Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo
22 de maio de 2012
Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.
O objetivo geral do procedimento a seguir é medir a cinética e a progressão do ciclo celular. Primeiro, as células são marcadas com romo, desoxiuridina ou BRDU, que é incorporado ao DNA celular no lugar da timidina. Em seguida, as células são imunomarcadas com anticorpos contra BRDU e analisadas por citometria de fluxo imediatamente após a coloração.
Apenas as células na fase S são marcadas, pois as células marcadas progridem pelo ciclo celular até a G dois. Elas são detectadas com conteúdo de quatro NDNA após a mitose. O conteúdo de DNA é reduzido para dois N. Assim, a análise dos perfis de fluorescência gerados por citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a cinética da progressão do ciclo celular.
A principal vantagem desta técnica em relação a outros protocolos que utilizam produtos químicos para a sincronização celular é que não há perturbações fisiológicas que possam afetar inadvertidamente o maquinário da divisão celular. Utilizamos este método pela primeira vez quando nossas tentativas de estudar a taxa de progressão do ciclo celular por meio da sincronização química nos forneceram resultados inesperados que interferiram em nossa análise. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular.
Por exemplo, qual é a base para as taxas diferenciais de crescimento entre diferentes tipos celulares? Inicie este protocolo com o marcação pulse-chase das células com BRDU para fazer isso. Comece marcando uma placa de 10 centímetros para cada ponto temporal, além de uma para cada um dos seguintes controles.
Apenas BRDU, apenas PI, negativo para BRDU, negativo para PI: semeie cada placa com cinco vezes 10 à quinta. Células MCF7 em DMEM suplementado, incubar as placas por 24 a 48 horas para permitir que as células recuperem e adiram. Quando as células atingirem 60% de confluência, substituir o meio por DMEM fresco contendo 10 micromolares.
Incube as células com BRDU por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ para permitir a incorporação de BRDU ao DNA. Certifique-se de deixar uma placa sem tratamento para servir como controle negativo ou ponto de tempo zero após uma hora. Remova o meio de marcação por pulso e lave brevemente as células com PBS para os pontos de tempo de duas a oito horas.
Adicione meio de crescimento fresco e coloque as placas de volta no incubador. Em seguida, colete imediatamente as placas dos pontos temporais de zero e uma hora conforme descrito na próxima seção. Para colher as células, aspire o meio e enxágue a placa.
Uma vez com PBS, depois a tripsina atua sobre as células para destacá-las da placa e coletá-las em DMEM centrifugado a 390 × g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células com um a cinco mililitros de PBS gelado, centrifugue a 390 × g durante cinco minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em cem microlitros de gelo.
PBS frio contendo 1% de FBS. O FBS ajuda a prevenir a agregação celular. Um dos aspectos mais importantes deste procedimento é garantir que você tenha uma suspensão de células individuais a partir das células colhidas.
Para fatos. Para conseguir isso, você pode adicionar suas células diretamente à gota de etanol, gota a gota. Isso é crítico. A seguir, para fixar as células, use a pipeta para adicionar as células, gota a gota, a cinco mililitros de gelo seco.
70% de etanol em um tubo cônico de 15 mililitros. Incube as células em gelo por 30 minutos ou armazene-as a quatro graus Celsius durante a noite. Esta é uma etapa ideal para interromper a coleta de amostras dos diferentes pontos temporais; as amostras podem permanecer em etanol por vários dias, permitindo que sejam processadas simultaneamente no restante do protocolo para coloração com BRDU e iodeto de propídio.
Retire as células de quatro graus Celsius e centrifugue-as a 390 ×g durante cinco minutos. Após a centrifugação, aspire a maior parte do fixador, deixando cerca de 50 microlitros. Em seguida, vortex.
Para soltar o pellet e desnaturar o DNA durante a vórtex. Adicione lentamente um mililitro de HCl 2 N com Triton X-100 gota a gota, em seguida, incube as amostras à temperatura ambiente por 30 minutos. Peline as células centrifugando as amostras por cinco minutos a 390 ×g, depois aspire e descarte o sobrenadante.
Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de borato de sódio 0,1 molar. Após a centrifugação, aspire novamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 75 microlitros de coloração com BRDU.
Incube por 45 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz, após a incubação. Peline as células por centrifugação, como anteriormente, e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS contendo cinco microgramas por mililitro de iodeto de propídio. Ao analisar a amostra positiva para PI no citômetro de fluxo, crie um gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral para garantir a distribuição adequada do tamanho das células.
Esses dois parâmetros devem ser representados em uma escala linear. Visualize simultaneamente um gráfico de FL três H versus FL dois W para observar a marcação com PI em relação à largura do pulso de fluorescência. Esse gráfico é utilizado para criar um portão que isole a fração de células consideradas dentro do padrão de distribuição normal do ciclo celular.
De modo geral, esse padrão de distribuição é caracterizado por dois agrupamentos de células com conteúdos de N e quatro NDNA da marcação com PI, representando as fases G um e G dois do ciclo celular, respectivamente. Uma fileira de células localizada entre esses dois agrupamentos representa a replicação contínua do DNA que ocorre na fase S do ciclo celular. Crie um gráfico exibindo as células selecionadas com FL um H ou FITC em escala logarítmica no eixo Y e PI em escala linear no eixo X.
Este gráfico será usado para definir os parâmetros restantes utilizando os diversos controles, bem como para coletar dados. Para análise, coloque a amostra corada apenas com PI na porta de carregamento do citômetro de fluxo e ajuste o ganho para posicionar o pico G1 em aproximadamente 200 no eixo x. Isso será mais fácil de visualizar em um gráfico de histograma da coloração com PI.
Em seguida, coloque a amostra somente com BRDU no orifício de carga e execute. Ajuste o ganho para que as duas populações de células, positivas e negativas para BRDU, apareçam no gráfico. Idealmente, as células negativas para BRDU devem estar posicionadas exatamente em ou abaixo de 10 elevado a um.
O último controle é a amostra negativa BDU/trincos PI. Execute este controle negativo para garantir que as células não apareçam em nenhum dos quadrantes superiores ou direitos. Uma vez que os parâmetros dos vários gráficos tenham sido definidos, o citômetro de fluxo é calibrado e está pronto para o processamento de células marcadas com BRDU e PI. Colete dados de um mínimo de 10.000 células com porta PI para cada amostra.
Em seguida, utilizando softwares como FlowJo ou FACS Diva, crie um gráfico de FITC versus PI com as células selecionadas como positivas para PI a partir do gráfico de dispersão de PI versus FL dois. Para distinguir a população em ciclo. Em seguida, gere uma segunda seleção para isolar a população positiva para BRDU.
Em seguida, para acompanhar a evolução temporal da progressão do ciclo celular, plote o número de células positivas para BRDU com conteúdo em G1 ou G2 em função do tempo, a fim de comparar a progressão do ciclo celular. A cinética entre duas linhagens celulares colorretais, HT 29 e LS 180. As células foram coletadas a cada hora durante oito horas após a remoção do pulso de A-B-R-D-U.
Comparando a cinética dos dois perfis, a emergência de um pico na fase G1 é evidente no tempo de quatro horas após a adição de BRDU nas células LS 180, em comparação com o ponto temporal correspondente da linhagem celular HT 29, que não apresenta esse pico. Isso indica uma progressão acelerada do ciclo celular através da fase G2 do ciclo celular. Na linhagem celular colorretal LS 180, para gerar um perfil de ciclo da linhagem celular de câncer de mama.
Células MC seven foram coletadas a cada hora durante oito horas. Após a remoção do pulso de BRDU. As células imunomarcadas e com coloração de contraste de DNA foram então separadas com base em seus sinais fluorescentes.
Como pode ser observado aqui, as células CF7 ciclaram em uma taxa significativamente mais lenta do que qualquer uma das duas linhagens celulares colorretais testadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o marcador metabólico do DNA em conjunto com a coleta em pontos temporais permite acompanhar a cinética do ciclo celular.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para acompanhar a progressão e a cinética do ciclo celular utilizando marcação metabólica e coloração de DNA. A abordagem elimina a necessidade de sincronização química, reduzindo o risco de danos no DNA não específicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Análise do Ciclo Celular
- Citometria de Fluxo
Antecedentes
- A compreensão da dinâmica do ciclo celular é fundamental para diversos estudos biológicos.
- Métodos tradicionais podem introduzir artefatos devido à sincronização.
- A marcação metabólica fornece uma representação mais precisa das fases do ciclo celular.
- A citometria de fluxo permite uma análise precisa das células marcadas.
Objetivo do Estudo
- Para medir a cinética da progressão do ciclo celular.
- Para utilizar a marcação com BrdU para rastrear a síntese de DNA.
- Para analisar as fases do ciclo celular sem sincronização química.
Métodos Utilizados
- Marcação por pulso-afastamento com BrdU ou outros nucleosídeos.
- Imunomarcação com anticorpos contra BrdU.
- Análise por citometria de fluxo de células marcadas.
- Detecção do conteúdo de DNA para identificar as fases do ciclo celular.
Resultados Principais
- Células em fase S são efetivamente marcadas com BrdU.
- A citometria de fluxo revela alterações no conteúdo de DNA conforme as células progridem pelo ciclo.
- O método permite o rastreamento em tempo real da cinética do ciclo celular.
- Danos não específicos ao DNA são minimizados, aumentando a confiabilidade dos dados.
Conclusões
- A combinação de marcação metabólica e citometria de fluxo é eficaz para estudar a dinâmica do ciclo celular.
- Essa abordagem fornece informações sobre a progressão do ciclo celular sem os inconvenientes da sincronização química.
- Aplicações adicionais deste método poderiam aprimorar nossa compreensão da biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição precisa da cinética da progressão do ciclo celular é essencial para reduzir os riscos na validação inicial de alvos em oncologia e para otimizar a triagem de compostos em modelos de doenças proliferativas. A marcação metabólica combinada com citometria de fluxo permite uma avaliação quantitativa e livre de artefatos da dinâmica do ciclo celular, reforçando a confiabilidade preditiva em estudos de investigação de vias e mecanismos. Essa abordagem aprimora a tomada de decisões em portfólios ao fornecer dados robustos e reprodutíveis sobre a proliferação celular e a resposta a fármacos, sem os artefatos confundidores associados à sincronização.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a medição direta da cinética do ciclo celular para esclarecer a função de vias e o engajamento de alvos.
- Reduz a ambiguidade mecanicista ao evitar artefatos de sincronização química ou mecânica.
- Amplia a confiança preditiva na avaliação de taxas diferenciais de crescimento entre linhagens celulares.
- Facilita a validação funcional de alvos reguladores do ciclo celular em pesquisas oncológicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece leituras padronizadas e quantitativas da distribuição e progressão das fases do ciclo celular.
- Melhora a reprodutibilidade do ensaio ao minimizar perturbações fisiológicas durante a preparação da amostra.
- Permite triagem de alto conteúdo dos efeitos de compostos na cinética do ciclo celular em modelos relevantes para doenças.
- Apoia fluxos de trabalho escaláveis e prontos para plataformas, para avaliação de compostos e triagem de compostos líderes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha as medições cinéticas do ciclo celular com pontos finais de proliferação relevantes para a doença.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, acompanhando os efeitos da droga na progressão do ciclo celular.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos e específicos para cada fase do ciclo celular.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas em modelos oncológicos translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de marcação metabólica e citometria de fluxo integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando tanto testes iniciais de hipóteses quanto o perfilamento de compostos em etapas subsequentes.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a progressão do ciclo celular para esclarecer a atividade de vias e validar alvos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para triagem de compostos e desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Fornece dados de alta resolução e em curso temporal sobre transições de fases do ciclo celular para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a cinética do ciclo celular in vitro com a proliferação relevante para doenças e respostas a fármacos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e com poucos artefatos, adaptável entre linhagens celulares e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos do ciclo celular.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios do ciclo celular.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados cinéticos robustos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas em oncologia e doenças proliferativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo e técnicas de imunomarcação.
- Necessita de acesso a instrumentação de citometria de fluxo e software analítico.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de marcação e seleção de populações celulares.
- Adaptável a diversas linhagens celulares, mas pode exigir otimização para modelos específicos.
- A preparação da amostra e a precisão na seleção de populações celulares são fundamentais para medições cinéticas confiáveis.
