Name: Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a personalizar a morfologia de Aspergillus niger usando micropartículas de talco em biorreatores. Este método correlaciona características morfológicas com produtividade enzimática para otimizar processos biotecnológicos industriais.

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Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG), através da pesquisa colaborativa centro SFB 578 &quot;Do Gene ao Produto&quot; na Technische Universität Braunschweig, Alemanha.

1. Instalação do reator eo início do cultivo 4 cultivos de biorreatores no total são conduzidas. <ol><li> Usar uma 3 L bioreactor de tanque agitado com um volume de trabalho de 2,2 L para o cultivo de A. niger SKAn1015. </li><li> Despeje 72,6 g de glicose monohidratada no reator e preenchê-lo com 1,9 L de água deionizada. </li><li> Instale o equipamento reator, tais como 3 defletores, um dois seis pás do rotor da turbina de disco, um eletrodo de pH, uma entrada de gás com filtro de ar, um dedo de refrigeração, um resfriador de ar de exaustão com filtro de ar, um tubo de imersão para a amostragem estéreis com filtro de ar e mangueiras de entrada para empresas de médio, inóculo de ácido e base. </li><li> Autoclavar o reactor a 121 ° C durante 20 min. </li><li> Ligue o reactor com o reservatório de ácido-base (HCl 2 M, 2 M de NaOH) e as bombas correspondentes e configurar um valor de pH de 5,0 ± 0,05 com a unidade de controlo do pH. </li><li> Vincular o reactor com o sistema de resfriamento de água e colocar a camisa de aquecimentoem torno do recipiente de reactor. </li><li> Instalar o sensor de temperatura com a unidade de controlo correspondente e configurar uma temperatura de 37 ± 0,1 ° C na unidade de controlo da temperatura. </li><li> Coloque o motor agitação no topo do reator e trazê-lo em serviço com uma velocidade de agitação de 200 min -1. </li><li> Adicionar a estéril mínima de crescimento médio 11 calha uma das mangueiras de entrada estéreis (250 mL). Para a preparação médio de todos os componentes foram autoclavadas a 121 ° C durante 20 min e misturados. Para três cultivos os componentes incluem talco em pó (3MgO • 4SiO 2 • H2O) nas concentrações de 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) e 10 g / L (reactor 4). Antes de usar, re-suspender as partículas micro em 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 6,5) e adicioná-lo ao meio estéril. Em culturas de controlo (sem partículas), substituir a suspensão de partículas micro por 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 6,5). </li><li> Adicionar a suspensão de esporos (inoculo) ums preparado no WUCHERPFENNIG et. ai (2011) 11 calha uma das mangueiras de entrada estéreis (50 ml), de modo que a concentração de esporos eleva-se a 1x10 6 mL -1. A inoculação marca o início do cultivo (h = 0 h). </li><li> Iniciar o arejamento com uma taxa de 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Amostragem estéril após 24, 48 e 72 horas de cultivo <ol><li> Tome 50 ml de caldo de cultura estéril em um tubo de frasco. </li><li> Use amostra para determinação do peso da biomassa seca, β frutofuranosidase-atividade e análise microscópica. </li></ol> 3. Determinação da produção de biomassa seca após 24, 48 e 72 h de cultivo <ol><li> Amostras de biomassa estão a ser tomadas pelo menos em duplicado. </li><li> Peso um filtro de celulose com um micro escalas, após secagem no exsicador e colocar o filtro num funil de Buchner com bomba de vácuo ligada a jacto de água. </li><li> Filtrar um volume de amostra definido (por exemplo 10 mL) umand enxaguar o filtro com 10 mL de água desionizada para remover compostos de médio a partir da biomassa. </li><li> Rugas no filtro uma vez no meio, colocá-lo numa placa de Petri de vidro e colocá-lo em um secador de compartimento até constância de peso (pelo menos 24 h). </li><li> Arrefecer o filtro num exsicador e medir o peso. </li><li> Calcular o peso de biomassa seca como a diferença entre o peso do filtro com e sem biomassa seca dividida pelo volume da amostra utilizada. </li></ol> 4. Determinação da atividade enzimática extracelular de β-frutofuranosidase por DEUS / POD-ensaio após 24, 48 e 72 h de cultivo Armazenar as amostras em gelo constantemente enquanto trabalhava com eles. <ol><li> Filtrar 1,5 mL de suspensão de cultura calha um filtro de acetato de celulose, pressionando a suspensão de cultura com uma seringa através do filtro para um tubo de reacção. Armazenar o tubo de reacção a -20 ° C até utilização. </li><li> Para utilizar a mistura de reacção 20amostra uL e adicionar 200 uL de 1,65 M de sacarose dissolvido em tampão fosfato 0,05 M (pH 5,4) para iniciar a reacção a partir de sacarose em glicose. Cary a cabo a reacção, pelo menos, em duplicado. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 40 ° C durante 20 min num bloco de aquecimento. Parar a reacção por incubação a 95 ° C durante 10 min num bloco de aquecimento. Arrefece-se a mistura de reacção por armazená-lo em gelo e girar para baixo a água condensada por centrifugação a 13,000 g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Para explicar o pH e clivagem dependente da temperatura, de sacarose em glicose, efectuar um valor em branco, usando água de 20 uL deionizada em vez de 20 uL de amostra. </li><li> Para ter em conta para a glucose residual no caldo de cultura, efectuar um controlo negativo para cada amostra. Para esse fim uL utilização 20 da amostra e inactivar β frutofuranosidase-por aquecimento a 95 ° C durante 10 min antes de adicionar a sacarose e incubar como descrito no passo 4.3. </li><li> Diluir as amostras de tal modo que as medi seguintesured adsorção está na gama de valor calibrado. </li><li> Realizar todos os ensaios enzimáticos em triplicata. Aplicar 2 uL de amostra diluída numa placa de micro titulação bem. Aplicar uma gama padrão para a calibração na placa de titulação por cada micro usando 2 ul de soluções de glicose dez, com dez concentrações sabem diferente (a partir de 1 mM a 15 mM) em vez de 2 amostra uL. Para a zero pontos de calibração usar 2 uL de água deionizada em vez de 2 uL da amostra. </li><li> Adicionar 200 uL da solução de reagente a cada poço utilizando uma pipeta multi. </li><li> Incubar a mistura durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Armazenar a placa de micro titulação a 6 ° C até a medição (algumas horas no máximo). </li><li> Medir a absorção a 450 nm utilizando um de 96 poços Sunrise leitor de placas de micro eo Magellan software de recuperação de dados. Defina o tempo de mistura de até 5 seg. eo período de descanso até 1 seg. </li><li> Abra o gráfico resultado com uma planilha e construir uma curva de calibração usando a escala padrão: glucose = concentração uma absorção X + b </li><li> Calcular a atividade: atividade = (absorção valor X fator de diluição em branco) X a + b </li><li> Compreenda-se a actividade β frutofuranosidase-através do cálculo da diferença entre as actividades da amostra e do controlo negativa adequada. </li><li> Calcule a produtividade específica para o uso seguinte, tendo em conta o peso da biomassa seca e β frutofuranosidase-atividade 11. </li></ol> 5. Microscopia e Análise de Imagem automática após 72 h de cultivo <ol><li> O local de cerca de 3 mL de suspensão de cultura numa placa de Petri de plástico ediluí-los com uma solução fisiológica de cloreto de sódio até que as estruturas morfológicas são separadas. </li><li> Situar a placa de Petri sob um microscópio, que possui uma câmera integrada ou conectados. Adquirir e guardar a cerca de 100 imagens (Figura 2) das estruturas morfológicas por amostra. Preste atenção que, em cada imagem, pelo menos, um objeto é completamente retratado. </li><li> Abra todas as imagens de uma mesma amostra com o programa de processamento de imagens ImageJ 12. Converta as imagens a preto e branco, usando a ferramenta do processo &quot;Faça Binário&quot; (Figura 2). Para aplicar o comando para toda a série de imagens utilizar um código de macro como se segue. executado (, Fazer Binário &quot;) </li><li> Abra as imagens binárias processados ​​com ImageJ novamente. Calcule o diâmetro da forma fatores Feret, a área projetada, perímetro, circularidade, proporção, solidez circularidade und para cada imagem com a analisar &quot;Medição Set&quot; ferramenta. Para aplicar o comando para um series de imagens utilizar um código de macro como se segue. executado (&quot;8 bits&quot;); executado (&quot;Make Binary&quot;); executado (&quot;Scale Set ...&quot;, &quot;distância = X = conhecido pixels 1000 = 1 unidade = mM global&quot;); executado (&quot;Medidas definir ...&quot;, &quot;Exibir área de forma perímetro Féret limite redirect = decimal Nenhum = 3&quot;); executado (&quot;Analisar Partículas ...&quot;, &quot;size = circularidade 10000-Infinito = mostrar = 0,00-1,00 Esboços display&quot;); Determine X como o número de pixels que se correlaciona a 1000 mM através da construção de uma linha reta através de uma barra de escala. Correlacionar o número de pixels da linha recta com o comprimento da barra de escala na uM. </li><li> Abra o gráfico de resultado contendo valores de fator de forma para cada imagem com uma planilha. Calcular um número Morfologia como segue, para cada imagem. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Calcular o valor médio eo desvio padrão para o número Morfologia tendo em conta todas as imagens de uma amostra. </li&gt; <li> Usar uma representação gráfica e um programa de análise de dados para a correlação gráfica do número morfologia com a produtividade específica e determinar a relação matemática por regressão matemática. </li></ol> 6. Os resultados representativos Através da adição de talco micro partículas A. niger skan 1015 morfologia é alterada de uma morfologia pelete verdadeiro para uma morfologia dispersa ou mesmo micelial. Considerando que a morfologia pelete é exposto em condições padrão uma morfologia micelial é criado por suplementação de meio com 10 g / L de micro partículas de talco (Figura 4.). Paralelamente a atividade de β-frutofuranosidase aumenta cerca de 3 3-5 vezes. A suplementação de 1 ou 3 g / L de pó de talco conduz a uma morfologia dispersa, com uma actividade frutofuranosidase duplicou (Figura 4.). A morfologia das partículas micro dependente pode ser amplamente descritos pela MorNúmero phology que pode ser calculado usando os parâmetros determinados por análise de imagem automático. Pelotas perfeitamente redonda e lisa vai em imagens microscópicas aparecem como círculos perfeitos. Para tais partículas o número Morfologia tem um valor de 1. O menor fragmento de morfologia micelial pode ser simplificada como uma linha unidimensional rendendo um número Morfologia de 0. Todas as formas intermédias morfológicas como peletes irregulares alongadas ou aglomerados, por conseguinte, ter valores entre 0 e 1. Partículas relativamente grandes irá resultar em um alto, partículas fúngicas com uma grande superfície ou partículas alongadas, em um número de Morfologia bastante baixo 11. Em condições normais, o morfologia em reator 1 exibe um número em torno de 0,8 Morfologia. A morfologia no reactor 4 com 10 g / L de talco em pó possui um Mn cerca de 0,1. O número de Morfologia para os reactores 2 e 3, com concentrações de pó de talco de 1 e 3 g / L, situa-se entre estes extremos, demonstrando uma morfo dispersologia. Uma vez que a morfologia de partícula micro dependente está intimamente relacionado com a produtividade β frutofuranosidase, uma correlação matemática do número Morfologia e produtividade semelhante à Figura 5 é obtido. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do desenho experimental e do procedimento analítico. A. niger é cultivada (com ou sem micro-partículas) em um L 3 agitada bioreactor tanque durante 72 h. Após 24, 48 e 72 ha amostra é levada para a determinação do peso de biomassa seca e β frutofuranosidase-actividade, o que novamente são utilizados para o cálculo da produtividade específica. Após 48 h, a morfologia fúngica é examinada ao microscópio e caracterizado por análise de imagem digital. Parâmetros relevantes da análise de imagem são combinados para um número de Morfologia, que é matemático correlacionada com a produtividade específica. <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Passos de processamento de imagem para imagens geradas por microscopia de estruturas morfológicas de A. niger. Passo 1: aquisição de imagens por microscópio. Passo 2: melhoria da imagem, se necessário. Passo 3: binarização da imagem, em preto-e-branco (binário) gerado no ImageJ. Passo 4: a imagem binária é processado por objecto e indesejada são apagadas. Etapa 5: análise morfológica é realizada com o &quot;Analisar partículas&quot; função do open source programa ImageJ. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figura 3. Diferentes formas morfológicas de A. niger dependente da concentração de micro-partículas agregado. Com o aumento da concentração de micro-partículas adicionado o tamanho pelete pode ser precisamente decresceu para pequenas core-shell pelotas, rebanhos pequenos e micélio mesmo livremente dispersa. Morfologia da engenharia comopergillus niger SKAn1015 por micro partículas suplementação em cultura submersa. Sem micropartículas (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) e 40-50 g / L (T). Imagens foram feitas por microscopia de luz após 72 h de cultivo. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figura 4. Actividade frutofuranosidase na dependência de talco micro partículas concentração de 1 g / L (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) e 10 g / L (reactor 4). Reactor 1 não é suplementado com micro-partículas, aqui o cultivo é conduzido sob condições padrão. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figura 5. Boa correlação representativas (R 2 = 0,91) do Morfologianúmero ea produtividade específica. O número de Morfologia é traçada (abcissas) contra a produtividade específica (ordenada). Regressão não linear produz a correlação exponencial.

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</ol>

Não tenho nada para revelar.

A modificação da morfologia fúngica tem sido de interesse em biotecnologia desde há várias décadas. Diferentes estudos têm tentado variar os parâmetros do processo seleccionados tais como o valor de pH, de entrada de alimentação, temperatura, nutrientes médio ou concentração de inóculo 1, mas sofrem de controlo em vez imprecisa e incompleta da morfologia, elevados custos de energia, efeitos de inibição ou instabilidade do produto, em contraste, a suplementação de micro partículas permite uma engenharia precisa da morfologia fúngica através afinadas variação do tamanho de partícula e da concentração. Isso abre novas possibilidades de usar micro-partículas para otimização e de tailor-made de design da morfologia produção de alta na produção biotecnológica com A. niger e outros microorganismos filamentosos. A análise de imagem digital é um método reprodutível fácil de caracterizar a morfologia macro fungos. No entanto, a variedade de parâmetros para carac tamanho, forma e superfícieter de estruturas morfológicas descritas na literatura torna rápida avaliação da morfologia fúngica complicada. O número de Morfologia apresentado como uma combinação de parâmetros relevantes, evita esta deficiência, e pode ser usado não só para a caracterização completa de estruturas morfológicas, mas também para correlação matemática directo com a produtividade. Isso torna novamente uma estimativa de produtividade por meio da morfologia dado e, portanto, uma personalização da morfologia para o processo precisa possível. Usando o número Morfologia, é possível distinguir entre vários pelete e morfologias clump 4,5. Para o desenvolvimento ainda maior do número de Morfologia da consideração da dimensão fractal parece ser promissor. Uma dimensão fractal dá uma medida da complexidade e de massa de enchimento propriedades de um objecto 13 e é, por conseguinte, predestinados para a caracterização da morfologia global micelial. A creation de uma morfologia produção de alta micelial, no entanto, podem conduzir a problemas com o desempenho do processo especialmente no cultivo em larga escala, porque a forma de crescimento micelial foi previamente demonstrado que exibem viscosidades caldo de cultura muito maiores 2. Isto conduz a problemas com a transferência de calor e massa e formação de zonas não estagnadas mistos, as quais requerem uma entrada maior potência e tornar a cultura mais caro para operar 1. Por conseguinte, a relação entre a morfologia fúngica e viscosidade caldo de cultura deve ser considerada quando se muda a morfologia e ser incorporados em modelos adicionais.

personalização da aspergillus niger morfologia através da adição de partículas de talco micro

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

O fungo filamentoso A. niger é uma estirpe amplamente utilizado em uma ampla variedade de processos industriais de alimentos para a indústria farmacêutica. Uma das características mais intrigantes e muitas vezes incontrolável deste organismo filamentoso é a sua morfologia complexa. Ele varia de densas pelotas esféricas para micélios viscoso (Figura 1). Vários parâmetros de processo e ingredientes são conhecidos por influenciar morfologia fúngica 1. Dado que a produtividade ideal se correlaciona fortemente com uma forma específica morfológica, a morfologia de fungos freqüentemente representa o gargalo da produtividade na produção industrial. Uma abordagem para a frente e elegante para controlar com precisão a forma morfológica é a adição de inorgânicos insolúveis micro partículas (como silicato de magnésio hidratado, óxido de alumínio ou óxido de titânio de silicato) ao meio de cultura que contribui para a produção da enzima aumentado 2-6. Uma vez que existe uma obvUSIO correlação entre a morfologia da partícula micro dependente e produção da enzima que é desejável para matematicamente ligar a produtividade ea aparência morfológica. Portanto, uma descrição precisa e holística quantitativa morfológica se destina. Assim, apresentamos um método para gerar e caracterizar micro partículas dependentes estruturas morfológicas e correlacionar morfologia fúngica com a produtividade (Figura 1), que possivelmente contribui para uma melhor compreensão da morfogénese de microrganismos filamentosos. A estirpe recombinante A. niger SKAn1015 é cultivada por 72 h em um biorreator agitado L 3 tanque. Por adição de partículas de talco micro, em concentrações de 1 g / L, 3 g / L e 10 g / L antes da inoculação de uma variedade de estruturas morfológicas é reprodutivelmente gerado. As amostras estéreis são tomadas após 24, 48 e 72 horas para determinação do progresso o crescimento ea actividade da enzima produzida. Oproduto formado é a enzima de alto valor β frutofuranosidase-, um biocatalisador importante para a formação de neo-açúcar em alimentos ou na indústria farmacêutica, que catalisa a reacção entre outros, de sacarose a glucose 7-9. Portanto, a quantificação da glucose após a adição de sacarose implica a quantidade de produzidos β frutofuranosidase. Quantificação da glicose é feita por um GOD / POD-Assay 10, que é modificado para alto rendimento análise em placas de 96 poços de micro titulação. Morfologia fúngica após 72 horas é examinada ao microscópio e caracterizado por análise de imagem digital. Ao fazê-lo, os fatores de partículas forma de morfologia macro fungos como diâmetro Feret, a área projetada, perímetro, circularidade, proporção, solidez und circularidade são calculados com o open source de processamento de imagem programa ImageJ. Parâmetros relevantes são combinados para um número adimensional Morfologia (Mn) 11, que permite uma caracterização completa demorfologia fúngica. A estreita relação do número de Morfologia e produtividade são realçados por regressão matemática.

Um método para gerar e precisamente para caracterizar de forma abrangente morfologia do fungo filamentoso<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; É descrito, que permite que a correlação matemática da aparência morfológica e produtividade.

Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro

O fungo filamentoso A. niger é uma cepa amplamente utilizada em uma vasta gama de processos industriais, desde a indústria alimentícia até a farmacêutica. Um dos mais...

Este método gera e caracteriza estruturas morfológicas dependentes de micropartículas de fungos filamentosos, *Aspergillus niger*, para correlacionar a morfologia fúngica com a produtividade. Cultive *A. niger* com ou sem micropartículas em um biorreator agitado de três litros por 72 horas para calcular a produtividade específica. Colete amostras em pontos de tempo definidos e determine a biomassa, o peso seco e a atividade da vetifrutosase.Após 72 horas, examine a morfologia fúngica por microscopia e caracterize-a por meio de análise de imagem digital. Em seguida, combine parâmetros relevantes da análise de imagem em um número de morfologia que é matematicamente correlacionado com a produtividade específica. Em última instância, este método pode gerar com precisão e caracterizar de forma abrangente a morfologia do Aspergillus niger para uma melhor compreensão da morfogênese de microrganismos filamentosos.Aspergillus niger é uma importante cepa industrial na biotecnologia há várias décadas. Uma das características mais intrigantes e muitas vezes incontroláveis dos aspergillus, niger e espécies relacionadas é a morfologia complexa, que varia de pelotas esféricas densas a micélios viscosos, dependendo das condições de cultivo. A principal vantagem do nosso procedimento é que, com a adição de micropartículas, agora é possível adaptar a morfologia fúngica especificamente às necessidades do processo.Até o momento, nenhum outro método foi descrito para essa personalização da morfologia fúngica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o cultivo de micro-organismos filamentosos. Pois, para aplicação industrial, é crucial controlar a morfologia fúngica e também distinguir entre uma morfologia fúngica bem produtiva e outra pouco produtiva.Nosso protocolo fornece os meios para personalização e caracterização desejáveis da morfologia fúngica. Embora este método possa fornecer informações sobre a morfologia de Aspergillus niger, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos filamentosos, como cepas de Penicillium ou Strepto. Prepare quatro biorreatores para culturas estéreis conforme detalhado no protocolo complementar.Texto baseado na adição de micropartículas, cultive Aspergillus niger com diferentes morfologias. Após 72 horas, transfira 50 mililitros de amostras do caldo de cultura para um tubo Falcon.As amostras de biomassa devem ser coletadas pelo menos em duplicata após a secagem no dessecador; pese um filtro de celulose com as microbalanças. Coloque o filtro em um funil de Büchner com bomba de vácuo de jato de água conectada, filtre 10 mililitros da amostra seguidos por 10 mililitros de água desionizada para remover os compostos do meio da biomassa; dobre o filtro uma vez ao meio.Coloque-o em uma placa de Petri de vidro e em uma estufa com compartimentos até constância de peso. Transfira o filtro para um dessecador e deixe esfriar. Em seguida, meça o peso.Calcule o peso seco da biomassa por litro mediante o cálculo do peso, diferença dos filtros e subsequente divisão pelo volume da amostra para os ensaios enzimáticos de glicose oxidase e peroxidase. Armazene as amostras em gelo utilizando uma seringa, 1,5 mililitros. Passe a suspensão de cultura através de um filtro de acetato de celulose em um tubo de reação para realizar o ensaio beta fructo SASE.Com rigor, garantimos o sucesso utilizando duas amostras em triplicata para robustez estatística. Para iniciar o ensaio, adicione 20 microlitros da amostra ao tubo de ensaio; para controle da clivagem dependente de pH e temperatura da sacarose em glicose, utilize 20 microlitros de água desionizada em vez de 20 microlitros da amostra. Além disso, para cada amostra, prepare um controle negativo para detecção de glicose residual no caldo de cultura por meio do ensaio.20 microlitros de amostra inativada pelo calor. Para iniciar a reação da sacarose em glicose, adicione 200 microlitros de solução de sacarose 1,65 molar. Em pH 5,4, adicione 20 microlitros de amostra e incube todos os tubos de reação em um bloco aquecedor a 40 graus Celsius por 20 minutos. Interrompa a reação aquecendo a 95 graus Celsius por 10 minutos após resfriar os tubos em gelo.Centrifugue as amostras quando necessário, dilua as amostras para o ensaio de modo que a absorção medida esteja dentro da faixa de valores calibrados. Agora, para cada reação, adicione dois microlitros de amostra em uma placa de microtitulação. Realize as medições das amostras em triplicata.Prepare também uma curva padrão para 10 soluções de glicose variando de um milimolar a 15 milimolar. Para a calibração do ponto zero, use dois microlitros de água desionizada. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução reagente a cada uma.Incube bem por 10 minutos à temperatura ambiente. Meça a absorção em 450 nanômetros utilizando um leitor de microplacas Sunrise de 96 poços e o software de recuperação de dados Magellan. Abra o gráfico de resultados com uma planilha e construa uma linha de calibração de curva padrão.Calcule a atividade para cada amostra. Em seguida, compute a atividade da beta-frutofrase subtraindo os valores do controle negativo apropriado da atividade da amostra. Por fim, calcule a produtividade específica levando em consideração o peso seco da biomassa e a atividade da beta-frutofrase.Coloque três mililitros de suspensão de cultura em uma placa de Petri de plástico e dilua com solução fisiológica de cloreto de sódio para separar as estruturas morfológicas. A qualidade das imagens microscópicas é de importância excepcional. Para a análise subsequente das imagens, deve-se ter cuidado durante a etapa de diluição.Posicione a placa de Petri sob um microscópio com câmera integrada. Adquira e salve cerca de 100 imagens de estruturas morfológicas por amostra, garantindo que pelo menos um objeto esteja completamente representado em cada imagem. Prossiga da mesma maneira com placas contendo amostras de reatores diferentes, adquirindo novas imagens a cada vez.Observe a forma de crescimento morfológico diferente de amostras provenientes de reatores distintos cultivados com quantidades variadas de pó de talco adicionado. Em seguida, abra todas as imagens da mesma amostra no programa de processamento de imagens Image J. Utilizando a ferramenta de processo, torne-as binárias.Converta as imagens em preto e branco para aplicar o comando a uma série inteira de imagens. Em seguida, utilize um código macro, abra uma das imagens que contenha uma barra de escala. Trace uma linha reta sobre a barra de escala para determinar o número de pixels correspondentes a 2000 mícrons.Selecione a ferramenta de análise, defina a medição e escolha os fatores de forma, ferrets, diâmetro da área e perímetro. Utilize um código macro para processar uma série de imagens. Agora abra a planilha que apresenta os resultados dos valores do fator de forma.Para cada imagem, calcule um número de morfologia para cada imagem com todas as imagens de uma amostra. Calcule o valor médio do número de morfologia. Utilize um programa de criação de gráficos e análise de dados para plotar o número de morfologia em função da produtividade específica.Determine a relação matemática por regressão matemática mediante a adição de concentrações crescentes de micropartículas de talco. Oito Niger SKAN 10 15. A morfologia é alterada de uma morfologia de pelota verdadeira para uma morfologia dispersa ou mesmo mielóide, já que a morfologia de pelota esperada é exibida em condições padrão.Curiosamente, a morfologia micelial é criada pela suplementação do meio com 10 gramas por litro de micropartículas de talco. Concomitantemente, a atividade da beto fruto tase aumenta aproximadamente três vezes; a suplementação com um ou três gramas por litro de pó de talco leva a uma morfologia dispersa com atividade de frutose duplicada, utilizando parâmetros determinados por análise automática de imagens. A morfologia dependente de micropartículas pode ser descrita de forma abrangente pela morfologia.Observa-se que partículas com formato arredondado e perfeitamente circulares em pellets lisos aparecerão como círculos perfeitos em imagens microscópicas. O número de morfologia apresenta um valor próximo a um nas condições padrão. A morfologia no reator um exibe um número de morfologia em torno de 0,8.A morfologia no reator quatro com 10 gramas por litro. O pó de talco apresenta um número de morfologia em torno de 0,1. O número de morfologia para os reatores dois e três, com concentrações de pó de talco de um e três gramas por litro, situa-se entre esses extremos, demonstrando uma morfologia dispersa.Como a morfologia dependente de micropartículas está estreitamente relacionada com a produtividade das beta frutocíticas, existe uma boa correlação matemática entre morfologia, número e produtividade após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de biotecnologia explorassem mais a fundo a morfologia fúngica e, especialmente, sua relação com a produtividade. Após este procedimento de criação detalhada de tipos cruzados morfológicos específicos de fungos, outros aspectos importantes do cultivo de microrganismos filamentosos podem ser explorados.A morfologia micelial, por exemplo, é conhecida por ser muito mais viscosa do que a morfologia em palheta. Portanto, a produtividade geral do processo é prejudicada por problemas e pela purificação do produto desejado. Nosso número de morfologia ajudará a estabelecer modelos relacionados ao cultivo, à pro-teologia e a aprofundar nossa compreensão da morfologia fúngica em geral.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Problemas no processamento de amostras biológicas para observação de microscopia eletrônica de varredura incluem colapso celular, tratamento de amostras de microambientes úmidos e destruição celular. Protocolos de baixo custo e relativamente rápidos, adequados para a preparação de amostras desafiadoras, como meristemas florais, cistos de oomicetos e fungos (Agaricales), são compilados e detalhados aqui.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Inibição do crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxina em milho transgénicos que expressar o inibidor de α-amilase de Lablab purpureus L.

As deacetilases da histona da classe 1 (HDACs) como RpdA ganharam a importância como alvos potenciais para tratar infecções fungosas. Aqui nós apresentamos um protocolo para o enriquecimento específico de rpda Tap-Tagged combinado com um ensaio da atividade de HDAC que permita in vitro o teste da eficácia de inibidores da deacetilase do histona.

Enriquecimento de uma única etapa de um histone TAP-Tagged deacetilase do fungo filamentoso Aspergillus nidulans para o ensaio de atividade enzimática

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Este protocolo descreve um modelo de infecção de Aspergillus em larvas de zebrafish. Os esporos de aspergillus são microinjetados na cérebro traseira das larvas, e o tratamento químico é usado para induzir a imunossupressão. A progressão da infecção é monitorada através de uma configuração diária de imagens para monitorar o crescimento fúngico e as respostas imunológicas, bem como a enumeração de esporos vivos por placa de unidade formadora de colônias.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

O sistema de edição de genomas CRISPR-Cas9 é um editor de genomas fácil de usar que tem sido usado em espécies modelo e não-modelo. Aqui apresentamos uma versão baseada em proteínas deste sistema que foi usada para introduzir um codon stop prematuro em um gene de acasalamento de um fungo ascomiceto não-modelado.

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Aqui, descrevemos uma técnica simples e barata para inocular e observar fungos micorrízicos arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros.

Inoculação e observação de culturas micorrízicas arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros

Este protocolo apresenta um método prático usando Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo para abordar a distribuição desigual de partículas por meio da otimização da preparação de amostras, fornecendo uma referência para os pesquisadores elucidarem eficientemente estruturas macromoleculares usando microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM).

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Aprenda a personalizar a morfologia de Aspergillus niger usando micropartículas de talco em biorreatores. Este método correlaciona características morfológicas com produtividade enzimática para otimizar processos biotecnológicos industriais.

Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro

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