Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

O objetivo geral deste procedimento é simular um acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos. Primeiro, a artéria carótida comum é temporariamente ligada, enquanto a artéria carótida externa é permanentemente ligada o mais distalmente possível. Outro ponto de sutura temporário, ligeiramente apertado, é colocado na ACE acima da bifurcação.

O segundo passo é prender a artéria carótida interna utilizando pinças de ação reversa para evitar sangramento. Em seguida, corta-se a AEC entre as ligaduras permanente e temporária. Depois, o monofilamento revestido com silicone é introduzido na AEC.

Em seguida, a ECA é invertida para introduzir o monofilamento na AIC até alcançar a base da artéria cerebral média. Uma hora depois, o fluxo sanguíneo é restabelecido pela remoção do monofilamento, simulando a recuperação do fluxo sanguíneo após a lise de um coágulo tromboembólico em humanos. Por fim, o déficit neurológico, que reflete o sucesso da O-A-C-M-T e a gravidade do infarto, pode ser avaliado logo após a reperfusão e em diferentes momentos após a reperfusão.

O software Cyan Image do NIH é utilizado para calcular o volume do infarto em cortes cerebrais representativos corados com violeta cristal. Uma das principais vantagens da oclusão transitória da artéria cerebral média utilizando a técnica do filamento intraluminal é que ela simula o acidente vascular cerebral isquêmico em pacientes com a restauração do fluxo sanguíneo, e o desenvolvimento deste procedimento em camundongos oferece a possibilidade de utilizar ferramentas de genética marcadora para identificar o papel de uma proteína-alvo. No estudo do acidente vascular cerebral, a oclusão transitória da artéria cerebral média é realizada em camundongos machos C57BL/6 com dois a três meses de idade e peso entre 22 e 28 gramas.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Bioética do Cuidado do IRCM para aumentar a reprodutibilidade no volume do infarto. Estamos utilizando um monofilamento reutilizável de 12 milímetros de comprimento, com revestimento de silício de seis ohms, da Doco Corporation. Duas horas antes da cirurgia.

Administre intraperitonealmente um camundongo com buprenorfina na dose de 0,03 miligramas por quilograma. Para iniciar o procedimento, anestesie os camundongos com 5% de isoflurano e mantenha a anestesia com 2,5% de isoflurano; utilize uma placa aquecida para manter constante a temperatura corporal do camundongo durante a cirurgia. Desinfete a pele do camundongo com etanol 70% ou Betadine. Em seguida, faça uma incisão mediana no pescoço e separe os tecidos moles sob um microscópio estereoscópico.

Disseque a região cervical do camundongo de forma romba para expor a traqueia. Em seguida, retrai os músculos para localizar a artéria carótida. Disseque cuidadosamente a artéria carótida comum esquerda do tecido circundante.

Coloque um fio cirúrgico temporário de seda 5-0, cortado em segmentos de 20 milímetros, ao redor da artéria. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Em seguida, separe a bifurcação da artéria carótida interna esquerda ou ACI e da artéria carótida externa comum ou ACE, e coloque um fio cirúrgico permanente ao redor da ACE o mais distalmente possível.

E outro ponto de sutura temporário na ECA acima da bifurcação. Em seguida, prenda a AIC esquerda usando pinças de ação reversa para evitar sangramento. Novamente, tenha muito cuidado para não lesar o nervo vago.

Corte um pequeno orifício na AEC antes da bifurcação da AEC e da AIC e entre os pontos permanentes e temporários colocados anteriormente. Em seguida, introduza um fio de sutura monofilamentar revestido com silicone de seis oh e 12 milímetros na AEC, corte completamente a AEC e inverta o monofilamento para dentro da AIC. Amarre a sutura firmemente para evitar sangramento e remova a pinça de ação reversa.

Em seguida, introduza o monofilamento na artéria cerebral média até que o monofilamento obstrua a base da parada da ACM. Sua inserção deve ser de cerca de nove a dez milímetros além da bifurcação da AEC e da ACC. Geralmente, o monofilamento será bloqueado e não poderá mais se mover.

Tenha cuidado para não penetrar a artéria tegó palatina. Amarre o ponto na ECA firmemente para fixar o filamento na posição. Agora, feche a pele com um sistema automático de clips para fechamento de feridas.

Administre um mililitro de solução salina por via subcutânea e coloque os camundongos sob uma lâmpada de aquecimento por infravermelho durante o período pós-oclusão, que é de 60 minutos. Anestesie os camundongos como anteriormente e remova os clipes automáticos, abrindo levemente a sutura na ECA para permitir a retirada do monofilamento e a reperfusão sanguínea. Em seguida, amarre permanentemente a sutura temporária na ECA para evitar perda sanguínea.

Uma hora após o acidente vascular cerebral, retire o monofilamento e guarde-o para reutilização. Em seguida, remova a sutura temporária na artéria carótida comum (CCA) para permitir a recirculação sanguínea. Feche a ferida e subcutaneamente.

Injete mais um mililitro de solução salina nos camundongos. Após verificar que o animal recuperou a mobilidade, devolva-o à sua gaiola e posicione metade da gaiola sobre o aquecedor para permitir que os camundongos escolham seu ambiente. Doze horas após a cirurgia, os camundongos recebem outra dose de buprenorfina para todas as operações simuladas.

Todos os procedimentos são idênticos, exceto pelo fato de que o monofilamento não é inserido após a cirurgia. O déficit neurológico é avaliado para confirmar o sucesso da T-M-C-A-O e determinar sua pontuação de eficiência, com base nos déficits neurológicos dos camundongos em 1, 24, 48 e 72 horas após a perfusão, em uma escala de seis pontos, conforme a seguir: zero equivale a normal; um equivale a leve, girando com ou sem enroscamento inconsistente ao ser levantado pela cauda. Mais de 50% das tentativas de enroscar para o lado contralateral.

Dois equivale a uma curvatura leve e consistente em mais de 50% das tentativas de curvar para o lado contralateral. Três equivale a uma curvatura consistente, forte e imediata. O camundongo mantém uma posição curvada por mais de um a dois segundos.

Com o nariz quase tocando a cauda. Quatro equivale a enrolamento severo. Evolução para perda de postura, marcha ou reflexo de escrita; cinco equivale a coma ou montículo.

Após a perfusão com solução de PBS, congele rapidamente os cérebros em isopentano e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Observe que os cérebros de camundongo também podem ser perfundidos com paraformaldeído a 4%, dependendo dos estudos de imunohistoquímica planejados. Em seguida, utilize um criostato para cortar secções coronais de cérebro de 17 mícrons usando 30 lâminas.

Coloque uma seção a cada 30 em um mesmo lâmina. Em seguida, cora as lâminas primeira e décima quinta com violeta de cresila. Para uma estimativa mais precisa do volume da lesão, utilize um sistema de análise de imagem, como o Scion Image do NIH, para avaliar o delimitador da lesão, a área de infarto que aparece branca nos hemisférios cerebrais esquerdo e direito.

Repita esta limitação D em todos os cortes cerebrais. Calcule o volume do infarto em unidades arbitrárias e exprima-os como uma porcentagem da área contralateral não lesada para cada seção. Mantenha os outros lâminas a menos 80 graus Celsius para estudos de imunohistoquímica.

A avaliação do escore neurológico confirma o sucesso da O-A-C-M-T em meus animais submetidos ao procedimento intraluminal. Como visto aqui, observa-se um encurvamento consistente, forte e intermediário, e o camundongo mantém uma posição encurvada por mais de um a dois segundos, com o nariz quase alcançando a cauda. Em nosso experimento, todos os camundongos apresentaram pelo menos um encurvamento leve e consistente, o que corresponde a um escore neurológico de dois durante todo o período do teste.

A coloração com violeta de Kressel foi realizada para avaliar o grau de infarto cerebral. Após a O-A-C-M-T mostrada aqui, uma seção coronal representativa do cérebro de camundongo corada com violeta de Kressel após 72 horas de reperfusão. A área de infarto, principalmente o estriado e a córtex e áreas cerebrais adjacentes, que estão identificadas, aparece em branco por não ser corada pelo violeta de Kressel.

O violeta mostrado aqui é o volume da lesão, que corresponde à parte branca do hemisfério direito expressa como uma porcentagem da área contralateral não lesada no hemisfério esquerdo. O volume do infarto em camundongos machos C57BL/6 após acidente vascular cerebral isquêmico representa cerca de 70% do hemisfério não lesado. Este procedimento proporciona uma elevada reprodutibilidade da lesão.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um acidente vascular cerebral isquêmico transitório em camundongos. Além disso, a abordagem de avaliação do volume do infarto cerebral oferece a grande vantagem de permitir testar diversos marcadores relevantes por imunoquímica. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.