Protocolo de Coleta para Pâncreas Humano

O objetivo geral deste procedimento é dissecar o pâncreas humano de uma maneira que mantenha a orientação anatômica. Isso é feito removendo o duodeno e o baço do pâncreas e, em seguida, eliminando o excesso de gordura e vasos do pâncreas. O segundo passo é pintar a superfície anterior com tinta azul e a superfície posterior com tinta preta.

Em seguida, o pâncreas é dividido em três regiões. Cada região é então cortada transversalmente em placas uniformes e colocada em de parafina, moldes OCT ou picada e colocada em frascos. Por fim, as amostras são coletadas de todas as três regiões do pâncreas, enquanto a orientação anatômica correta é mantida para análise futura.

Este método pode ajudar a abordar questões-chave na pesquisa do diabetes tipo um, como os mecanismos subjacentes à perda de massa ou função das células beta e a natureza do ataque das células imunológicas. A demonstração visual do método de processamento do pâncreas é crítica, pois manter a orientação in vivo do pâncreas requer atenção aos detalhes. Demonstrando o procedimento estarão Linda Snyder, tecnóloga em histo e Emily Montgomery, cientista biológica em meu laboratório.

Comece preparando todos os materiais necessários para o procedimento. Primeiro, rotule os que conterão os blocos de parafina com um identificador de doador, tipo de amostra, número de alíquota e qualquer informação adicional. Em seguida, rotule os moldes OCT da mesma maneira.

Corte pedaços suficientes de papel alumínio para embrulhar cada bloco de OCT e reserve-os para uso posterior. Prepare todos os frascos necessários para armazenar as amostras frescas e congeladas. Adicione RNA posteriormente e mídia RPMI quando apropriado.

Em seguida, prepare as áreas de trabalho, coloque placas de dissecação, instrumentos esterilizados e todos os outros suprimentos necessários para o procedimento tanto em uma capa de biossegurança quanto em uma bancada. Tenha todos os e moldes de OCT organizados em ordem de uso. Próximo. Crie um banho de congelamento adicionando pentano isop suficiente para cobrir o gelo seco no fundo de uma caixa de isopor.

Para iniciar a dissecção, remova o duodeno e o baço. Comece separando o duodeno e o pâncreas em uma extremidade e continue até que esteja completamente separado. O baço está frouxamente preso e é facilmente removido da gordura e do pâncreas.

Em seguida, limpe o pâncreas de vasos adiposos e nervos estranhos usando uma combinação de dissecção contundente e aguda. Separe a gordura e os gânglios linfáticos para serem processados posteriormente. Depois de limpo, coloque o pâncreas em uma placa de dissecação coberta com papel toalha.

Manter a orientação correta do pâncreas é o aspecto mais difícil deste procedimento. Para garantir o sucesso, as superfícies anterior e posterior são pintadas com tintas de cores diferentes. Mergulhe um aplicador com ponta de algodão em tinta azul, espalhe a tinta na superfície anterior do pâncreas e seque o excesso.

Em seguida, mergulhe um novo aplicador em tinta preta e espalhe-o na superfície posterior do pâncreas. Retorne o pâncreas à sua orientação normal. Com a superfície anterior voltada para cima, o pâncreas está pronto para ser cortado em três seções.

Primeiro, corte a junção entre a cabeça e o corpo. Em seguida, divida a porção restante em porções aproximadamente iguais para separar o corpo e a cauda, registre o peso de cada região do pâncreas. Começando com a seção principal.

Divida cada região em seções de aproximadamente 0,5 centímetro cortando de maneira transversal, semelhante ao corte de um pão. Uma vez que cada região do pâncreas tenha sido cortada, remova a última seção da região da cabeça, que é a seção de junção do corpo da cabeça, e coloque-a em uma placa de dissecação separada. Pique esta seção em pedaços pequenos e divida os pedaços igualmente entre frascos criogênicos rotulados com e sem RNA.

Mais tarde, os frascos são congelados. Seguindo os procedimentos padrão. Repita este procedimento para a seção de junção da cauda do corpo.

Uma vez colhidas as amostras picadas, inclinar todas as secções transversais para a direita. As seções alternadas de cada região serão removidas. Para blocos de parafina e OCT, remova a primeira seção para bloqueio de parafina.

Se uma seção for muito grande, corte-a ao meio. Rotule os como A e B.Se a peça ainda for muito grande, corte cada seção perpendicular ao corte anterior e, em seguida, rotule os de A a D no sentido horário. Como visto aqui, posicione o de forma que a etiqueta fique à esquerda.

Em seguida, coloque o lenço no e feche a tampa. Transfira o para um recipiente contendo formina tamponada neutra. Numere o bloco sequencialmente dentro de cada região, começando com a seção mais medial para blocos OCT.

Despeje uma fina camada de meio OCT em um molde pré-rotulado Antes de introduzir o tecido, cubra o tecido com meio OCT e congele rapidamente a amostra para uso posterior, retornando ao tecido que foi reservado anteriormente. Isole os gânglios linfáticos pancreáticos aparando a gordura e o tecido conjuntivo ao redor da cápsula do nódulo. Coloque os nós em um prato estéril contendo DMEF pique os nós grandes em pedaços não maiores que 0,5 centímetros.

Uma vez que os gânglios linfáticos pancreáticos estejam isolados, divida o tecido entre os frascos e preparados para processamento posterior. Depois de terminar os gânglios linfáticos, o baço é picado e armazenado de maneira semelhante. Para processar o duodeno, use uma gaze umedecida para limpar a mucosa de muco, corte a mucosa e corte-a em seções.

Divida as amostras de mucosa conforme mostrado anteriormente. Usando este procedimento, amostras representativas de cada região do pâncreas são coletadas como visto aqui. Os pesos da cabeça, corpo e região da cauda eram aproximadamente iguais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar um pâncreas humano em diferentes tipos de amostra, especificamente a capacidade de manter a orientação, bem como isolar os gânglios linfáticos da gordura peripancreática.