Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar rapidamente células dendríticas intestinais de camundongos ou dcs e macrófagos para caracterização fenotípica e funcional. Isso é feito pela primeira colheita de tecido intestinal. O segundo passo é dissociar o epitélio intestinal da lâmina própria.

Em seguida, a Lamin Propria intestinal é digerida durante as etapas finais do procedimento. As células da Lamin propria são coradas com fluorescência, anticorpos conjugados e fechadas para populações de células específicas. Em última análise, as populações intestinais de DC e macrófagos podem ser caracterizadas e purificadas com mais precisão para estudos funcionais para avaliar a produção de citocinas, a apresentação de antígenos e a regulação das células imunes.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que a rapidez da digestão do tecido garante a expressão ideal do antígeno da superfície celular, a viabilidade celular e/ou celular. Depois de sacrificar o camundongo e confirmar a morte pelo reflexo de pinça do dedo do pé, teste o spray 70% de etanol no abdômen e no tórax do animal. Em seguida, use uma tesoura para fazer uma pequena incisão horizontal no meio do abdômen e retire a pele para expor o peritônio.

Abra o peritônio usando uma tesoura após cortar o esfíncter pilo para separar o estômago do intestino delgado superior e usando uma pinça para remover o mesentério. Corte novamente na válvula ileocecal para libertar todo o intestino delgado do intestino grosso. Continue a separar o mesentério do intestino grosso e faça um corte na borda anal.

Use uma tesoura para cortar o cólon longitudinalmente e use a temperatura ambiente C-M-F-P-B-S para lavar o conteúdo fecal e o muco do lúmen intestinal. Em seguida, use a tesoura e o fórceps para macroscopicamente. Disseque as manchas de piras ao longo da superfície antimesentérica do intestino delgado e abra o intestino delgado longitudinalmente.

Em seguida, limpe o lúmen do intestino delgado do conteúdo fecal e muco com mais temperatura ambiente C-M-F-P-B-S. Separadamente, corte os intestinos delgado e grosso em pedaços de aproximadamente 1,5 centímetro e coloque os pedaços em tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S pré-guerra com FBS e dois EDTA milimolar. Coloque cada tubo cônico de 50 mililitros horizontalmente em um agitador orbital, agitando os tubos a 250 RPM por 20 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, coloque um filtro de arame de malha única sobre um balde de resíduos. Despeje o conteúdo de cada tubo cônico de 50 mililitros através da malha para recuperar os pedaços do intestino e, em seguida, coloque-os em novos tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S pré-aquecido com FBS com dois EDTA milimolar. Por fim, coloque os tubos de volta no agitador orbital por mais 20 minutos.

Após a segunda rodada de agitação, despeje o conteúdo de cada tubo pela peneira. Novamente, enxugue o excesso de mídia usando uma toalha de papel e, em seguida, transfira os pedaços de intestino para um pequeno barco de soro de leite de plástico. O aspecto mais difícil desta técnica é a digestão do tecido para garantir o sucesso, todos os diferentes parâmetros da duração da digestão, as propriedades da colagenase, a integridade do tecido e o tamanho do tecido a ser digerido devem ser considerados usando uma tesoura rapidamente.

Pique os pedaços intestinais e, em seguida, adicione o intestino picado em um tubo cônico de 50 milímetros contendo 20 mililitros de solução de colagenase. Coloque o tubo cônico horizontalmente no agitador orbital e digerir os pedaços de intestino a 200 RPM por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius. Agora, faça um vórtice breve do tubo para garantir a dissociação completa de qualquer tecido intestinal remanescente e, em seguida, filtre a pasta celular através de um filtro de células de 100 mícrons diretamente em um tubo cônico de 50 mililitros.

Finalmente, complete o tubo cônico com C-M-F-H-B-S-S com FBS e centrifugue a solução celular duas vezes por cinco minutos a 425 vezes G a quatro graus Celsius. Em seguida, despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em C-M-F-H-B-S-S gelado com FBS e coloque as amostras no gelo. Depois de corar as células para as proteínas de superfície de interesse.

Comece criando um gráfico de pontos excluindo as células que são positivas para a coloração de células mortas, conforme demonstrado aqui. Em seguida, exclua os eventos duplos, conforme mostrado aqui e aqui. Agora use os canais de dispersão frontal e lateral para bloquear as células de interesse, certificando-se de excluir detritos.

Em seguida, crie outro gráfico de pontos no antígeno positivo para CD 45 e positivo para IAB. As células apresentadoras em um gráfico de pontos separado criam regiões para distinguir subconjuntos específicos de DC e macrófagos. A região R uma mostrada aqui captura as células negativas opacas CD 11 C positivas CD 11 B.

A região R dois delineia as células que têm um nível semelhante de expressão de superfície para CD 11 C como as células na região R um, mas que também expressam CD 11 B. As três regiões R designam as células que são CD 11, B positivo e CD 11 C opaco negativo. Essas três regiões podem ser analisadas posteriormente para a expressão de F quatro 80 e CD 1 0 3 para diferenciar as populações de macrófagos e DC, respectivamente. Como visto neste gráfico de pontos, as células negativas opacas CD 11 C positivas CD 11 B na região R um expressarão altos níveis de alfa ein CD 1 0 3 e baixos níveis de F quatro 80.

Este gráfico de pontos mostra que as células CD 11 B positivas para CD 11 C na região R dois serão compostas por DCS e macrófagos com base em sua expressão dicotômica de CD 1 0 3 e F quatro 80. Finalmente, com base em seu perfil fenotípico F quatro 80 positivo e CD 1 0 3 negativo R três, as células CD 11 B positivas CD 11 C del negativas consistirão em macrófagos, a relação entre a duração da digestão tecidual no rendimento celular total e a expressão de CD 11 B e CD 11 C é ilustrada nas seis figuras a seguir. O tecido intestinal que é digerido por três minutos produz um baixo número total de células, resultando em poucos dcs e macrófagos disponíveis para caracterização A digestão do tecido por 11 minutos produz um rendimento robusto de células vivas, produzindo populações de dcs e macrófagos que expressam altos níveis de CD 11 B e CD 11 C que são fenotipicamente distintos.

Em contraste, a digestão por 50 minutos resulta em um rendimento celular semelhante em comparação com a digestão otimizada. No entanto, o delineamento de diferentes populações de células usando CD 11 B e CD 11 C torna-se mais difícil. À medida que a expressão de CD 11 C diminui e o número de células mortas aumenta.

Portanto, ao otimizar os parâmetros para a digestão do tecido intestinal, um rendimento celular robusto pode ser alcançado rapidamente. Como resultado, o rápido isolamento de DCS e macrófagos intestinais de camundongos pode ser útil para avaliar as propriedades funcionais de células imunes com antígenos de superfície intactos.