Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro

Este método gera e caracteriza estruturas morfológicas dependentes de micropartículas do fungo filamentoso, aspergillus, Níger, para correlacionar a morfologia fúngica com a produtividade. Cultive oito Níger com ou sem micropartículas em um tanque agitado de três litros, biorreator por 72 horas para calcular a produtividade específica. Colete amostras em pontos de tempo definidos e determine a biomassa, o peso seco e a atividade da veto fruto-sase.

Após 72 horas, examinar a morfologia fúngica por microscopia e caracterizar por análise de imagem digital. Em seguida, combine parâmetros relevantes de análise de imagem para um número de morfologia que esteja matematicamente correlacionado com a produtividade específica. Em última análise, este método pode gerar com precisão e caracterizar de forma abrangente a morfologia do aspergillus Niger para uma melhor compreensão da morfogênese de microrganismos filamentosos.

Aspergillus Nigel é um importante cavalo de trabalho industrial em biotecnologia há muitas décadas. Uma das características mais intrigantes e muitas vezes incontroláveis de aspers, Nigel e espécies relacionadas é que existe morfologia complexa que varia de pelotas esféricas densas a micélios viscosos, dependendo das condições de cultivo. A principal vantagem do nosso procedimento é que, por meio da adição de micropartículas, agora podemos adaptar a morfologia fúngica especificamente para as necessidades do processo.

Até o momento, nenhum outro método foi descrito para tal personalização da morfologia fúngica. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o cultivo de microrganismos filamentosos. Porque para aplicação industrial, é crucial controlar a morfologia fúngica e também distinguir entre uma morfologia fúngica bem produzida e uma morfologia fúngica pouco produtiva.

Nosso protocolo fornece os meios para a personalização e caracterização desejáveis da morfologia fúngica. Embora este método possa fornecer informações sobre a morfologia do aspergillus Nigel, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos filamentosos, como cepas de penicillium ou estrepto. Configure quatro biorreatores para culturas estéreis, conforme detalhado no protocolo anexo.

Texto baseado na adição de micropartículas, cultive aspergillus Níger com morfologia diferente. Após 72 horas, transfira 50 mililitros. Amostras de caldo de cultura em um tubo Falcon.

As amostras de biomassa devem ser colhidas, pelo menos, em duplicado, após secagem no exsicador, pesar um filtro de celulose com as microbalanças. Coloque o filtro em um funil de buchner com filtro de bomba de vácuo de jato de água conectado 10 mililitros de amostra seguido de 10 mililitros. Água deionizada para remover compostos médios da biomassa enruga o filtro uma vez no meio.

Coloque-o em uma placa de Petri de vidro e em um secador de compartimento até a constância do peso. Transfira o filtro para um dessecador e deixe esfriar. Em seguida, meça o peso.

Calcular o peso seco da biomassa por litro através do cálculo do peso, da diferença de filtros e da subsequente divisão pelo volume da amostra para os ensaios enzimáticos da glicose oxidase e da peroxidase. Armazene as amostras no gelo usando uma passagem de seringa de 1,5 mililitros. Suspensão de cultura através de um filtro de acetato de celulose em um tubo de reação Realiza o ensaio beta fruto SASE.

Meticulosamente, garantimos o sucesso com duas amostras triplicadas para robustez estatística. Para iniciar o ensaio, adicione uma amostra de 20 microlitros ao tubo de ensaio para controlar o pH e a clivagem dependente da temperatura da sacarose em glicose, use 20 microlitros de água deionizada em vez de uma amostra de 20 microlitros. Além disso, para cada amostra, preparar um controle negativo para glicose residual no caldo de cultura por ensaio.

20 microlitros de amostra inativada por calor Para iniciar a reação de sacarose em glicose, adicione 200 microlitros de solução de sacarose 1,65 molar. Em pH 5,4 a 20 microlitros de amostra, incube todos os tubos de reação em um bloco de aquecimento de 40 graus Celsius por 20 minutos. Pare a reação aquecendo a 95 graus Celsius por 10 minutos após resfriar os tubos no gelo.

Centrifugue as amostras quando necessário, dilua as amostras para o ensaio de modo que a absorção medida esteja na faixa de valores calibrados. Agora, para cada reação, adicione dois microlitros de amostra em uma placa de microtitulação. Bem realizar medições de amostra em triplicado.

Prepare também uma curva padrão para 10 soluções de glicose variando de um milimolar a 15 milimolar. Para a calibração do ponto zero, use dois microlitros de água deionizada. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução reagente a cada um.

Poço incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Meça a absorção em 450 nanômetros usando um leitor de microplacas de 96 poços e o software de recuperação de dados Magellan. Abra o gráfico de resultados com uma planilha e construa uma linha de calibração de curva padrão.

Calcule a atividade para cada amostra. Em seguida, calcule a atividade da beta frutose subtraindo os valores do controle negativo apropriado da atividade da amostra. Finalmente, calcule a produtividade específica fatorando o peso seco da biomassa e a atividade da beta frutosase.

Colocar três mililitros de suspensão de cultura numa placa de Petri de plástico e diluir com solução fisiológica de cloreto de sódio para separar as estruturas morfológicas. A qualidade das imagens microscópicas é de excepcional importância. Para a análise subsequente da imagem, deve ter-se cuidado durante a fase de diluição.

Posicione a placa de Petri sob um microscópio, que possui uma câmera integrada. Adquira e salve cerca de 100 imagens de estruturas morfológicas por amostra, garantindo que pelo menos um objeto seja completamente retratado em cada imagem. Continue da mesma maneira com pratos contendo amostras de diferentes reatores, adquirindo novas imagens a cada vez.

Observe a forma de crescimento morfológico diferente de amostras de diferentes reatores cultivados com diferentes quantidades de pó de talco adicionado. Em seguida, abra todas as imagens da mesma amostra no programa de processamento de imagem. Imagem J.Usando a ferramenta de processo, crie binário.

Converta as imagens em preto e branco para aplicar o comando a toda uma série de imagens. Use um código de macro em seguida, abra uma das imagens que contém uma barra de escala. Construa uma linha reta na barra de escala para determinar o número de pixels correlacionados a 2000 mícrons.

Selecione a ferramenta de análise, defina a medição e escolha os fatores de forma, furões, área de diâmetro e perímetro. Use um código de macro para processar uma série de imagens. Agora abra a planilha que representa os resultados dos valores do fator de forma.

Para cada imagem, calcule um número de morfologia para cada imagem com todas as imagens de uma amostra. Calcule o valor médio para o número de morfologia. Use um programa de gráficos e análise de dados para traçar o número de morfologia com a produtividade específica.

Determine a relação matemática por regressão matemática através da adição de concentrações crescentes de micropartículas de talco. Oito Níger SKAN 10 15. A morfologia é alterada de uma morfologia verdadeira de pellets para uma morfologia dispersa ou mesmo minha, pois a morfologia esperada de pellets é exibida em condições padrão.

Curiosamente, a morfologia micelial é criada pela suplementação do meio com 10 gramas por litro de micropartículas de talco. Concomitantemente, a atividade da Beto Frutotasia aumenta aproximadamente três vezes, a suplementação de um ou três gramas por litro de talco em pó leva a uma morfologia dispersa com uma atividade de frutose dobrada usando parâmetros determinados por análise automática de imagens. A morfologia dependente de micropartículas pode ser descrita de forma abrangente pela morfologia.

Nota numérica, perfeitamente redonda em pellets lisos em imagens microscópicas aparecerá como círculos perfeitos para tais partículas. O número de morfologia tem um valor que se aproxima de um em condições padrão. A morfologia no reator um exibe um número de morfologia em torno de 0,8.

A morfologia no reator quatro com 10 gramas por litro. O pó de talco apresenta um número de morfologia em torno de 0,1. O número de morfologia para os reatores dois e três com concentrações de pó de talco de um e três gramas por litro está entre esses extremos, demonstrando uma morfologia dispersa.

Como a morfologia dependente de micropartículas está intimamente relacionada com a produtividade de citos de beta frutose, há uma boa correlação matemática de morfologia, número e produtividade após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biotecnologia explorarem ainda mais a morfologia fúngica e, especialmente, sua relação com a produtividade. Seguindo este procedimento de criação detalhada de tipos morfológicos específicos de cruzamentos fúngicos, outros aspectos importantes do cultivo de microrganismos filamentosos podem ser explorados.

A morfologia micelial, por exemplo, é conhecida por ser muito mais viscosa do que a morfologia do palato. Portanto, a produtividade geral do processo é prejudicada por problemas e purificação do produto desejado. Nosso número de morfologia ajudará a estabelecer modelos relativos à cultura, pró-teologia e aprofundar nossa compreensão da morfologia fúngica em geral.