Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo
5 de abril de 2012
Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.
O objetivo geral deste procedimento é revelar padrões complexos de expressão gênica em uma estrutura cerebral inteira e intacta. Isso é realizado primeiramente por meio da perfusão do animal e da remoção do cérebro. Em seguida, o cerebelo é dissecado e processado utilizando o protocolo de coloração em montagem inteira.
O passo final consiste em visualizar a expressão gênica utilizando uma reação colorimétrica histoquímica. Em última instância, utiliza-se microscopia de campo claro para imagens dos padrões de expressão gênica na superfície. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como imunohistoquímica em cortes de tecido, é a capacidade de visualizar padrões complexos em três dimensões sem a necessidade de reconstrução.
Quem demonstra o procedimento é Joshua White, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Após sacrificar o animal e remover o cérebro do crânio, separe o cerebelo do restante do cérebro inserindo primeiro as pontas de um par de pinças no meio dos colículos superiores e inferiores. Em seguida, utilizando um segundo par de pinças, separe lentamente os colículos e o córtex do cerebelo.
Oriente o cerebelo de modo que o lado anterior esteja voltado para baixo e o tronco encefálico aponte para cima. Agora insira a pinça na quarta ventrículo entre o tronco encefálico e os lóbulos nove e 10 do cerebelo. Corte os pedúnculos apertando com a pinça em ambos os lados e, em seguida, levante suavemente o cerebelo afastando-o do tronco encefálico.
Pós-fixar o cerebelo por imersão em paraformaldeído 4% a quatro graus Celsius por um período mínimo de 24 a 48 horas. O cerebelo pode ser armazenado em paraformaldeído 4% por um período prolongado enquanto se trabalha em uma cabine de segurança. Derrame cuidadosamente a solução de paraformaldeído e substitua por fixador denso.
Coloque o tubo contendo o cerebelo e a solução fixadora em um agitador e agite suavemente por seis a oito horas. Após o tempo de incubação, descarte a solução fixadora e substitua por água sanitária concentrada. Incube o cerebelo nesta solução durante a noite a quatro graus Celsius com agitação no dia seguinte.
Substitua a solução no tubo por metanol a 100%. Coloque o tubo no agitador e agite suavemente em temperatura ambiente por 30 minutos. Após o tempo de incubação, substitua a solução por metanol a 100% fresco e repita a incubação para garantir a desidratação do cerebelo.
Agora, congele e descongele o tecido em metanol 100% colocando o tubo em um recipiente com gelo seco e congele por 30 minutos. Após esse tempo, use pinças para remover o tubo do gelo seco e, em seguida, coloque sobre a bancada para descongelar por 15 minutos. Repita o procedimento de congelamento e descongelamento pelo menos quatro vezes para aumentar a penetração das soluções de coloração.
Após o degelo final, coloque o tubo no congelador a menos 80 graus Celsius durante a noite. O tecido pode ser armazenado por longos períodos a menos 80 graus Celsius, imediatamente antes ou após as etapas de congelamento-degelo. Caso contrário, o protocolo deve ser continuado.
No dia seguinte, reidrate o cerebelo por imersão com agitação em 50% metanol e 50% PBS, seguido de 15% metanol e 85% PBS, e então 100% PBS, durante 60 a 90 minutos cada, à temperatura ambiente. Em seguida, para o cerebelo de camundongo adulto, submeta o tecido à digestão enzimática com 10 microgramas por mililitro de proteinase K em PBS, durante dois a três minutos à temperatura ambiente com agitação.
Esta etapa de digestão não é necessária para cerebelos de camundongos P5 ou mais jovens. Após a digestão, descarte imediatamente a proteinase K e lave o cerebelo em PBS três vezes, por 10 minutos cada, para evitar superdigestão. Após a lavagem final, substitua a solução por PBSMT e ROCK e mantenha em 4 graus Celsius durante a noite para bloquear o tecido no dia seguinte.
Descarte a solução bloqueadora de P-B-S-M-T e incube o tecido no anticorpo primário diluído em P-B-S-M-T, suplementado com 5% de DMSO, por 48 horas a quatro graus Celsius com agitação. Após o tempo de incubação, lave o cerebelo duas a três vezes, por duas a três horas cada, em P-B-S-M-T a quatro graus Celsius com agitação, para remover os anticorpos primários não ligados.
Em seguida, incubar o tecido no anticorpo secundário em uma solução de P-B-S-M-T com 5% de DMSO a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, com agitação, lavar o cerebelo em P-B-S-M-T como antes. Em seguida, realizar uma lavagem final em PBT por uma a duas horas com agitação a quatro graus Celsius.
Esta etapa remove o excesso de leite e melhora a nitidez da coloração. Por fim, incubar o tecido na solução de DAB. Até que a intensidade ideal de coloração seja alcançada, é preferível usar DAB no escuro.
Como a luz provoca a precipitação do cromógeno, o que pode aumentar a coloração de fundo. O produto da reação marrom deve ficar claramente visível dentro de 10 minutos, quando a intensidade ideal de coloração for atingida. Interrompa a reação colocando o cerebelo em PBS com 0,4% de azida sódica.
O tecido pode ser armazenado a longo prazo nesta solução. O tecido corado em montagem inteira deve ser analisado enquanto imerso em PBS ou outro meio que proporcione um índice de refração ideal. Para posicionar facilmente a montagem inteira durante a análise, prepare um gel de ágar 1% em uma placa de Petri de plástico.
Em seguida, corte pequenos orifícios no gel e insira o cerebelo nesses orifícios na orientação desejada para a imagem, cobrindo o cerebelo com PBS. O tecido corado está agora pronto para ser analisado por microscopia óptica. ZEIN two Adelaide c.
A imunohistoquímica revela faixas sagitais em cortes transversais do cerebelo. Os lábios quatro, cinco e três estão identificados no diagrama. Para fins de orientação, a barra de escala representa 500 micrômetros.
ZEIN dois. O C de Adelaide é expresso exclusivamente em subconjuntos de células kinji sata e dendritos. Nesta imagem, a barra de escala representa 150 mícrons.
Esta imagem mostra um cerebelo inteiro corado para a zeína dois, Adela C, revelando faixas de células bicelulares em imagens das zonas anterior, central e posterior do cerebelo. Os numerais romanos indicam os lobos cerebelares. LS é o lobo simplice.
PML significa lábio paramediano. COP indica os parâmetros e rótulos copulares. Crosta um e crosta dois indicam os nomes de dois LOE de hemisfério, e as designações P um e P três baseiam-se em uma nomenclatura padrão utilizada para indicar faixas específicas de BR dois.
Para mais detalhes, Sillitoe e Hawks 2002. A barra de escala representa um milímetro. Aqui, o cerebelo foi imunomarcado com um anticorpo contra o peptídeo do transcripto regulado pela cocaína e anfetamina.
Pode-se observar. O cart é expresso em subconjuntos de fibras trepadoras que atravessam a camada de células em forma de biquíni rotulada como PCL e terminam na camada molecular rotulada como ml. Aqui, a barra de escala representa 100 mícrons.
Pode-se observar nesta imagem que as fibras cart positivas projetam faixas de dendritos celulares do tipo biquíni na camada molecular do córtex cerebelar, incluindo regiões como o Oculus rotulado como PFL e o Oculus rotulado como fl. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar cortes no cerebelo. Qualquer dano externo obscurecerá a visibilidade dos padrões complexos de coloração.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como revelar padrões complexos e interessantes de expressão gênica em neurônios e nas fibras que os contatam no cérebro intacto.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para revelar a topografia cerebral global por meio de coloração imunohistoquímica em preparações inteiras. A técnica permite a visualização de padrões complexos de expressão gênica em três dimensões, aplicada especificamente ao cerebelo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunohistoquímica
- Topografia Cerebral
Contexto
- Os circuitos neurais são organizados em compartimentos funcionais.
- Compreender a topografia cerebral é essencial para a pesquisa em neurociência.
- Os métodos tradicionais podem não visualizar eficazmente padrões complexos.
- A coloração em preparações inteiras oferece uma abordagem inovadora para estudar estruturas cerebrais.
Objetivo do Estudo
- Revelar padrões complexos de expressão gênica em estruturas cerebrais intactas.
- Demonstrar a utilidade da coloração imunohistoquímica em preparações inteiras.
- Visualizar padrões de expressão gênica em três dimensões.
Métodos Utilizados
- Perfusão do animal e remoção do cérebro.
- Dissecação do cerebelo.
- Aplicação do protocolo de coloração em preparação inteira.
- Visualização da expressão gênica utilizando reações colorimétricas histoquímicas.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de padrões de expressão gênica na superfície.
- Demonstração das vantagens do método em comparação com a imunohistoquímica em seções de tecido.
- Capacidade de observar padrões complexos sem necessidade de reconstrução.
Conclusões
- A técnica de coloração em preparação inteira é eficaz para o estudo da topografia cerebral.
- Este método aprimora a compreensão da organização dos circuitos neurais.
- Oferece uma ferramenta valiosa para pesquisas futuras em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imuno-histoquímica em preparações inteiras permite a visualização direta de padrões complexos de expressão proteica em estruturas cerebrais intactas, fornecendo uma visão tridimensional da topografia molecular sem artefatos de reconstrução. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao revelar distribuições espacialmente resolvidas de biomarcadores em circuitos neurais relevantes para doenças, aumentando a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. O método é particularmente valioso para reduzir riscos em programas direcionados ao SNC, esclarecendo relações anatômico-funcionais no início da fase de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da análise da expressão proteica na arquitetura tridimensional nativa do cérebro.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da compartimentalização molecular.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao esclarecer a localização de biomarcadores nas vias cerebelares e aferentes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, preservando a topologia intacta do tecido.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios por meio de protocolos reprodutíveis de coloração em preparações inteiras.
- Escalabilidade: Destaca a reutilização da plataforma para estudos comparativos entre espécies e estágios de desenvolvimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Discute a relevância para doenças por meio da visualização de projeções aferentes e da topografia molecular.
- Alinhamento Pré-clínico: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, utilizando zebrinaII/aldolaseC como exemplo de biomarcador.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Enfoca a redução preditiva de riscos ao revelar padrões complexos em conformação nativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiando a redução de riscos biológicos e a clarificação de vias na pesquisa do sistema nervoso central.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses ao revelar padrões de expressão gênica em lobos e zonas cerebelares intactos.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio por meio da coloração e imagem padronizadas da expressão gênica superficial em três dimensões.
- Análises: Destaca leituras quantitativas obtidas a partir de reações colorimétricas histoquímicas que permitem a comparação da intensidade de expressão entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica por meio da visualização das projeções das fibras aferentes e seus campos terminais nas camadas moleculares.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para estudos comparativos de topografia em modelos de roedores e regiões cerebrais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista no mapeamento de circuitos neurais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da coloração em preparações inteiras para análise de padrões de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados espacialmente resolvidos de biomarcadores.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em neuroanatomia, imunohistoquímica e microscopia.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo micrótomos, agitadores rotativos, congeladores e microscópios de campo claro.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de fixação, desidratação, bloqueio e incubação com anticorpos.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo cerebelos de camundongo e rato, e diferentes estágios de desenvolvimento.
- Limitações práticas respaldadas pelo material de origem, como a necessidade de evitar danos mecânicos durante a dissecção para preservar a clareza da coloração.
