Name: Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a produzir vetores lentivirais para entrega de genes em células do sistema nervoso central. Este protocolo detalha cotransfecção em células 293T, purificação por ultracentrifugação e titulação para transdução eficiente de neurônios e astrócitos.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH Neuroscience Blueprint Núcleo de subvenção (P30 NS057105, BJS) para Washington University, programa, projeto Grant NS032636 (BJS) e pelo Centro de esperança para distúrbios neurológicos.

1. Embalagem de lentivirais Lentivirais são produzidos por co-transfecção de um vector de transferência lentiviral e outros plasmídeos necessários para a embalagem em células 293T pelo cálcio método de transfecção de fosfato. Usamos 10 100-mm pratos de cultura de tecidos neste protocolo. Ele pode ser escalado para cima ou para baixo dependendo de aplicações. A linha de células 293T é mantida em Dulbecco modificado por Eagles (DMEM) com glucose elevada (4500 mg / L), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. <ol><li> Semente 293T células em confluência de 30-40% a 10 100-mm pratos de cultura de tecidos (3 x 10 6 células / prato) em meio de cultura. Retornar as células a incubadora. </li><li> Após 20-24 h de cultura, verificar a densidade celular. As células devem ser de cerca de 80% de confluência no momento da transfecção. </li><li> Preparar um tubo de 50 ml. Adicionar 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) menos o volume total do DNA de plasmídeo seguinte. Adicionar 100 ug de transferência lentiviral plasmídeo (Figura 1), 58 ug pMDLg / pRRE, ug de pCMV-G 31, 25 ug pRSV-Rev, 600 uL 2M de CaCl2. Misture delicadamente. </li><li> Preparar um outro tubo de 50 ml. Adicionar 5 ml 2x HBS (HEPES 0,05 M, 0,28 M de NaCl, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,12). </li><li> Tomar a DNA-CaCl 2 por mistura de 10 ml pipeta e adicionar ao tubo contendo 2 x HBS, gota a gota, enquanto o tubo de vórtice. </li><li> Mantenha a reacção de precipitação à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. </li><li> Remover os pratos de cultura de incubadora. Misturar a reacção de precipitação bem em vórtice. Adicionar 1 ml de suspensão de células a cada 100-mm prato contendo. A suspensão deve ser adicionado lentamente, gota a gota enquanto suavemente agitando o meio no prato. Retornar estes pratos para a incubadora e deixar durante 5 h. </li><li> Remover o meio a partir da cultura. Adicionar 6 ml meio de cultura fresco, contendo 6 mM de sódio butyrate para cada prato. Retornar as culturas de incubadora. Após cultura durante a noite, se houver um repórter fluorescente no construto, verificar a expressão do gene repórter sob microscópio de fluorescência. Geralmente, mais de 80% das células expressam o gene repórter, se for conduzido por um promotor ubíqua (por exemplo, promotor de CMV). </li><li> Dois dias (40-44 h) após a transfecção, recolher o sobrenadante a partir de 10 pratos em 2 50 ml tubos (cerca de 30 ml cada tubo). Congelar o sobrenadante em -80 ° C congelador ou ir para a próxima etapa. </li></ol> 2. Concentração e purificação dos Vectores <ol><li> Centrifugar a recentemente colhido ou descongelado sobrenadante a 900 g (cerca de 2000 rpm) durante 10 min para remover todos os detritos de células no sobrenadante. </li><li> Anexar uma seringa de 60 ml de uma 0,2-uM filtro de seringa SFCA. Transferir o sobrenadante a partir de 50-ml tubo para a seringa. Filtrar o sobrenadante para um tubo de centrífuga de polialómero. </li><li> Tome 5 ml de sacarose a 20% (preparada em PBS) para cima em uma pipeta de 5 ml. Inserira pipeta para o fundo do tubo de centrífuga contendo sobrenadante. Lentamente, adicionar a solução de sacarose sob o sobrenadante vetor. Repita essas etapas para o sobrenadante de outro tubo. </li><li> Centrifugar o sobrenadante a 11.000 rpm e 4 ° C durante 4 h com rotor Beckman SW28 balanço. </li><li> Remover o sobrenadante. Adicionar 150 uL Lactose 4% (preparado em PBS) a cada tubo de centrífuga. Ressuspender as peletes. </li><li> Transferir o vector concentrado a partir de todos os tubos de centrifugação para um tubo de 1,5 ml. Deixar o tubo em gelo durante 15 min. </li><li> Misture a suspensão vetor por pipetagem. Girar com microcentrífuga a toda a velocidade (cerca de 16.000 g) durante 1 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml nova. Divida a amostra final em alíquotas de 20 ul e guardou no congelador -80 ° C. </li></ol> 3. Titulação dos Vectores <ol><li> Semente 5 x 10 4 / poço de células HT1080 em 12 poços da placa em meio DMEM 1 ml suplementado com FBS 10%. </li><li> Depois overnight cultura, contagem de células de um bem e marcar o número de células. </li><li> Fazer 5-vezes diluição em série (1:5, 1: 25; 1:125; e 1:625) do vector concentrada com meio de cultura. Adicionar I uL de cada vector diluído aos poços separados. As amostras podem ser repetido para aumentar a precisão. </li><li> Adicionar 1 ml de 4 mg / ml de polibrene (Hexadimetrina Brometo) em cada poço contendo vector e para dentro de um poço sem vector. Misturar agitando a placa. Retornar à incubadora durante 48 h. </li><li> Remover meio dos poços de cultura de células. Lavar cada poço com PBS. Adicionar 250 uL 1x solução tripsina-EDTA para as células. Quando as células são separadas (3-5 min), adicionar 1 ml meio de cultura. Ressuspender as células por pipetagem. Transferir suspensão de células a 1,5 ml de tubos de centrifugação. </li><li> Centrifugar a 900 g durante 6 min. Para vetores com um gene repórter fluorescente (GFP, por exemplo), vá para o passo 3.7 para análise FACS. Para vetores sem um repórter, vá para o passo 3,8 para qPCR em tempo real. </li><li> Para vectores contendo um fluogene repórter fluorescentes, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 300 uL de formaldeído de 3,7% em PBS. Determinar a percentagem das células positivas repórter por análise de FACS. O título será representado como unidades de transdução por mililitro concentrada vector (TU / ml). </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Por exemplo, se 1 x 10 5 células foi transduzida com 1/25 uL (0,04 uL) vector e células de 30% são repórter positivo, a título será: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Apenas utilizar as diluições cair em uma relação linear entre a percentagem de células positivas ea quantidade de vector adicionado para calcular título. O título final deve ser uma média de os títulos obtidos a partir de transduções de pelo menos 2 diferentes quantidades do vector. <ol start="8"><li> Para vectores semgene repórter fluorescente, extrair o ADN genómico de células HT1080, utilizando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Amplificar sequência do vector no DNA genómico usando ABI Prism 7000 Sistema de Detecção de Sequência (Applied Biosystems) com primers (em HIV-1 região PBS / psi 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;e 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, e TaqMan sonda 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Gene de albumina que é um gene de cópia única no genoma (2 cópias / célula) foi também amplificado com os iniciadores 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;e 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;, e sonda 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3 &quot;como um controle interno. Determinar os números de cópias do vector e de albumina por PCR em placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabrico com o seguinte programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, e 35 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 2 min. Dez diluições em série de plasmídeos de concentração conhecida (representado como cópianúmero) contendo as sequências do molde deve também ser amplificado para criar uma curva padrão para quantificação de amostras desconhecidas. O título será representado como unidades de integração por mililitro concentrada vector (UI / ml). </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Transdução de Culturas neocortical Culturas neocorticais contendo ambos os neurónios e glia são preparados a partir de córtices rato usando um processo de revestimento de dois passos, como descrito anteriormente 18. Neocórtices obtidos a partir de ratos fetais em 14-16 dias de gestação são plaqueadas sobre uma monocamada previamente estabelecido glial em MEM suplementado com 10% de FBS, 20 mM de glucose e 2 mM de glutamina em 24 poços da placa de cultura de tecidos. <ol><li> Após 5 dias in vitro, adicionam-se 10 uM de citosina arabinósido (Ara-C) no neoccultura ortical para inibir não neuronais a divisão celular. Continuar a cultura das células durante 2 dias. </li><li> Meio de cultura quente em 37 ° C banho de água durante 5-10 min. Substituir Ara-C contendo o meio com meio de cultura fresco (500 ul / poço). </li><li> Adicionar vector com desejado MOI (multiplicidade de infecção; a razão entre o número de partículas de vector com o número de células alvo) à cultura. Continuar a cultura durante 24 h. Usamos MOI de 1-10 (geralmente 5) em culturas primárias corticais. </li><li> Substituir o meio de cultura com meio fresco. Continuar a cultura. Se houver um gene repórter na construção vector, vá células sob microscópio fluorescente 2 dias após a transdução. A expressão do gene repórter será visível em neurónios 2-7 após a transdução, dependendo do desenho vector e da dose utilizada. </li></ol> 5. Os resultados representativos Os títulos de lentivirais produzidos com esta gama de protocolo 10 8 -10 10 UI / ml, which são adequados para a transdução de uma variedade de tipos de células a partir de CNS tanto in vitro como in vivo. Tabela 1 ea Figura 2 mostram um resultado representativa, utilizando os vectores produzidos por este protocolo. Nós transduzidas murinos culturas neocorticais com lentivirais expressando a proteína verde fluorescente (GFP), controlada pela sinapsina promotor (SYN) ou proteína glial fibrilar ácida promotor (GFAP). Sete dias após a transdução, foi realizada a imunocoloração para neurónios do rótulo e astrócitos com anticorpos anti-NeuN e anti-GFAP, respectivamente. Como mostrado na tabela 1 e fig. 2A, após a transdução com o vector portador do promotor de sinapsina, mais de 90% dos neurónios (NeuN + células) expressa GFP e nenhum astrócitos (GFAP + células) expressar o gene repórter. Quando promotor GFAP é usado na construção vector (Fig. 2B), cerca de 80% de astrócitos (GFAP + células) express GFP; todos GFP + de células são astrócitos como confirmado por colocalização com GFAP e à ausência de expressão da GFP em células NeuN-rotulados. Estes resultados demonstram que lentivirais são muito eficientes para entregar transgenes para as células de CNS e célula-específica expressão do gene pode ser alcançada quando promotores apropriados são utilizados. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática do HIV baseados lentivirais e os plasmídeos de empacotamento. O HIV-1 provírus é mostrado na parte superior. Os elementos para a produção de vector são separados em quatro diferentes plasmídeos. A transferência lentiviral plasmídeo contém um LTR 5 &#39;híbrido no qual a região U3 é substituído com o citomegalovírus (CMV) promotor, o sinal de empacotamento (ψ), a sequência RRE, o tracto polypurine central (CPPT), um gene de interesse (por exemplo um repórter fluorescente), juntamente com um promotor de escolha, ea LTR 3 &#39;na qual osequências reguladoras cis são completamente removidos a partir da região U3. pMDLg / pRRE contém as proteínas gag e pol e genes sequência RRE de HIV-1 sob o controlo do promotor de CMV. pRSV-Rev contém a sequência de codificação de Rev conduzida pelo promotor RSV. pCMV-G contém o gene da proteína VSV-G sob o controlo do promotor de CMV. PA indica o sinal de poliadenilação do gene β-globina humana. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Figura 2. Expressão de genes repórter em cultura mista rato neocortical transduzidas com vectores que transportam lentivirais de células específicas do tipo promotores. As culturas foram transduzidas com LV-SYN-GFP (A) ou LV-GFAP-GFP vectores (B) com uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as células foram imunocoradas com um anticorpo anti-NeuN ou anti-GFAP. Os painéis superiores mostram fluorescência da GFP, os painéis mostram média de imunocoloração e painéis inferiores são mescladas imagens (GFP: verde; NeuN ou GFAP: vermelho). </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vetor </td><td> GFP + de células em neurónios </td><td> GFP + em astrócitos </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92,2 ± 7,3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78,3 ± 11,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação de expressão da GFP em murinos culturas neocorticais transduzidas com vectores que transportam lentivirais diferentes promotores de um. um culturas murinos neocorticais (5 x 10 5 / poço em placas de 24 poços) foram transduzidas com LV-SYN-GFP ou LV-GFAP-GFP a uma MOI de 5. Sete dias após a transdução, as culturas foram fixadas e imunocoradas para NeuN ou GFAP. O número de GFP e NeuN / GFAP células que expressam foram contados em imagens a partir de 10 campos por condição experimental. Os valores representam a percentagem de neurónios (NeuN + células) ouastrócitos (GFAP + células) que também expressaram o gene repórter da GFP. Os valores apresentados são médias ± DP de três experimentos independentes.

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<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-%7Bkappa%7DB+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li>
<li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoters+and+serotypes%3A+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, nós mostramos a produção de lentivirais e aplicação destes vectores em culturas neocorticais. Nós demonstramos eficiente e de células de transdução de tipo específico com os vectores produzidos por estes métodos. Quando o promotor sinapsina é usado, a expressão da GFP é estritamente neurónio específico. Quando o promotor GFAP é usado, expressão da GFP é exclusivamente em astrócitos. Se nenhuma célula expressão de tipo específico é requerido, um promotor ubíqua pode ser usado. Encontramos tanto ubiqutin ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Butirato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimetrina brometo de (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> As células 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> Células HT1080 </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm tecido culturprato e </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ em polyallomoer tubo de centrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0,2 mícron filtro de seringa </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

produção de lentivirais para células transdução do sistema nervoso central

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

De entrega de genes eficiente no sistema nervoso central (SNC) é importante no estudo funções de genes, modelando doenças neurológicas e desenvolvimento de abordagens terapêuticas. Lentivirais são ferramentas atraentes na transdução de neurónios e outros tipos de células no SNC como eles transdução ambas as células em divisão e não-dividindo, a expressão de transgenes apoio sustentado, e têm uma capacidade relativamente grande de embalagem e baixa toxicidade 1-3. Lentivirais têm sido usados ​​com sucesso na transdução muitos tipos de células neurais in vitro e em animais 4-6 7-10. Grandes esforços têm sido feitos para desenvolver lentivirais com segurança biológica melhorada e eficiência para entrega de genes. As correntes de terceira geração replicação defeituosa e auto-inativadora (SIN) lentivirais estão representados na Figura 1. Os elementos necessários para embalagem vetor são divididos em quatro plasmídeos. No trans lentiviralfer plasmídeo, a região U3 na repetição do 5 &#39;terminal longa (LTR) é substituído com um promotor forte de outro vírus. Esta modificação permite a transcrição da sequência de vector independente do HIV-1 da proteína Tat que é normalmente necessária para a expressão do gene HIV 11. O sinal de empacotamento (Ψ) é essencial para a encapsidação e do elemento de Rev-responsivo (RRE) é necessária para a produção de vectores de título elevado. A central polypurine trato (CPPT) é importante para a importação nuclear do ADN do vector, uma característica necessária para transduzir células não-divisórias 12. No LTR 3 &#39;, as sequências de cis-reguladoras são completamente removidos a partir da região U3. Esta supressão é copiado para LTR 5 &#39;após a transcrição reversa, resultando em inactivação transcricional de ambos os LTRs. PMDLg plasmídeo / pRRE contém HIV-1 gag / pol genes, que fornecem as proteínas estruturais e transcriptase reversa. pRSV-Rev codifica rev, que se liga ao RRE para exportação de ARN eficiente a partir do núcleo. pCMV-G codificaa glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), que substitui o HIV-1 env. VSV-G expande o tropismo dos vectores e permite a concentração por meio de ultracentrifugação 13. Todos os genes que codificam as proteínas acessórias, incluindo vif, vpr, Vpu, e Nef são excluídos no sistema de embalagem. A produção e manipulação de lentivirais deve ser realizada de acordo com as orientações do NIH para pesquisa envolvendo DNA recombinante ( <a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a> ). Uma aprovação do Comitê de Segurança Institucional indivíduo Biológica e Química pode ser necessária antes de usar lentivirais. Lentivirais são geralmente produzidas por co-transfecção de células 293T com transferência lentiviral plasmídeo e os plasmídeos auxiliares que codificam as proteínas necessárias para a embalagem vector. Muitos plasmídeos de transferência lentivirais e plasmídeos auxiliares pode ser obtido a partir de Addgene, um nãoFins lucrativos repositório plasmídeo ( <a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Algumas linhas celulares estáveis ​​de embalagem têm sido desenvolvidos, mas esses sistemas proporcionam menos flexibilidade e sua eficiência de embalagem geralmente decresce ao longo do tempo 14, 15. Os kits de transfecção comercialmente disponíveis podem suportar uma elevada eficiência de transfecção 16, mas podem ser muito caro para preparações de vector de grande escala. Métodos de cálcio precipitação de fosfato de fornecer transfecção altamente eficiente de células 293T e, assim, proporcionar uma abordagem confiável e de custo eficaz para a produção de vetor lentiviral. Neste protocolo, que produzem lentivirais por cotransfecção de células 293T com quatro plasmídeos baseados no princípio precipitação com fosfato de cálcio, seguido de purificação e concentração com ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose a 20%. Os títulos de vector são determinados por fluorescência-activated separação de células (FACS) analYsis ou por qPCR tempo real. A produção e titulação de lentivirais neste protocolo pode ser terminado com 9 dias. Nós fornecemos um exemplo de transdução esses vetores em murinos culturas neocorticais que contenham ambos os astrócitos e neurônios. Nós demonstramos que lentivirais suporte de elevada eficiência de transdução e expressão génica em células de tipo específico de células primárias de cultura a partir de CNS.

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de células<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

A entrega eficiente de genes no sistema nervoso central (SNC) é importante para o estudo de funções gênicas, a modelagem de doenças neurológicas e o desenvolvimento de...

O objetivo geral deste procedimento é produzir vetores lentivirais para a entrega de transgenes em células do sistema nervoso central. Isso é realizado primeiramente pela transfeção simultânea de plasmídeos de transferência lentiviral e plasmídeos auxiliares em células 293T, utilizando o princípio da precipitação por fosfato de cálcio. O segundo passo do procedimento consiste na purificação e concentração do sobrenadante do vetor por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose a 20%.O terceiro passo é determinar o título do vetor por meio de análise por fax ou PCR quantitativa em tempo real. O passo final do procedimento é transduzir o vetor nas células-alvo. Em última instância, a eficiência de transdução na especificidade do tipo celular pode ser demonstrada por imunomarcação das células-alvo que expressam o transgene.A principal vantagem da nossa técnica em comparação com alguns outros métodos existentes, como o uso de kits comerciais, é que ela oferece uma abordagem econômica, eficaz e confiável para a produção de vetores lentivirais. Assim, este método pode fornecer subsídios para a entrega de transgenes em células do SNC. Também pode ser aplicado a outros tipos celulares in vivo e in vitro. Os vetores lentivirais são produzidos pela cotransfecção de plasmídeos em células 293T.A linhagem celular 293T deve ser mantida em DMEM modificado para este experimento. Semee dez placas de cultura de cem milímetros com células 293T em uma confluência de 30 a 40%. Após 20 a 24 horas de cultivo, as células devem atingir cerca de 80% de confluência e, portanto, estar prontas para transfeção.Para a transfeção, adicione todos os plasmídeos necessários a um tubo de 50 mililitros e complete o tubo até 4,4 mililitros com TE 7 9 10. Em seguida, adicione 0,6 mililitros de cloreto de cálcio 2 molar e misture o tubo suavemente. Prepare outro tubo de 50 mililitros com cinco mililitros de HBS 2X. Adicione a mistura de plasmídeo e cloreto de cálcio ao HBS gota a gota, enquanto vórtexa a mistura.Agora, durante os próximos 30 minutos, permita que um precipitado se forme à temperatura ambiente. Retire as placas de cultura do incubador e, após a formação do precipitado em suspensão, adicione um mililitro da suspensão em cada placa gota a gota, utilizando um vórtex.Enquanto gira suavemente o meio no recipiente. Agite o tubo brevemente antes de transferir a suspensão para o próximo recipiente. Devolva as placas carregadas ao incubador.Deixe os plasmídeos transfectarem as células por cinco horas. Após cinco horas, substitua o meio por seis mililitros de meio contendo seis milimolar de butirato de sódio.Em seguida, retorne as culturas ao incubador no dia seguinte. Se um repórter fluorescente expresso de forma ubíqua foi utilizado, verifique sua expressão em um microscópio fluorescente. Geralmente, mais de 80% das células expressam o gene repórter.Dois dias após a transfeção, colete o SANE das placas em dois tubos de 50 mililitros, o que deve resultar em cerca de 30 mililitros por tubo. Neste ponto, o sobrenadante pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius antes de prosseguir. Comece centrifugando o sobrenadante coletado das placas de transfeção para remover qualquer debris celular.Enquanto isso, acople uma seringa de 60 mililitros a um filtro de seringa SFCA de 0,2 mícron. Em seguida, decante o sobrenadante para a seringa. Então, empurre o êmbolo para filtrar o sobrenadante em um tubo de centrífuga polimérico de 38 mililitros que se encaixe em um rotor oscilante.Agora, carregue uma pipeta de cinco mililitros com cinco mililitros de sacarose 20% em PBS. Insira a pipeta até o fundo do tubo de centrífuga contendo o sobrenadante e adicione lentamente a solução de sacarose sob o sobrenadante do vetor. Em seguida, centrifugue o SNAT por quatro horas em um Beckman SW 28; imediatamente após a centrifugação, decante e descarte o sobrenadante e reconstitua o precipitado contendo o vetor em 150 microlitros de lactose 4% em PBS. Reúna todas as suspensões em um único tubo de 1,5 mililitro e deixe esfriar por 15 minutos em gelo.Em seguida, homogeneíze a suspensão por pipetagem e, depois, centrifugue-a em um microcentrífuga em velocidade máxima por um minuto; transfira o sobrenadante para um tubo novo de 1,5 mililitro e divida o vetor concentrado em alíquotas de 20 microlitros para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para titular o vetor, semeie primeiramente células HT1080 em uma placa de 12 poços com um mililitro de DMEM suplementado em cada poço. Após uma cultura noturna, conte as células de um poço e determine o número celular.Agora, prepare uma série de diluições seriadas cinco vezes do vetor concentrado em meio de cultura. Em seguida, adicione um microlitro de cada vetor diluído em um poço separado; as amostras podem ser duplicadas, mas deixe pelo menos um poço sem vetor como controle negativo. A seguir, adicione um microlitro de poli cérebro a cada poço e agite suavemente a placa para misturar.Retorne a placa ao incubador por 48 horas. Dois dias depois, remova o meio de cada poço e lave as células com PPS. Em seguida, tripsinize as células e re-suspenda-as em um mililitro de meio de cultura, pipetando e transferindo as suspensões celulares para tubos de 1,5 mililitro e centrifugando-as para coletar os pellets celulares.Se os vetores contiverem um gene repórter fluorescente, ressuspenda o pellet em 300 microlitros de formaldeído 3,7% em PBS, em seguida determine a porcentagem de células positivas por análise de fax e calcule o título. Se um gene repórter fluorescente não foi utilizado, extraia o DNA genômico das células usando um kit comercialmente disponível. Em seguida, amplifique a sequência do vetor utilizando PCR em tempo real.Crie uma curva padrão amplificando a sequência modelo de um plasmídeo com número de cópias conhecido em uma série de diluições dez vezes consecutivas. Em seguida, calcule o título como unidades de integração por mililitro. Prepare culturas de neocórtex contendo neurônios e glia a partir de córtices de camundongos utilizando um procedimento em dois passos previamente descrito em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com MEM suplementado após cinco dias.In vitro, adicione 10 micromolares de RSC para inibir a divisão de células não neuronais. Em seguida, continue o cultivo por dois dias, tomando cuidado para que as células não sequem durante as trocas de meio. Após dois dias, substitua o meio contendo RC por meio quente recém-preparado, na quantidade de meio mililitro.Em seguida, adicione o vetor na MOI desejada ao cultivo e continue a cultura das células por 24 horas. Após 24 horas, troque o meio e, após 48 horas, se houver um gene repórter, verifique as células sob microscópio fluorescente; a expressão do repórter deve ser visível em neurônios de dois a sete dias após a transfeção. Dependendo do desenho do vetor e da dose, os títulos de vetores lentivirais produzidos com este protocolo variam de 10⁸ a 10¹⁰.Unidades de integração por mililitro, o que é adequado para a transdução in vitro ou in vivo de muitas células do SNC. Assim, culturas de neocórtex murino foram transduzidas com vetores lentivirais expressando GFP controlado por um promotor de sinapsina ou pelo promotor A-G-F-A-P. Sete dias após a transdução, a imunohistoquímica foi realizada no vetor que continha o promotor de sinapsina.Além de 90% dos neurônios identificados como células positivas para novo fim expressaram GFP, enquanto nenhuma astrócito identificado como células positivas para GFAP expressou. O gene repórter em células transduzidas com os vetores contendo o promotor A-G-F-A-P. Cerca de 80% dos astrócitos expressaram GFP, mas nenhum dos neurônios novos e marcados expressou GFP.Esses resultados demonstram que vetores lentivirais são altamente eficientes na entrega de transgenes para células do SNC. Além disso, a expressão gênica específica de células pode ser alcançada quando promotores apropriados são utilizados. Vetores virais lentivirais têm sido amplamente utilizados para superexpressar e silenciar genes de interesse no sistema nervoso central.Nosso protocolo deve ser útil para outros pesquisadores que desejam utilizar esses métodos em seus laboratórios.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Este protocolo descreve um método para alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano pelo sistema transcriptionally regulado de Bela adormecida . Preparação da integração dos vetores de Lentivirus defeituosos, a transdução em vitro de células humanas e o ensaio molecular em células transduzidas são relatados.

Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Aprenda a produzir vetores lentivirais para entrega de genes em células do sistema nervoso central. Este protocolo detalha cotransfecção em células 293T, purificação por ultracentrifugação e titulação para transdução eficiente de neurônios e astrócitos.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

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