Uma abordagem semi-quantitativa para avaliar formação de biofilmes usando o desenvolvimento da colônia enrugado

O objetivo geral deste procedimento é identificar e medir alterações na formação de biofilme, avaliando o desenvolvimento da formação de colônias rugosas ao longo do tempo. Isso é realizado primeiramente cultivando cepas bacterianas de interesse em cultura líquida. O segundo passo consiste em semear as culturas em ágar nutriente.

Em seguida, as colônias são monitoradas ao longo do tempo para identificar o momento em que começam a desenvolver estruturas tridimensionais indicativas do início da formação de colônias enrugadas. O desenvolvimento da morfologia colonial é acompanhado até que não sejam mais visualizadas alterações adicionais. Por fim, a microscopia das colônias é utilizada para demonstrar diferenças no desenvolvimento de biofilmes ao longo do tempo por cepas específicas ou sob condições específicas, de maneira semi-quantitativa.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite uma análise semiqualitativa da formação de biofilme bacteriano por meio do desenvolvimento de morfologia de colônia enrugada. Embora este método possa fornecer informações sobre a formação de biofilme em Vireo fishery, ele também pode ser aplicado à caracterização de fenótipos de biofilme em outros sistemas bacterianos, como basc, slus, pseudomonas osa e vial cholera. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando identificamos mutantes bacterianos que exibiam um atraso no desenvolvimento da formação de colônias enrugadas.

A formação de biofilme é geralmente influenciada pela densidade celular e pela taxa de crescimento. Portanto, antes de avaliar a morfologia de colônias rugosas, deve-se determinar a taxa de crescimento e o rendimento das linhagens de interesse. Meça o aumento da densidade óptica ou OD de cada linhagem ao longo do tempo e trace uma curva de crescimento para determinar o rendimento ou número final de células.

Pode-se utilizar um ensaio de plaqueamento celular. As linhagens bacterianas de interesse são cultivadas em cultura líquida, e então diluições das culturas são plaqueadas em placas de ágar. Após a incubação, o número de células viáveis é calculado e representado graficamente como mostrado aqui.

Também é importante identificar as melhores condições de deposição que revelem as diferenças mais distintas entre o controle e o mutante de interesse. Para isso, antes de depositar as cepas em cultura líquida sob diversas condições, como diferentes meios ou temperaturas, e em diferentes estágios de crescimento, como fase exponencial ou fase estacionária, deposite 10 microlitros de cultura com diversas densidades celulares no meio apropriado e incube na temperatura desejada até que as morfologias das colônias se tornem aparentes. Dessa forma, pode-se determinar uma densidade óptica inicial ideal para um determinado conjunto de cepas ou condições para iniciar este procedimento.

Inocule células Fisher eye de placas de ágar em cinco mililitros de meio salino LB ou LBS contendo os antibióticos necessários e incube com agitação a 28 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, subcultive as células com uma diluição de 1 para 100 em cinco mililitros de meio LBS fresco e incube nas mesmas condições até que as células atinjam a densidade óptica (OD) desejada a 600 nanômetros. Para Vibrio fii, os melhores resultados são obtidos quando os pontos são gerados a partir de culturas com uma OD de aproximadamente 0,2. Em seguida, pipete um mililitro de cada cultura em um tubo microcêntrifuga e centrifugue na velocidade máxima.

Por um minuto, remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o pellet em um mililitro de água do mar artificial estéril a 70% ou uma centrífuga SW. As células, novamente, esta etapa de lavagem removerá o meio residual e componentes extracelulares. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet lavado em um mililitro de A SW a 70% para garantir que cada amostra contenha o número de células estimado pela DO a 600 nanômetros.

Realize os ajustes necessários diluindo amostras mais concentradas com mais solução salina a 70% A SW, aplicando 10 microlitros de cada cultura em placas de LBS contendo os antibióticos necessários. Certifique-se de manter a pipeta com o dedo logo acima da superfície do ágar e aplique a gota verticalmente, não em ângulo. Ejetar o líquido lentamente para uma distribuição uniforme da amostra, incluindo os controles positivo e negativo apropriados na mesma placa.

Ao avaliar a formação de colônias rugosas como placas menores, a variação AFL pode impactar o desenvolvimento do biofilme. O aspecto mais difícil deste procedimento é identificar o início da formação de colônias rugosas. Às vezes, isso só se torna evidente após o desenvolvimento já ter ocorrido.

Para captar o início do desenvolvimento de colônias enrugadas, coletamos pontos horários dentro de uma janela de tempo específica. Isso também nos permite retroceder e fazer comparações após o início do desenvolvimento. Para garantir que o cultivo em gota permaneça uniformemente distribuído, deixe a gota secar antes de transferir a placa para a estufa, inverta as placas e incube-as a 28 graus Celsius.

Uma maneira de avaliar a morfologia das culturas em gota é por meio de um ensaio de ponto final, que envolve a avaliação da formação de colônias enrugadas em um ponto de tempo predeterminado após a inoculação. Este é um resultado representativo de um ensaio de ponto final no qual foi avaliada a formação de colônias enrugadas. Quarenta horas após a inoculação, uma linhagem de Vibrio FII que não forma biofilme é mostrada à esquerda e uma linhagem formadora de biofilme é mostrada à direita.

O ensaio de ponto final é útil para cepas que exibem ou se propõe que exibam defeitos graves na formação de biofilme. Outro ensaio para avaliar a morfologia da colônia é um ensaio de curso temporal no qual a formação de colônias rugosas é avaliada ao longo de um período de tempo após o inoculação, facilitando o acompanhamento do tempo decorrido após o inoculação. Configure um temporizador para contagem progressiva.

Nesta demonstração, a morfologia do ponto em crescimento será monitorada a cada hora, começando entre 12 e 15 horas após o inoculo, utilizando um microscópio estereoscópico com câmera acoplada e sistemas de aquisição e análise de imagens. Programas de software são usados para observar e documentar a morfologia da colônia e para avaliar o início e a progressão da formação de colônias enrugadas. Antes da obtenção das imagens das culturas inoculadas, a tampa da placa de Petri é normalmente removida para obter a imagem mais nítida possível.

Aqui, as colônias são iluminadas por baixo, através de uma platina de vidro transparente, com uma fonte de luz fria, enquanto as imagens são capturadas por cima. Esse arranjo é ideal para a obtenção de imagens do desenvolvimento de colônias enrugadas, pois as colônias de Vibrio fischeri são translúcidas. Para visualizar da melhor forma o desenvolvimento de colônias enrugadas, ajuste tanto a intensidade da iluminação quanto o ângulo de reflexão sob as colônias bacterianas, de modo que a morfologia tridimensional dos biofilmes em desenvolvimento possa ser discernida.

Determine as condições ideais de iluminação que proporcionem o maior contraste entre a colônia pontilhada e o fundo de ágar ao redor. É importante utilizar sempre a mesma ampliação ao capturar imagens durante todo o experimento, usando a alavanca localizada na parte traseira da câmera; alterne a visualização da ocular do microscópio para a tela do computador, ajuste a imagem, foque adequadamente e, em seguida, capture as imagens, obtendo imagens apropriadas para documentar o início e o desenvolvimento da formação de colônias rugosas. O fim do experimento ocorre quando não houver mais desenvolvimento do biofilme.

No final dos experimentos realizados, as imagens são consolidadas em figuras para visualizar o desenvolvimento do padrão ao longo do tempo para cada linhagem ou condição. Observe quanto tempo decorre desde o momento da inoculação até o momento em que se inicia a formação de colônias rugosas; o início da formação de colônias rugosas é definido como o ponto temporal em que a formação de padrões e estruturas tridimensionais se torna aparente pela primeira vez. Neste exemplo, o início da formação de biofilme é evidente após 12 horas para uma linhagem controle competente para biofilme de Vibrio FII, representada no painel superior.

No painel inferior, uma imagem representativa de uma linhagem mutante de Vibrio FII que exibe um atraso de quatro horas no início da formação de colônias rugosas ao longo do tempo, com a formação de biofilme iniciando-se 16 horas após a inoculação. Observe que, embora diferenças sutis entre essas linhagens sejam observadas nos pontos de tempo iniciais em 40 horas, as linhagens apresentam aparência semelhante na intensidade e no padrão de formação de biofilme em cada ponto de tempo após o início da formação de colônias rugosas. O padrão de desenvolvimento das colônias rugosas deve ser anotado.

A arquitetura pode se desenvolver de fora para dentro, conforme ilustrado no painel A, ou pode se desenvolver de dentro para fora, conforme ilustrado no painel B. Esta avaliação fornece um mecanismo para distinguir os biofilmes formados por diferentes cepas ou sob diferentes condições. Uma segunda medida semi-quantitativa da formação de biofilme utiliza a variação do diâmetro da colônia ao longo do tempo. Conforme mostrado no painel superior, uma cepa representativa com competência para formar biofilme produz colônias que aumentam em complexidade e diâmetro.

Em contraste, outra linhagem mostrada no painel inferior não forma biofilmes. Por fim, esta figura mostra uma representação gráfica do aumento no diâmetro da colônia ao longo do tempo. Para as mesmas duas linhagens, a linhagem competente para formação de biofilme é representada por círculos brancos.

Enquanto a cepa que não forma biofilmes é representada por quadrados pretos. Esta análise revelou que o tamanho das colônias competentes para formação de biofilme aumenta a uma taxa maior do que o das colônias negativas para biofilme, e no ponto final do tempo, as duas diferiram em quase duas vezes. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de aplicar cuidadosamente cada cepa e registrar a formação inicial da colônia enrugada para cada cepa.

Após este protocolo, outros métodos, como um ensaio iCal ou coloração cristal violeta, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os processos envolvidos e a formação de biofilme.