Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

O objetivo geral deste procedimento é mimetizar o AVC isquêmico em camundongos. Primeiro, a artéria carótida comum é ligada temporariamente, enquanto a artéria carótida externa é permanentemente ligada o mais distalmente possível. Outra sutura temporária ligeiramente apertada é colocada no ECA acima da bifurcação.

O segundo passo é pinçar a artéria carótida interna usando pinças de ação reversa para evitar sangramento. Em seguida, corte o ECA entre as ligaduras permanentes e temporárias. Em seguida, o monofilamento revestido de silicone é introduzido no ECA.

Em seguida, o ECA é invertido para introduzir o monofilamento na ACI até incluir a base da artéria cerebral média. Uma hora depois, o fluxo sanguíneo é restaurado pela remoção do monofilamento para imitar a restauração do fluxo sanguíneo após a lise de uma garra tromboembólica em humanos. Em última análise, o déficit neurológico, que reflete o sucesso do T-M-C-A-O e a gravidade do infarto, pode ser avaliado logo após a reperfusão e em diferentes momentos após a reperfusão.

O software de imagem ciano do NIH é usado para calcular o volume do infarto em fatias representativas do cérebro coradas pela violeta crestal. Uma das principais vantagens da oclusão transitória da artéria cerebral média usando a técnica de filamento intraluminal é que ela mimetiza o AVC isquêmico em pacientes com a restauração do fluxo sanguíneo e o desenvolvimento deste procedimento em camundongos oferece a possibilidade de usar uma ferramenta de genética de rótulo para identificar o papel de uma proteína alvo. No acidente vascular cerebral, a oclusão transitória da artéria cerebral média é realizada em camundongos machos C 57 pretos de seis com dois a três meses de idade, pesando entre 22 e 28 gramas.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados de Bioética do IRCM para aumentar a reprodutibilidade no volume do infarto. Estamos usando monofilamento reutilizável de 12 milímetros de comprimento e seis oh revestido de silício da Doco Corporation. Duas horas antes da cirurgia.

Injete buprenorfina em um camundongo intraperitoneal na dose de 0,03 miligramas por quilograma. Para iniciar o procedimento, anestesiar camundongos com 5% de flúor isof e manter a anestesia a 2,5% de flúor ISO, usar uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do camundongo constante durante a cirurgia, desinfetar a pele da samambaia do camundongo com 70% de etanol ou Betadine. Em seguida, faça uma incisão na linha média do pescoço e separe os tecidos moles sob um microscópio estéreo.

Disseque sem rodeios o pescoço do camundongo para expor a traqueia. Em seguida, retraia os músculos para localizar a artéria carótida. Disseque cuidadosamente a artéria carótida comum esquerda do tecido circundante.

Coloque uma sutura temporária de seda de cinco oh, cortada em segmentos de 20 milímetros ao redor da artéria. Tome cuidado para não danificar o nervo vago. Em seguida, separe a bifurcação da artéria carótida comum interna esquerda ou ACI e da artéria carótida comum externa ou ECA coloque uma sutura permanente ao redor da ECA o mais distalmente possível.

E outra sutura temporária no ECA acima da bifurcação. Em seguida, corte o ACI esquerdo usando uma pinça de ação reversa para evitar sangramento. Novamente, tenha muito cuidado para não prejudicar o nervo vago.

Faça um pequeno orifício no ECA antes da bifurcação para o ECA e o ICA e entre as suturas permanentes e temporárias colocadas anteriormente. Em seguida, introduza uma sutura de monofilamento revestida de silicone de 12 milímetros seis oh no ECA, corte completamente o ECA e inverta o monofilamento no ICA. Amarre a sutura firmemente para evitar sangramento e remova a pinça de ação reversa.

Em seguida, introduza o monofilamento no círculo de Willis até que o monofilamento oclua a base do octente MCA. Sua inserção cerca de nove a 10 milímetros além da bifurcação do ECA e CCA. Geralmente, o monofilamento será bloqueado e não poderá mais se mover.

Tenha cuidado para não penetrar na artéria tego palatina. Amarre a sutura no ECA firmemente para fixar o filamento na posição. Agora feche a pele com um sistema de fechamento automático de clipe.

Injete um mililitro de soluções salinas por via subcutânea e coloque os camundongos sob uma lâmpada de aquecimento infravermelho durante o período pós-oclusão, que é de 60 minutos. Anestesiar os camundongos como antes e remover os clipes automáticos ligeiramente abrir a sutura no ECA para permitir que o monofilamento se retire e o sangue se reperfunda. Em seguida, amarre permanentemente a sutura temporária no ECA para evitar a perda de sangue.

Uma hora após o curso, retire o monofilamento e guarde-o para reutilização. Em seguida, remova a sutura temporária no CCA para permitir que o sangue recircule. Feche a ferida e subcutaneamente.

Injete outro mililitro de solução salina nos camundongos. Depois de garantir que o animal recupere a mobilidade, coloque-o de volta em sua gaiola e coloque metade da gaiola na almofada de aquecimento para permitir que os ratos escolham seu ambiente. 12 horas após a cirurgia, os camundongos recebem outra dose de buprenorfina para todas as operações simuladas.

Todos os procedimentos são idênticos, exceto que o monofilamento não é inserido após a cirurgia. O déficit neurológico é avaliado para confirmar o sucesso do T-M-C-A-O e determinar sua pontuação de eficiência, os déficits neurológicos dos camundongos em 1, 24, 48 e 72 horas após a perfusão em uma escala de seis pontos, como segue, zero é igual a normal, um é igual a leve, girando com ou sem ondulação inconsistente quando pego pela cauda. Mais de 50% tenta se curvar para o lado contralateral.

Dois é igual a ondulação leve e consistente acima de 50% das tentativas de curvatura para o lado contralateral. Três é igual a ondulação consistente, forte e imediata. O mouse mantém uma posição enrolada por mais de um a dois segundos.

Com o nariz quase alcançando a cauda. Quatro é igual a ondulação severa. Progredindo para perda de reflexo de caminhada ou escrita, cinco é igual a coma ou monte.

Após a perfusão com a solução de PBS, leve os cérebros rapidamente em isop pentano e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Observe que os cérebros de camundongos também podem ser perfundidos com aldeído paraforme a 4%, dependendo dos estudos imuno-histoquímicos planejados. Em seguida, use um criostato para cortar seções cerebrais coronais de 17 mícrons usando 30 lâminas.

Coloque uma seção de cada 30 no mesmo slide. Em seguida, pinte a primeira e a 15ª lâminas com violeta cristal. Para uma estimativa mais precisa do volume de lesões, use um sistema de análise de imagem, como a imagem Scion do NIH, para avaliar a lesão deli, a área do infarto que aparece branca nos hemisférios esquerdo e direito do cérebro.

Repita esta limitação D em todas as fatias de cérebro. Calcule o volume do infarto em unidades arbitrárias e expresse-as como uma porcentagem da área não lesionada contralateral para cada seção. Mantenha as outras lâminas a menos 80 graus Celsius para estudos de imuno-histoquímica.

A avaliação do escore neurológico confirma o sucesso do T-M-C-A-O em meus submetidos ao procedimento intraluminal. Como visto aqui, uma ondulação consistente, forte e intermediária é observada e o camundongo mantém uma posição enrolada por mais de um a dois segundos com o nariz quase alcançando a cauda. Em nosso experimento, todos os camundongos apresentaram pelo menos uma ondulação leve e consistente, o que corresponde a uma pontuação neurológica de dois durante todo o período de teste.

A coloração com violeta de Kressel foi feita para avaliar a extensão do infarto cerebral. Seguindo T-M-C-A-O mostrado aqui uma seção coronal representativa do cérebro de camundongo corado com crista violeta após 72 horas após a reperfusão. A área do infarto, principalmente o estriado e o córtex e as áreas cerebrais adjacentes, que são rotuladas, aparecem em branco, pois não são coradas pela crista.

Violeta mostrado aqui é o volume da lesão, que é a parte branca do hemisfério direito expressa como uma porcentagem da área não lesionada contralateral no hemisfério esquerdo. O volume de infarto em camundongos C 57 pretos seis machos após acidente vascular cerebral isquêmico representa cerca de 70% do hemisfério sem coleira. Este procedimento proporciona uma forte reprodutibilidade da lesão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar AVC isquêmico transitório em camundongos. Além disso, a abordagem do quiz viol para medir o volume do seu cérebro de fato, oferece a grande vantagem de ter muitos materiais para testar marcadores relevantes por imunoquímica. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.