trabalho exigiria pelo menos 190 desses dispositivos para combinar QFA rendimento (assumindo 200 culturas líquidas por dispositivo). Em resumo, QFA é um fluxo de trabalho de alta qualidade que podem ser utilmente aplicadas para reunir fenótipos quantitativos de crescimento em ambos os experimentos de pequena escala e centraram-se alto rendimento telas. É flexível o suficiente para ser aplicado de forma eficaz com diferentes requisitos para o equipamento robótico. O componente computacional do fluxo de trabalho QFA baseia-se livremente disponível código fonte, aberto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pinos Manual pintool com 1/8 &quot;de diâmetro pinos </td></tr><tr><td> Misture-Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Instalado em Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 prateleira rotativa carrossel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Alta resolução manual de imagem </td></tr><tr><td> spImager com Cytomem </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Personalizado </td><td> Temperatura controlada alta resolução de imagem automatizado </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 com trocador de calor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Anexado ao spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Anexado ao Cytomat </td></tr><tr><td> spImager com carrossel </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Personalizado </td><td> Resolução de imagem automatizado de alta </td></tr><tr><td> Robot fixação ferramenta pinos para FP12pins </td><td> V &amp; P Científico </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pinos </td><td> V &amp; P Científico </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm de comprimento, 17 mm de comprimento exposto pin </td></tr><tr><td> Docking Station para a Ferramenta de Pin </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> Encaixe de estação de base removido para permitir a secagem do ventilador de pinos </td></tr><tr><td>Pin Escova de limpeza </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Ferramenta manual de pinos </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray com Tampa </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 bem estéreis placas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 bem estéreis tampas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Reagentes específicos e equipamentos.

um fluxo de trabalho análise quantitativa de fitness

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Análise Quantitativa de Fitness (QFA) é um fluxo de trabalho experimental e computacional para comparar as aptidões de culturas microbianas cultivadas em 1,2,3,4 paralelo. QFA pode ser aplicado a observações orientadas de culturas individuais, mas é mais útil para genoma interacção genética ou telas de drogas investigar até milhares de culturas independentes. O método central experimental é a inoculação de independentes, diluir líquidos culturas microbianas em placas de agar sólidos que são incubadas e regularmente fotografadas. Fotografias de cada ponto do tempo são analisados, produzindo estimativas quantitativas de células de densidade, que são utilizados para construir curvas de crescimento, permitindo que as medidas quantitativas aptidão para ser derivado. Aptidões de cultura podem ser comparados para quantificar e classificar forças de interacção genética ou sensibilidades de drogas. O efeito sobre a aptidão da cultura de quaisquer tratamentos adicionados em agar de substrato (por exemplo, moléculas pequenas, antibióticos ou nutrientes) ou aplicadas a placas de externoly (por exemplo, irradiação UV, temperatura) pode ser quantificado por QFA. O fluxo de trabalho QFA produz taxa de crescimento estima análoga aos obtidos por medição espectrofotométrica da paralelas culturas líquidas em leitores de placas de 96 poços ou de 200 poços. Importante, QFA tem rendimento significativamente superior em comparação com esses métodos. Culturas QFA crescer sobre uma superfície de agar sólido e são, portanto, bem arejadas durante o crescimento sem a necessidade de agitação ou agitação. Rendimento QFA não é tão alto quanto o de alguns matriz genético sintético (SGA) métodos de triagem 5,6. No entanto, uma vez que as culturas QFA são fortemente diluído antes de ser inoculadas em ágar, QFA pode capturar as curvas de crescimento mais completos, incluindo exponencial e fases de saturação 3. Por exemplo, as observações da curva de crescimento permitir tempos de duplicação de cultura a ser estimado directamente com alta precisão, como discutido anteriormente 1. Aqui apresentamos umaespecífica QFA protocolo aplicado a milhares de S. cerevisiae culturas que são automaticamente tratados por robôs durante a incubação a inoculação, e de imagem. Qualquer um destes passos automatizados pode ser substituído por um procedimento, o equivalente manual, com uma redução na taxa de transferência associada, e também apresenta um protocolo manual inferior de transferência. As mesmas ferramentas de software QFA pode ser aplicado a imagens capturadas em qualquer fluxo de trabalho. Temos uma vasta experiência QFA aplicando às culturas da levedura de brotamento S. cerevisiae, mas esperamos que QFA provará igualmente útil para examinar as culturas da levedura S. pombe e as culturas bacterianas.

Análise Quantitativa de Fitness (QFA) é uma série complementar de métodos experimentais e computacionais para estimar as aptidões cultura microbiana. QFA estima o efeito de mutações genéticas, drogas ou outros tratamentos aplicados sobre o crescimento micróbio. Experimentos de escala a partir da análise focalizada de uma única cultura a milhares de culturas paralelas podem ser projetados.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

A Análise Quantitativa de Aptidão (QFA) é um fluxo de trabalho experimental e computacional para comparar as aptidões de culturas microbianas cultivadas em paralelo1,2,3,4. ...

O objetivo deste procedimento é capturar, de maneira precisa e de alto rendimento, aptidões quantitativas de culturas microbianas em paralelo, em escala genômica. Isso é realizado primeiramente transformando uma biblioteca em matriz de colônias microbianas em placas de 96 poços e cultivando as culturas até a saturação. Em seguida, as culturas saturadas são diluídas em água e então depositadas em placas sólidas de ágar.Em seguida, as placas sólidas com ágar são fotografadas periodicamente até que o crescimento da colônia microbiana esteja saturado. Por fim, as fotografias da evolução temporal do crescimento de cada cultura são convertidas em medidas quantitativas da densidade celular, e as curvas de crescimento observadas são comparadas com modelos de crescimento, sendo resumidas em medidas quantitativas do condicionamento microbiano. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram evidências de interações genéticas, ao mostrar que linhagens microbianas apresentam diferentes níveis de aptidão quando combinadas com diferentes mutações ou cultivadas sob condições distintas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como métodos de pinagem de alta densidade, por exemplo SGA, ou experimentos de competição por códigos de barras, é que as medições de aptidão são mais precisas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de desenvolvimento de fármacos contra o câncer, como quais genes e processos são importantes na resposta ao dano no DNA e no controle do ciclo celular, além de compreender e traduzir tais pesquisas e microrganismos básicos na forma de alvos farmacológicos potenciais em células cancerígenas humanas. Embora este método possa fornecer informações sobre a função dos telômeros e visi.Também pode ser aplicado a outras áreas da biologia de leveduras ou, de fato, a qualquer área em que fenótipos de aptidão possam fornecer insights sobre a biologia microbiana. Esperamos que a QFA possa ser aplicada a muitos outros organismos microbianos para os quais existam bibliotecas em matriz. Por exemplo, povi e coli, orilla surplus A partir de culturas saturadas de overnight, foram semeadas até 96 cepas independentes de levedura em volumes de 200 microlitros de meio líquido rico.Em uma placa de cultura estéril de 96 poços, esterilize um replicador manual de 96 pinos com diâmetro de um oitavo de polegada mergulhando-o primeiro em etanol 100%, depois flamejando-o e deixando-o esfriar. Adicione 200 microlitros de água estéril nos poços de uma placa de 96 poços, vortexe culturas saturadas de levedura e dilua-as mergulhando a ferramenta de pinos esterilizada nas cepas três vezes. Em seguida, uma vez na placa contendo a água. Esterilize novamente a ferramenta de pinos e deixe-a esfriar antes de mergulhá-la três vezes nas culturas diluídas. Transfira então o pin para uma placa de ágar sólida.Após a incubação das placas de ágar, utilize um leitor robótico SP s e p para imagens manuais com finalidade de cultivo automatizado. Inicie com uma matriz retangular de linhagens independentes de levedura cultivadas em ágar sólido. Neste exemplo, as linhagens iniciais são o resultado do cruzamento de uma mutação condição-dependente com a coleção de deleções de levedura.1.536 culturas representando quatro réplicas de 384 linhagens independentes de levedura são cultivadas em placas SGA usando um robô com uma ferramenta estéril de transferência de 96 pinos com diâmetro de um milímetro, transferindo 384 das 1.536 linhagens para 4 placas de cultura de 96 poços contendo 200 microlitros de meio seletivo; cultive as culturas a 20 graus Celsius até a saturação. Para semear as culturas saturadas de levedura, comece transferindo-as para um robô de manipulação de líquidos e Resus, suspendendo-as em um agitador magnético, dilua as culturas para aproximadamente um para 70 usando uma ferramenta robótica estéril de 96 pinos para pinar em 200 microlitros de água estéril.Após limpar e esterilizar a ferramenta de pinos, aplique as culturas diluídas em placas de ágar. Em formato de 384 poços, transfira as placas para um incubador controlado por temperatura e umidificado, equipado com carrossel automático e escotilha de acesso. Para imagens das culturas, utilize um imagemador automatizado robótico, que retira repetidamente as placas do incubador, remove as tampas, transfere-as para um espaço uniformemente iluminado sob uma câmera de 35 milímetros e captura uma imagem com resolução de 5.184 por 3.456.A resolução do pixel substitui a tampa e, em seguida, devolve as placas ao carrossel do incubador para rastrear as localizações das culturas nas placas e os tratamentos aplicados a elas. As placas são codificadas automaticamente com código de barras com base no nome do incubador, temperatura, número sequencial único do lote e posição no incubador. Os nomes das imagens são uma concatenação do nome da placa e do carimbo de data/hora e são gerados automaticamente no momento da captura da imagem.As placas são frequentemente rotuladas manualmente para garantir que permaneçam na mesma ordem durante a transferência entre carrosséis de robôs. Os arquivos de metadados são arquivos de texto delimitados por tabulação, gerados manualmente. O arquivo de descrição experimental FT dois.A tabela um é exclusiva para cada experimento, mas a descrição da biblioteca FT três, tabela um pode ser amplamente reutilizada. Uma vez construído, o experimento é descrito no arquivo de descrição experimental FT dois, tabela um, contendo colunas para código de barras ou nome da placa gerado automaticamente, carimbo de data/hora de início do experimento, tratamento da placa, conteúdo do meio sólido de ágar, nome da triagem, número da placa da biblioteca para bibliotecas com múltiplas placas e um número de quadrante de repetição para redução do formato de 1.536 poços para o formato de 384 poços. A biblioteca de cepas é descrita com um arquivo de descrição da biblioteca FT três, tabela um, indicando o genótipo cultivado em cada local de cultura.Em cada placa de uma biblioteca, há as colunas quatro, nome da biblioteca, ORF, número da placa, linha da placa e coluna da placa, e uma coluna opcional de observações. Pode-se fornecer um arquivo opcional de nomes padrão de genes FT quatro, tabela um, descrevendo o nome padrão do gene associado a cada número sistemático de ORFY, identificando as linhagens que estão sendo analisadas. Esse arquivo contém duas colunas, ORF e nome do gene, para análise dos dados.O fluxo de trabalho computacional de QFA exige acesso a uma estação de trabalho multi-core razoavelmente potente na qual esteja instalada a ferramenta de análise de imagens colonizer e o pacote QFAR, ambos documentados online, gratuitamente disponíveis e compatíveis com diversas plataformas operacionais. Execute o colonizer utilizando cada uma das imagens das placas capturadas como entrada, gerando um arquivo de saída do colonizer FT cinco, tabela um, para cada imagem; os arquivos de saída do colonizer especificam estimativas de densidade de cultura, área da cultura, forma e cor.Para cada um dos 384 locais na placa de imagem, um nome de arquivo de saída é copiado automaticamente do nome do arquivo de imagem de origem. O pacote QFAR contém funções seldens para cursos temporais de cada cultura, a fim de ajustar modelos populacionais logísticos generalizados aos dados observados e gerar gráficos. Veja as figuras dois e três para exemplos.Os valores dos parâmetros ajustados são escritos nos arquivos de parâmetros logísticos QFA. O pacote QFAR também contém funções para controle de qualidade. Colônias das bordas são descartadas devido à maior disponibilidade de nutrientes nas bordas da placa e à dificuldade com a análise de imagem.Próximo às bordas das placas e culturas que falharam o SGA, bem como genótipos que exibem ligação com genes marcadores específicos da triagem, são excluídos da análise. Várias medidas quantitativas de aptidão são derivadas dos parâmetros do modelo populacional logístico para cada cultura. Estas incluem as taxas máximas de duplicação populacional e o número de divisões desde a inoculação até a saturação para cada conjunto de culturas replicadas e para cada definição de aptidão.São calculadas várias estatísticas resumidas das estimativas de aptidão: média e mediana da aptidão, desvio padrão da aptidão e número de réplicas observadas. As estatísticas resumidas são exportadas para arquivos resumidos de aptidão QFA FT oito, tabela um, para análises adicionais. Por exemplo, cálculos de escores de interação genética FT nove, tabela um.Esta figura mostra uma curva de crescimento típica em escala logarítmica OBTIDA POR 384 QFA. Culturas crescendo a 20 graus Celsius em ágar sólido, conforme quantificado pelo colonizador, com aumento na densidade celular primeiramente detectável após aproximadamente dois dias. Esse atraso é provavelmente um efeito combinado da fase de latência da cultura após a inoculação em meio sólido e de um limite inferior de detecção para a densidade celular.Aqui, 308 curvas de crescimento semelhantes foram obtidas a partir de uma única placa. Observe que as linhagens que apresentaram uma linha plana estavam muito doentes ou mortas. Esta figura demonstra a comparação de duas telas QFA em todo o genoma para inferir forças de interação genética.O pacote QFAR também inclui funções para produzir a figura da curva de crescimento anterior e para gerar listas classificadas de genótipos examinados e estimativas da intensidade da interação genética. Juntamente com um valor Q para a significância da GIS observada, uma vez dominado, um experimento completo de quatro réplicas em todo o genoma QF.A pode ser concluído em menos de três semanas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter organizado o rastreamento e a nomeação de todas as placas e imagens.Todas as placas devem ser inoculadas e as amostras aplicadas na orientação e ordem corretas. A análise dos dados depende da exatidão dos arquivos de texto auxiliares elaborados pelo pesquisador experimental. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimar a aptidão de milhares de culturas microbianas independentes.As aptidões são estimadas por meio da fotografia repetida de culturas com manchas, crescendo em placas de ágar sólido, conversão das imagens capturadas em estimativas de densidade celular e geração de curvas de crescimento. A modelagem matemática das curvas de crescimento fornece estimativas quantitativas de aptidão, que podem então ser usadas para deduzir relações funcionais entre produtos gênicos em escala genômica.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Uma metodologia eficiente e simples para a análise baseada em computador do comportamento de natação nematóide em líquido é descrito. O método requer pouco ou nenhum investimento para C. elegans laboratórios. O hardware utilizado é padrão, e o software de computador para a análise comportamental (CELEST) é uma fonte aberta um.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.

Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

Este protocolo descreve como manter o Experimento de Evolução de Longo Prazo (LTEE) de Escherichia coli realizando suas transferências diárias e congelamentos periódicos e como conduzir ensaios de competição para medir melhorias de aptidão em bactérias evoluídas. Esses procedimentos podem servir como um modelo para pesquisadores que iniciam seus próprios experimentos de evolução microbiana.

Transferências diárias, arquivamento de populações e medição da aptidão no experimento de evolução de longo prazo com Escherichia coli

Aqui, apresentamos um protocolo para converter dados transcriptômicos em uma visão mqTrans, permitindo a identificação de biomarcadores escuros. Embora não expressos diferencialmente em análises transcriptômicas convencionais, esses biomarcadores exibem expressão diferencial na visão mqTrans. A abordagem serve como uma técnica complementar aos métodos tradicionais, revelando biomarcadores antes negligenciados.

Gerando a Exibição de Regulação Transcricional de Recursos Transcriptômicos para Tarefa de Previsão e Detecção de Biomarcadores Escuros em Pequenos Conjuntos de Dados

Apresentamos um fluxo de trabalho flexível e extensível baseado em laboratório Jupyter para a análise não supervisionada de conjuntos de dados multiômicos complexos que combina diferentes etapas de pré-processamento, estimativa do modelo de análise fatorial multiômica e várias análises downstream.

Aplicação de análise fatorial multiômica não supervisionada para descobrir padrões de variação e processos moleculares ligados a doenças cardiovasculares

A tecnologia vestível tem baixo custo e oferece monitoramento conveniente de dados fisiológicos. No entanto, a precisão e a confiabilidade desses dispositivos exigem uma avaliação cautelosa para garantir sua eficácia e segurança para os usuários. Este relatório descreve o processo de validação de um smartwatch comercial no monitoramento de dados fisiológicos e atividade física.

Avaliando a precisão dos dados do smartwatch de fitness para monitoramento de atividade cardiovascular e física: um estudo de validação em saúde digital

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Aprenda a Análise Quantitativa de Fitness (QFA) usando abordagens experimentais e computacionais para estimar a aptidão de culturas microbianas em escala genômica. Este método melhora a precisão das medições de fitness em comparação com técnicas tradicionais.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

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