Name: Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a realizar o modelo de oclusão intraluminal da artéria cerebral média em camundongos para estudar acidente vascular cerebral isquêmico. Avalie déficits neurológicos e volume do infarto com coloração violeta de cresyl.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi apoiado por uma equipe CIHR concessão CTP # 82946, um CIHR concessão # 102741 MOP, bem como uma cadeira Canadá # 216684 e uma Fundação Strauss. ER foi apoiado por uma bolsa de estudos do canadense do coração &amp; Stroke Foundation.

Oclusão da artéria cerebral transitória Médio (OACM) 1. Procedimento cirurgia (Figura 1) A oclusão da artéria cerebral média transiente (tMCAO) é realizado em 2 - a 3 meses de idade macho C57BL / 6 (22-28g). Este protocolo foi aprovado pelo IRCM cuidados com os animais bioética comitê. Instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min.) Entre cada animal, foram esterilizadas utilizando o esterilizador quente talão (15 seg.) Mesa de cirurgia e outros equipamentos são higienizadas utilizando etanol a 70%. Duas horas antes da cirurgia, os ratos foram analgesized com buprenorfina (0,03 bwip mg / kg). Figura 1A. <ol><li> Profundamente anestesiar ratos com 5% de isoflurano e depois manter a anestesia isoflurano em 2,5%. A temperatura corporal dos ratos é mantida constante durante a cirurgia, com uma almofada de aquecimento. </li><li> Desinfectar a pele e skem etanol com 70% ou Betadine. Desde barbear para liberação cabelo fragmento, microabrasions e inflamação que pode ter impacto na fisiopatologia curso, nós não raspar pele do rato. </li><li> Faça uma incisão na linha média do pescoço e puxe para além dos tecidos moles. </li><li> Sob um microscópio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), uma dissecção romba é realizada para expor a traqueia e retrair os músculos para localizar a artéria carótida. </li><li> A artéria carótida comum esquerda (CCA) é cuidadosamente dissecada do tecido circundante e o CCA está temporariamente obstruído por uma sutura temporária (1), usando sutura de seda 5-0 cortada em segmentos de 20 mm. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago. </li><li> Separe a bifurcação da artéria comum esquerda carótida interna (ACI) e artéria carótida externa comum (ECA). Uma sutura permanente (2) é colocada em torno da ECA, como distalmente quanto possível, e um outro fio de sutura temporária ligeiramente apertado (3) é colocado sobre o ECA distal aobifurcação. </li><li> Clipe da ACI esquerda (4) com uma pinça reversa de ação para evitar a hemorragia. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago. </li><li> Corte um pequeno buraco ECA (5) entre permanentes (2) e temporária (3) suturas. </li></ol> Figura 1B. <ol start="9"><li> Introduzir um 12 mm de comprimento 6-0 silício revestido (cerca de 9 a 10 mm é de silício revestido) de sutura de monofilamento (Doccol Corporation) para a ECA (6), completamente cortado da ECA distal à sutura permanente e inverter a prótese na ICA . A sutura é rigidamente ligada em torno do monofilamento para prevenir hemorragias e as pinças de acção inversa são removidas. </li><li> O oclusor é introduzido para ocluir a origem da MCA no círculo de Willis. Pare de sua inserção em torno de 9-10 mm além da bifurcação do ECA e CCA. A prótese é bloqueado e não pode mais mover-se. Deve ser tomado cuidado para não penetrar na artéria pterigopalatina. A sutura (3) sobre o ECA é tightly amarrado para fixar o monofilamento em posição. </li><li> Fechar a pele com um sistema de fecho Autoclip ferida. </li><li> Injectar 1 mL de solução salina subcutaneamente e coloque ratos sob uma lâmpada de aquecimento de infravermelhos durante todo o período pós-oclusão (60 min). </li></ol> 2. Restauração do fluxo sanguíneo da artéria cerebral média Antes reanesthesia, o neuroscore pode ser verificado para avaliar o sucesso da cirurgia. <ol><li> Anestesiar os ratos, tal como anteriormente descrito e retire os autoclips. </li><li> Abra ligeiramente a sutura (3) sobre o ECA para permitir a retirada monofilamentos e reperfusão sangue. </li><li> Permanentemente amarrar a sutura temporária no ECA para evitar a perda de sangue. O monofilamento é mantido para reutilização. </li><li> Remover a sutura temporária (1) sobre o CCA para permitir a recirculação de sangue. </li><li> Fechar a ferida. Os ratos devem receber um outro 1 ml de solução salina por via subcutânea. </li><li> Colocar os ratos sob a lâmpada de aquecimento infravermelha para 1 hr. Depois de verificar que o animal recupere a mobilidade, o rato é devolvido à sua gaiola e deixadas sob a almofada de aquecimento e toalhas para 72 h. Note-se que apenas a metade da gaiola é colocada sobre a almofada de aquecimento para permitir que os ratos para escolher o seu ambiente. Porque pós-cirúrgica a perda de peso é geralmente observado, alimentos puré é colocado numa placa de Petri, para encorajar a comer. Doze horas após a cirurgia, os ratos receberam uma segunda dose de buprenorfina (0,03 bwip mg / kg). </li></ol> 3. Operação Sham Para as operações de simulação, todos os procedimentos são idênticos, excepto que a prótese não está inserido. 4. Neuroscore Défices neurológicos permitir a avaliação do sucesso de tMCAO apenas após a reperfusão e mais tarde a estimativa do grau de severidade da lesão. Défices neurológicos são pontuados como previamente descrito 5 &lt;/ Sup&gt; e realizada a 1, 24, 48 e 72 horas pós-reperfusão. Uma escala de seis pontos expandida é utilizada: <ul><li> 0: normal. </li><li> 1: ligeira circulando comportamento com ou sem rotação inconsistente quando apanhado pela cauda, ​​&lt;50% de tentativas para girar para o lado contralateral. </li><li> 2: leve consistente circulando,&gt; 50% de tentativas para girar para o lado contralateral. </li><li> 3: consistente forte e imediata circulando, o mouse tem uma posição de rotação por mais de 1-2 segundos, com o nariz quase atingindo sua cauda. </li><li> 4: rotação grave progredindo em embarricamento, perda de andar ou dos reflexos. </li><li> 5: coma ou moribundos. </li></ul> 5. Coloração com violeta de cresilo (Figura 2) Seguindo PBS solução de perfusão, os cérebros são rapidamente congelados em isopentano e armazenados a -80 °C. cérebros de rato pode ser também submetido a perfusão com paraformaldeído a 4% (PFA) em função dos estudos imunohistoquímicos planeadas. Criostáticas-cortes das secções cerebrais coronais (17 um) são executadas. Uma secção de cada 30 é recolhida na mesma lâmina ter uma lesão cerebral representativo. Para a quantificação do volume, duas lâminas são coradas por coloração com violeta de cresilo e um sistema de análise de imagem (Scion Corporation, Frederick, MD) foi usado para avaliar a lesão. O volume da lesão foi calculada em unidades arbitrárias (pixels), e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral de cada secção. Outras lâminas são mantidas a -80 ° C para estudos imuno-histoquímicos. Alternativamente, fixa-PFA cérebro pode ser cortado em 30-50 uM utilizando vibratome e o volume do enfarte medido, tal como recomendado por Han et al. (2009) 6.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li>
<li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+%281st+edition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
<li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li>
<li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li>
<li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li>
<li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li>
<li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar. Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Zeiss, Inc.

Diferentes modelos de AVC têm sido desenvolvidos para imitar efeitos de AVC em pacientes. A escolha do modelo de acidente vascular cerebral depende da questão biológica. O modelo OACM intraluminal imita um dos tipos mais comuns de AVC isquêmico em pacientes e é menos invasiva e mais consistente do que o modelo Tamura 4,7. É um modelo muito interessante para análises de morte neurorepair neuroproteção, e celular. O sucesso do modelo intraluminal depende de muitos factores tais como o sexo do animal, idade e peso, a temperatura, a anestesia e do momento da cirurgia, que têm de ser controladas. As propriedades físicas do oclusor (ponta de diâmetro, comprimento, forma e fexibilidade) são críticos para a consistência da MCAO 4. Aqui, usamos a 12 milímetros de comprimento 6-0 monofilamento revestido com silicone em 9-10 mm da Corporação Doccol. A grande vantagem deste monofilamento é reduzir hemorragia subaracnóidea e porque seu comprimento cobriu todo o ICAcomprimento, o fluxo de sangue residual, que vem das artérias anterior e posterior comunicação do Círculo de Willis e PPA, é impedido e da variabilidade de volume diminui infarto (15% da variabilidade em nossas mãos) 8. A sutura de CCA também diminui a variabilidade do volume de enfarte 9. A extensão da lesão cerebral a seguir tMCAO pode ser avaliada por modos diferentes. Défices neurológicos pode ser medida conforme anteriormente mencionado. No entanto, é difícil ter uma medida eficaz por este caminho. A extensão do enfarte é normalmente realizada por coloração com TTC. Mais recentemente, as técnicas de ressonância magnética também são utilizados, uma tecnologia particularmente interessante para os tratamentos neuroprotectores. Para compreender os mecanismos subjacentes celulares envolvidos no acidente vascular cerebral, tais como neurorepair morte celular, ou a proliferação celular, o estudo de diferentes marcadores por imuno-histoquímica é crítica e muito informativo. Assim, o nosso protocolool de preparações secção cérebro tem a grande vantagem de permitir que estas análises, e minimiza o número de ratos utilizados. Além disso, Tureyen et al. 10 relataram que há uma boa correlação entre a coloração violeta cresil e TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Descrição</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscópio estéreo</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibra-Light Iluminador de Alta Intensidade</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema de Anestesia para isoflurano</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cobertor Aquecimento</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lâmpada de aquecimento de infravermelhos</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra pinça fina, estilo 5</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vannas Tesoura Cutting Edge 3 mm, Reto</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estilo LA-1 e MPF-1 Todas as lâminas lisas</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Negativos pinças de ação, estilo KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissecando tesoura 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip Starter Set</td&gt;<td&gt; Harvard aparelho</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclip Wound Syst Encerramento., 9mm de comprimento, 100/PK</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sutura 5-0</td&gt;<td&gt; Harvard aparelho</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Material de sutura PDS II monofilamento violeta, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm de comprimento de sutura de monofilamento 6-0 siliconado</td&gt;<td&gt; Doccol Corporação</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agulhas 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; Ratos</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

modelo de rato oacm intraluminal: avaliação infarto cerebral por coloração violeta cresyl

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

AVC é a terceira causa de mortalidade ea principal causa de incapacidade no mundo. Isquêmicos contas AVC por aproximadamente 80% de todos os derrames. No entanto, o tecido trombolítica activador do plasminogénio (tPA) é o único tratamento do acidente vascular cerebral isquémico agudo que existe. Isto levou os pesquisadores a desenvolver diversos modelos de acidente vascular cerebral isquêmico em uma variedade de espécies. Dois grandes tipos de modelos de roedores foram desenvolvidos: modelos de isquemia cerebral global ou isquemia cerebral focal. Para imitar AVC isquémico em doentes, nos quais cerca de 80% AVC trombótico ou embólico ocorrer no território da artéria cerebral média (MCA), a oclusão da artéria cerebral média intraluminal (MCAO) modelo é muito relevante para os estudos de acidente vascular cerebral. Este modelo foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Koizumi et al., Em 1986, 1. Devido à facilidade de manipulação genética em ratinhos, estes modelos têm sido desenvolvidos neste 2-3 espécie. conteúdo &quot;&gt; Aqui, nós apresentamos a MCA transiente procedimento de oclusão em ratos C57/BL6. Estudos anteriores relataram que as propriedades físicas do oclusor como o diâmetro da ponta, o comprimento, a forma ea flexibilidade são críticas para a reprodutibilidade do volume do enfarte 4. Nisto, um monofilamentos de silício comerciais revestidos (Doccol Corporation) foram utilizados. Outra grande vantagem é que este monofilamento reduz o risco de induzir hemorragia subaracnóidea. Usando o estereomicroscópio Zeiss-Stemi 2000, o monofilamento de silicone revestido foi introduzido na artéria carótida interna (ICA), através de um corte da artéria carótida externa (ECA) até que o monofilamento oclui a base da MCA. fluxo sanguíneo foi restaurado 1 hora depois da remoção do monofilamento para imitar o restabelecimento do fluxo sanguíneo após a lise de um coágulo de tromboembólico humanos. A extensão do enfarte cerebral pode ser avaliada primeiro por uma pontuação neurológica e pela medição do volume do enfarte.Ratos isquêmicos isso foram analisados ​​para a sua pontuação neurológica em diferentes pós-reperfusão vezes. Para avaliar o volume de enfarte, a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) foi geralmente realizada. Aqui, usamos a coloração violeta cresil uma vez que oferece a oportunidade de testar muitos marcadores de críticas por imuno-histoquímica. Neste vídeo, relata o procedimento OACM; pontuações neurológicas e da avaliação do volume de infarto por coloração violeta cresil.

A avaliação neuroscore confirma o sucesso do tMCAO pós-AVC e determina a eficiência do tMCAO de pós-reperfusão. Nas nossas mãos, todos os ratos submetidos ao procedimento intraluminal apresentou pelo menos uma ondulação ligeira consistente (neuroscore 2) e os défices neurológicos são geralmente estáveis ​​até 72 horas. A maioria dos ratos apresentam um leve ondulação consistente (neuroscore 2). Ratinhos mostrando ausência de enrolamento são excluídos do estudo. No entanto, a avaliação neuroscore não permite-nos distinguir entre ratos com um hipocampo feridos e aqueles com um hipocampo intacto. Nenhuma mortalidade foi observada durante o dia da cirurgia, o que sugere que a hemorragia subaracnóidea não ocorreu. Quando a hemorragia subaracnoidea é identificado no rato, este é sistematicamente excluídos da análise. O uso de silício revestido de monofilamento de Doccol Corporation, que é mais suave do que a casa preparados monofilamentos, aumenta o sucesso detMCAO e reduz a hemorragia subaracnóidea. A mortalidade entre 24 horas e 72 horas é de 14% neste modelo, como geralmente reportados por 60 minutos de oclusão. A mortalidade observada é provavelmente devido a um grande volume do enfarte neste estirpe de ratinho. A reprodutibilidade forte lesão foi também observada (desvio padrão é de 15%), o que é muito interessante para estudar moléculas neuroproteção onde o seu efeito (s) poderão ser escondidos pela variabilidade do modelo. Para avaliar a extensão da lesão cerebral após tMCAO, optou-se por utilizar coloração violeta cresil (Figura 2) em vez de TTC a fim de ter uma grande quantidade de materiais para testar marcadores relevantes 6. A extensão da lesão é relativamente consistente. No entanto, percebemos que em alguns ratos, o hipocampo foi ferido (cerca de 30% dos ratos). É interessante notar que a coloração com violeta de cresilo pode ser aplicado até uma semana mais tarde. Na literatura, a percentagem de enfarte cerebral varia de umestudar para o outro. Ela depende da escolha de estirpe de ratinho, a anestesia, a espessura das secções de cérebro, o monofilamento utilizado, ou a coloração utilizado 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esquema da oclusão da artéria cerebral média, utilizando silício revestido monofilamento intraluminal. Um esquema. Simplificado do cérebro de rato e artérias cerebrais mostrando suturas sucessivas e clipe para preparar a introdução de silício revestido de monofilamento. B. A posição de monofilamento através do círculo de Willis é representada. O monofilamento é introduzido via ICA ECA para ocluir a base do MCA ACA, artéria cerebral anterior;. BA, da artéria basilar; CCA, artéria carótida comum; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, carótida externa artery; ICA, interna da artéria carótida; MCA, artéria cerebral média; PCA, artéria comunicante posterior; PPA, artéria pterigopalatina. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representante cortes coronais de cérebro de rato coradas com cresil violeta após 72 horas pós-reperfusão área de infarto. (Principalmente estriado, córtex e áreas cerebrais adjacentes) aparece em branco (imaculada por violeta cresil). O volume da lesão (parte branca, hemisfério direito) foi delimitado e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral (hemisfério esquerdo).

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

O acidente vascular cerebral (AVC) é a terceira causa de mortalidade e a principal causa de incapacidade no mundo. O AVC isquêmico representa aproximadamente 80% de todos os casos de AVC. ...

O objetivo geral deste procedimento é simular um acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos. Primeiro, a artéria carótida comum é temporariamente ligada, enquanto a artéria carótida externa é permanentemente ligada o mais distalmente possível. Outro ponto de sutura temporário, ligeiramente apertado, é colocado na ACE acima da bifurcação.O segundo passo é prender a artéria carótida interna utilizando pinças de ação reversa para evitar sangramento. Em seguida, corta-se a AEC entre as ligaduras permanente e temporária. Depois, o monofilamento revestido com silicone é introduzido na AEC.Em seguida, a ECA é invertida para introduzir o monofilamento na AIC até alcançar a base da artéria cerebral média. Uma hora depois, o fluxo sanguíneo é restabelecido pela remoção do monofilamento, simulando a recuperação do fluxo sanguíneo após a lise de um coágulo tromboembólico em humanos. Por fim, o déficit neurológico, que reflete o sucesso da O-A-C-M-T e a gravidade do infarto, pode ser avaliado logo após a reperfusão e em diferentes momentos após a reperfusão.O software Cyan Image do NIH é utilizado para calcular o volume do infarto em cortes cerebrais representativos corados com violeta cristal. Uma das principais vantagens da oclusão transitória da artéria cerebral média utilizando a técnica do filamento intraluminal é que ela simula o acidente vascular cerebral isquêmico em pacientes com a restauração do fluxo sanguíneo, e o desenvolvimento deste procedimento em camundongos oferece a possibilidade de utilizar ferramentas de genética marcadora para identificar o papel de uma proteína-alvo. No estudo do acidente vascular cerebral, a oclusão transitória da artéria cerebral média é realizada em camundongos machos C57BL/6 com dois a três meses de idade e peso entre 22 e 28 gramas.Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Bioética do Cuidado do IRCM para aumentar a reprodutibilidade no volume do infarto. Estamos utilizando um monofilamento reutilizável de 12 milímetros de comprimento, com revestimento de silício de seis ohms, da Doco Corporation. Duas horas antes da cirurgia.Administre intraperitonealmente um camundongo com buprenorfina na dose de 0,03 miligramas por quilograma. Para iniciar o procedimento, anestesie os camundongos com 5% de isoflurano e mantenha a anestesia com 2,5% de isoflurano; utilize uma placa aquecida para manter constante a temperatura corporal do camundongo durante a cirurgia. Desinfete a pele do camundongo com etanol 70% ou Betadine. Em seguida, faça uma incisão mediana no pescoço e separe os tecidos moles sob um microscópio estereoscópico.Disseque a região cervical do camundongo de forma romba para expor a traqueia. Em seguida, retrai os músculos para localizar a artéria carótida. Disseque cuidadosamente a artéria carótida comum esquerda do tecido circundante.Coloque um fio cirúrgico temporário de seda 5-0, cortado em segmentos de 20 milímetros, ao redor da artéria. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Em seguida, separe a bifurcação da artéria carótida interna esquerda ou ACI e da artéria carótida externa comum ou ACE, e coloque um fio cirúrgico permanente ao redor da ACE o mais distalmente possível.E outro ponto de sutura temporário na ECA acima da bifurcação. Em seguida, prenda a AIC esquerda usando pin&ccedil;as de a&ccedil;&atilde;o reversa para evitar sangramento. Novamente, tenha muito cuidado para n&atilde;o lesar o nervo vago.Corte um pequeno orifício na AEC antes da bifurcação da AEC e da AIC e entre os pontos permanentes e temporários colocados anteriormente. Em seguida, introduza um fio de sutura monofilamentar revestido com silicone de seis oh e 12 milímetros na AEC, corte completamente a AEC e inverta o monofilamento para dentro da AIC. Amarre a sutura firmemente para evitar sangramento e remova a pinça de ação reversa.Em seguida, introduza o monofilamento na artéria cerebral média até que o monofilamento obstrua a base da parada da ACM. Sua inserção deve ser de cerca de nove a dez milímetros além da bifurcação da AEC e da ACC. Geralmente, o monofilamento será bloqueado e não poderá mais se mover.Tenha cuidado para não penetrar a artéria tegó palatina. Amarre o ponto na ECA firmemente para fixar o filamento na posição. Agora, feche a pele com um sistema automático de clips para fechamento de feridas.Administre um mililitro de solução salina por via subcutânea e coloque os camundongos sob uma lâmpada de aquecimento por infravermelho durante o período pós-oclusão, que é de 60 minutos. Anestesie os camundongos como anteriormente e remova os clipes automáticos, abrindo levemente a sutura na ECA para permitir a retirada do monofilamento e a reperfusão sanguínea. Em seguida, amarre permanentemente a sutura temporária na ECA para evitar perda sanguínea.Uma hora após o acidente vascular cerebral, retire o monofilamento e guarde-o para reutilização. Em seguida, remova a sutura temporária na artéria carótida comum (CCA) para permitir a recirculação sanguínea. Feche a ferida e subcutaneamente.Injete mais um mililitro de solução salina nos camundongos. Após verificar que o animal recuperou a mobilidade, devolva-o à sua gaiola e posicione metade da gaiola sobre o aquecedor para permitir que os camundongos escolham seu ambiente. Doze horas após a cirurgia, os camundongos recebem outra dose de buprenorfina para todas as operações simuladas.Todos os procedimentos são idênticos, exceto pelo fato de que o monofilamento não é inserido após a cirurgia. O déficit neurológico é avaliado para confirmar o sucesso da T-M-C-A-O e determinar sua pontuação de eficiência, com base nos déficits neurológicos dos camundongos em 1, 24, 48 e 72 horas após a perfusão, em uma escala de seis pontos, conforme a seguir: zero equivale a normal; um equivale a leve, girando com ou sem enroscamento inconsistente ao ser levantado pela cauda. Mais de 50% das tentativas de enroscar para o lado contralateral.Dois equivale a uma curvatura leve e consistente em mais de 50% das tentativas de curvar para o lado contralateral. Três equivale a uma curvatura consistente, forte e imediata. O camundongo mantém uma posição curvada por mais de um a dois segundos.Com o nariz quase tocando a cauda. Quatro equivale a enrolamento severo. Evolução para perda de postura, marcha ou reflexo de escrita; cinco equivale a coma ou montículo.Após a perfusão com solução de PBS, congele rapidamente os cérebros em isopentano e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Observe que os cérebros de camundongo também podem ser perfundidos com paraformaldeído a 4%, dependendo dos estudos de imunohistoquímica planejados. Em seguida, utilize um criostato para cortar secções coronais de cérebro de 17 mícrons usando 30 lâminas.Coloque uma seção a cada 30 em um mesmo lâmina. Em seguida, cora as lâminas primeira e décima quinta com violeta de cresila. Para uma estimativa mais precisa do volume da lesão, utilize um sistema de análise de imagem, como o Scion Image do NIH, para avaliar o delimitador da lesão, a área de infarto que aparece branca nos hemisférios cerebrais esquerdo e direito.Repita esta limitação D em todos os cortes cerebrais. Calcule o volume do infarto em unidades arbitrárias e exprima-os como uma porcentagem da área contralateral não lesada para cada seção. Mantenha os outros lâminas a menos 80 graus Celsius para estudos de imunohistoquímica.A avaliação do escore neurológico confirma o sucesso da O-A-C-M-T em meus animais submetidos ao procedimento intraluminal. Como visto aqui, observa-se um encurvamento consistente, forte e intermediário, e o camundongo mantém uma posição encurvada por mais de um a dois segundos, com o nariz quase alcançando a cauda. Em nosso experimento, todos os camundongos apresentaram pelo menos um encurvamento leve e consistente, o que corresponde a um escore neurológico de dois durante todo o período do teste.A coloração com violeta de Kressel foi realizada para avaliar o grau de infarto cerebral. Após a O-A-C-M-T mostrada aqui, uma seção coronal representativa do cérebro de camundongo corada com violeta de Kressel após 72 horas de reperfusão. A área de infarto, principalmente o estriado e a córtex e áreas cerebrais adjacentes, que estão identificadas, aparece em branco por não ser corada pelo violeta de Kressel.O violeta mostrado aqui é o volume da lesão, que corresponde à parte branca do hemisfério direito expressa como uma porcentagem da área contralateral não lesada no hemisfério esquerdo. O volume do infarto em camundongos machos C57BL/6 após acidente vascular cerebral isquêmico representa cerca de 70% do hemisfério não lesado. Este procedimento proporciona uma elevada reprodutibilidade da lesão.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um acidente vascular cerebral isquêmico transitório em camundongos. Além disso, a abordagem de avaliação do volume do infarto cerebral oferece a grande vantagem de permitir testar diversos marcadores relevantes por imunoquímica. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

mouse-model-intraluminal-mcao-cerebral-infarct-evaluation-cresyl

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

Neste estudo, nós modificamos um método experimental existente para obter resultados mais reprodutíveis, estabelecendo um modelo do rato (MCAO) de oclusão de artéria cerebral média. A administração oral de Glycyrrhizae Radix et extrato de metanol de rizoma (GR) (GRex), após indução de acidente vascular cerebral, diminuiu significativamente o volume de infarto total em relação ao grupo controle não tratado.

Avaliar efeitos Neuroprotective do Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extrair usando um modelo de Mouse de oclusão transitória de artéria Cerebral média

Para investigar a fisiopatologia do AVC, é criado um modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral. Nós distalmente ligate da artéria cerebral média direita e artéria carótida comum direita e restaurar o fluxo sanguíneo após 10 ou 40 min de isquemia.

Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de oclusão da artéria cerebral média distal (dMCAO) por meio de eletrocoagulação transcraniana em camundongos C57BL/6J e avaliar o comportamento neurológico subsequente e as características histopatológicas.

Indução de AVC Isquêmico Agudo em Camundongos Usando a Técnica de Oclusão Distal da Artéria Média

Aprenda a realizar o modelo de oclusão intraluminal da artéria cerebral média em camundongos para estudar acidente vascular cerebral isquêmico. Avalie déficits neurológicos e volume do infarto com coloração violeta de cresyl.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

Explorar mais vídeos