Name: Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Aprenda a analisar metilação de DNA em ovócitos individuais usando mutagênese bissulfito e PCR nested. Este método permite estudar regulação epigenética em desenvolvimento embrionário sem contaminação celular.

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Este trabalho foi financiado pela Universidade de Western Ontario, no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, e uma bolsa ER06-02-188 a partir da Pesquisa MINISTÉRIO e Inovação, Prêmio Pesquisador precoce. MMD foi apoiada por um programa de treinamento CIHR em Reprodução, Desenvolvimento precoce eo Impacto na Saúde Bolsas de Pós-Graduação (REDIH).

DIA 1 Prepare as seguintes soluções frescas no dia da coleta de oócitos com água destilada estéril como GIBCO água. Para reduzir a chance de contaminação de DNA, mudar frequentemente e usar luvas de pontas com filtro. Manter tubos angular longe quando aberto, e recapitular todos os tubos quando não em uso. Sugerimos que as soluções são feitas como se n +1. 3% de agarose LMP 30 mg baixo ponto de fusão (LMP) Agarose até 1 ml de H2O GIBCO dissolver @ 70 ° C Solução de lise 8 ul de tampão de lise 1 uL de proteinase K 1 uL de 10% IGEPAL lugar em gelo até estar pronto para utilização 02:01 Agarose: solução de lise (10 uL por oócito indivíduo, a quantidade é de 3 oócitos) 20 ul de 3% de agarose LMP 10 ul da solução de lise misturar @ 70 ° C Ly SDSsis tampão (501 ul por oócito individual) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> 50 uL </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> 501 ul </td></tr></tbody></table> 1. Recolha de ovócitos <ol><li> Coloque os ovidutos rato dissecadas em mídia M2, e rasgar a ampolas para extrair o complexo de células cumulus. </li><li> Separa-se os oócitos a partir do complexo de células do cumulus usando 0,3 mg / ml em solução de hialuronidase uma queda de 30 uL de meios M2. Manter os oócitos em solução apenas enquanto que leva para remover as células do cumulus, como a exposição prolongada pode danificar. Lave os oócitos em 3x a queda de 30 ul de mídia M2, removendo as células cumulus periodicamente. </li><li> Remover a zona pelúcida utilizando uma solução ácida de Tyrode. Coloque os oócitos em uma queda de 30 ml de solução em primeiro lugar, e depois transferir para outras 30gota ul, como quaisquer meios transportados ao longo irá diluir o ácido e reduzir a sua eficiência. Manter os oócitos em solução apenas enquanto que leva para remover a zona, como a exposição prolongada pode danificar. Nota: um aumento da concentração de solução ácida de Tyrode ou pronase podem ser utilizados para amostras humanas, tal como o ser humano zona pelúcida é mais resistente ao tratamento com solução ácida de Tyrode do que o rato. </li><li> Lavar os oócitos mais uma vez em uma queda de 30 uL de meios M2. </li></ol> 2. Agarose Embedding e Lise <ol><li> Para realizar a incorporação de agarose, colocar a solução de lise em um 70 ° C heatblock. Adicionar o pré-aquecido LMP de agarose para a solução de lise, produzindo um agarose 02:01: solução de lise. </li><li> Coloque um único óvulo numa lâmina de vidro limpa no mínimo mídia M2. Tome-se 10 uL da agarose: solução de lise numa ponta de pipeta, e (sob um microscópio) suavemente expelir uma pequena quantidade (~ 1 uL ou menos) para a lâmina de vidro, permitindo que ele se misturar com o minimal mídia. Levante com cuidado o oócito na ponta da pipeta e colocar todos os ul 10 em um tubo Eppendorf com 300 uL de óleo mineral para o talão forma uma esfera. Nota: este processo tem de ser feito muito rapidamente como a agarose vai endurecer se a temperatura descer tão pouco como 5 ° C abaixo de 70 ° C. </li><li> Incubar o tubo em gelo durante 10 minutos. Para realizar a lise, remover o óleo mineral 300 uL e adicionar 500 uL de tampão de lise SDS. Incubar durante uma noite em um banho de água 50 ° C. Nota: solução de lise (Tabela 1) podem também ser utilizados para esta finalidade. </li></ol> DIA 2 Preparar as seguintes soluções frescas no dia da mutagénese bissulfito. Para reduzir a chance de contaminação do DNA, mudar frequentemente e usar luvas de pontas com filtro. Manter tubos angular longe quando aberto, e recapitular todos os tubos quando não em uso. Sugerimos que as soluções são feitas como se n +1. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M de NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g de NaOH em ​​20 ml autoclavado ddH2O </td></tr><tr><td> 0,1 M de NaOH </td><td> 0,5 ml de 3M em 14,5 ml autoclavado ddH2O </td></tr><tr><td> 0,3 M de NaOH </td><td> 1,5 ml de 3M em 13,5 ml autoclavado ddH2O </td></tr></tbody></table> Solução 2,5 M Bissulfito <ol class="lalpha"><li> 3,8 g de bissulfito de sódio 5,5 ml GIBCO H2O destilada 1 ml NaOH 3 M dissolver @ temperatura ambiente </li><li> 110 mg Hidroquinona 1 ml GIBCO H2O destilada dissolver @ 90 ° C (apenas durante o tempo que leva a dissolver-se, misturar regularmente) </li></ol> Quando completamente dissolvido, misturar a solução (a) e (b) * Mantenha longe de luz * 3. Mutagênese Bissulfito <ol><li> Remover completamente a 500 uL de tampão de lise de SDS e adicionam-se 300 uL de óleo mineral (~ 20 horas). Qualquer tampão de lise restante irá diluir the agarose quando é aquecido ea esfera será mais susceptível a dissolução nos passos subsequentes. Prosseguir com mutagénese bissulfito imediatamente, ou armazenar a -20 ° C durante até 5 dias. </li><li> Se for o caso, remova os oócitos do congelador e deixe descongelar (somente até agarose grânulo é relativamente translúcido). Incubar durante 2,5 minutos num bloco de aquecimento 90 ° C, após o que Incubar em gelo durante 10 minutos. Nota: Não misturar ou agitar, estender mais do que 2,5 minutos, ou flutuar temperatura. </li><li> Para realizar a desnaturação, remover o óleo mineral e adicionar 1 ml 0,1 M de NaOH para cada tubo de filme, e inverter 5-6 vezes. </li><li> Incubar durante 15 minutos num banho-maria a 37 ° C, invertendo a cada 3-4 minutos. O grânulo deve flutuar no NaOH. </li><li> Para realizar tratamento com bissulfito, girar suavemente o tubo, em seguida, remover o NaOH e adicionar 300 ul de óleo mineral e 500 solução de bissulfito ul. Incubar o tubo para 3,5 horas a 50 ° C em banho. * Mantenha longe de luz * </strong&gt; Nota: Comprimento de incubação pode precisar de ser determinada empiricamente para o gene de interesse. </li><li> Para executar dessulfonação, incubar em gelo durante 3 minutos, em seguida remover o óleo mineral e da solução de bissulfito, girar suavemente, e adicionar 1 ml 0,3 M de NaOH. Flick e inverter 5-6 vezes. </li><li> Incubar durante 15 minutos num banho-maria a 37 ° C, invertendo a cada 3-4 minutos. O grânulo deve flutuar no NaOH. </li><li> Lavar as amostras, por fiação primeiro suavemente, em seguida remover o NaOH e adicionar 1 ml 1x TE pH 7,5. Agitar durante 5-10 minutos à temperatura ambiente (num agitador). Gire suavemente novamente, em seguida, remova o TE 1x. Repetir este processo de lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml autoclavado DDH 2 O. Agitar durante 5-10 minutos à temperatura ambiente (num agitador). Gire suavemente, em seguida, remover o H 2 O. Repita DDH 2 lavagem O duas vezes. </li><li> Verificar o pH do sobrenadante, que deve ser 5,0 pH. Se ainda demasiado básico, lavar novamente com H2O Remova todo o sobrenadante, deixando apenas a ser agaroseanúncio. </li></ol> 4. 1 ª e 2 ª Rodada de amplificação por PCR <ol><li> Prepare 1 ª rodada ** PCR mix enquanto lava ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 Primer mM Encaminhar Exterior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 Reverso Primer mM Exterior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 13 ul </td></tr></tbody></table> Adicionar ao Illustra Ready-to-Go Hot contas de início de PCR Deslize cuidadosamente o sólido agarose esferas dentro do tubo de PCR (~ ul 10) Aquecer até 70 ° C e misturar Adicionar 25 ul de óleo mineral Total: 50 ul <ol start="2"><li> Amplificar Nota: Um exemplo de condições de ciclismo para mouse SNRPN é desnaturação durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1minutos a 68 ° C, e um passo final de 10 minutos de alongamento a 68 ° C. Recozimento temperatura para 1 º ciclo de PCR para mouse e H19 Peg3 é de 50 ° C. </li><li> Prepare 2 ª rodada PCR mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 Primer mM Encaminhar Interior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 Reverso Primer mM Interior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 19 ul </td></tr></tbody></table> Adicionar ao Illustra Ready-to-Go Hot contas de início de PCR Adicionar 5 ul 1 produto Rodada st como um modelo. Aquecer o produto 1 r rodada a 70 ° C durante 1 minuto para amolecer a agarose. Certifique-se de pipetar abaixo da camada de óleo mineral. Adicionar 25 ul de óleo mineral Total: 50 ul Nota: sequências de primers aninhados para SNRPN, H19, e Peg3 pode ser encontrado no Mercado Velker et al 10,12. <ol start="4"><li> Amplificar Nota: As condições de amplificação para o rato é SNRPN desnaturação durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1 minuto a 68 ° C, e um alongamento final de 10 minutos passo a 68 ° C 10. Rato H19 e Peg3 requerem uma a 50 ° C de temperatura para recozimento 2 nd ciclo de PCR. </li><li> Como um teste de diagnóstico, a segunda amostras redondas pode ser cortada com uma enzima de restrição que é a metilação ou estirpe específica. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª Rodada de produto </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Enzima de Restrição </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tampão </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Electroforese dos produtos de digestão num gel de acrilamida a 8%. Todas as bandas heterogêneos representar mais de um Sequence. </li></ol> 5. TA Clonagem e Colônia PCR <ol><li> Para clonar 2 produto nd rodada, o calor primeiro a 70 ° C durante 1 minuto para amolecer a agarose, em seguida, ligadura no vector utilizando o Promega pGEM-T Vector System (Fisher Scientific Cat # A1360). </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª Rodada de PCR </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> pGEMT-EASY vector </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Ligase </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> Tampão de ligação 2x </td><td> 5 ul </td></tr></tbody></table> Incubar durante a noite @ 4 ° C em máquina de PCR. <ol start="2"><li> Descongelar as células competentes de E. coli em gelo durante 15 minutos (Zymo Research Cat # Corp T3009). Adicionar 3 reacção de ligação uL de 8 uL E.coli e ligadura incubar em gelo durante 15 minutos. </li><li> Choque térmico durante 40 segundos em um banho-maria 42 ° C,e incubar em gelo durante 2 minutos. Adicionar 60 ul meio SOC e incubar a 37 ° C durante 1 hora (em agitador). </li><li> Coloque toda a mistura de reacção sobre uma placa de agar LB / / IPTG / Xgal / Amp e placa incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Prepare mix colônia PCR </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 mM primer forward M13 </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 20 uM iniciador reverso de M13 </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 5X Verde Go Taq Buffer de </td><td> 7,0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM de dNTP </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td> 0,28 ul </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 25,62 ul </td></tr><tr><td></td><td> 35 Total ul </td></tr></tbody></table> Adicionar 35 ul Colony PCR master mix em um tubo de PCR. Escolha uma colónia branca bacteriana a partir da placa com uma ponta de pipeta, e agite-lo para a reacção de PCR. <ol start="6"><li> Amplificar com a desnaturação durante 10 minutos a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, e 1 minuto a 72 ° C, e um passo final de alongamento 10 minutos a 72 ° C. Electroforese 4 uL sobre um 1,5% de gel de agarose. Enviar ~ uL 30 do produto de PCR para a sequenciação. Nota: Para oócitos, 5 produtos de PCR de colônia são seqüenciados. </li><li> Uma vez que os resultados de sequenciação são obtidos, padrões de metilação pode ser lido. Qualquer CG original que se manteve como um CG foi metilado, e qualquer CG original, que é agora uma TG foi não metilado. </li></ol> 6. Os resultados representativos No nosso trabalho, nós ensaio impressa metilação em oócitos individuais e embriões (Figura 1). Após amplificação por PCR aninhada utilizando iniciadores bissulfito convertidos, é possível confirmar uma conversão bem sucedida, visualizando um tamanho do fragmento correcto sobre um gel de agarose (Figura 2). Um oócito indivíduorepresenta um alelo parental, e em teoria, tem um padrão de metilação impresso. Como tal, segundo ciclo de PCR produtos podem ser testados para a contaminação não intencional. Uma enzima de restrição sensíveis à metilação de DNA (como HinfI ou DpnII) pode ser usado para digerir o segundo produto de PCR rodada para avaliar se ele contém um alelo metilado ou não metilado (Figura 3). Um C metilado no interior da sequência de reconhecimento da enzima é clivado, enquanto um C não metilado que é convertido em T não é reconhecido pela enzima e é cortada. Qualquer amostra de oócitos MII contendo ambos os alelos metilados e não metiladas deve ser descartado, uma vez que é indicativo de contaminação cumulus celular (Figura 3). Após ligação e transformação, bem sucedida colónia de amplificação por PCR podem ser visualizados num gel de agarose para assegurar as amostras com o tamanho do produto correcto são enviados para a sequenciação (Figura 4). Finalmente, a seqüência de cinco cl indivíduomais de um ovócito MII deve produzir cinco padrões de metilação idênticos e as taxas de conversão nonCpG idênticos (Figura 5A). Qualquer amostra que contêm mais do que um padrão deve ser eliminada (Figura 5b). Uma vez que os oócitos ovulados MII tem duas cópias do cromossoma ou um corpo em anexo polar, existe uma possibilidade para a obtenção de dois padrões de sequência semelhante (Figura 5C). Recomendamos descartando dados a partir de oócitos que têm padrões de metilação altamente desiguais desde a contaminação de células cumulus não pode ser descartada. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do único ensaio de mutagênese Oocyte Bissulfito. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados representativos de 2 ª rodada de amplificação para SNRPN de um cantarle oócito MII em um gel de agarose 1,5%. As pistas 1-4 são quatro oócitos individuais Mii e pista 5 é um controle negativo (sem oócito). Tamanho amplicon esperado para SNRPN é de 420 pb. Escada L,. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados representativos de digestão de restrição 2 nd rodada-metilação específico para SNRPN a partir de um oócito MII única em um gel de acrilamida a 8%. HinfI digestão de restrição de diagnóstico mostra ADN não metilado que abriga um T que suprime o local de restrição (420bp, pista 1) ou ADN metilado que contém um local de reconhecimento C dentro de (corte, 262, 103, e 54 pb, pista 2). Digestão mostrando locais de restrição tanto metilados e não metilado enzima de bandas de corte e não cortada, pista 3) são indicativos de contaminação de células do cumulus. Escada L,. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Figura 4. </strong&gt; Os resultados representativos para a amplificação por PCR de colónias para SNRPN a partir de um oócito MII única em um 1,5% de gel de agarose. Tamanho amplicon esperado após a ligadura do SNRPN no vetor pGEM-T Easy e usando M13 forward e primers reversos é 656 bp. Pista 1-8, amplicões a partir de clones 1-8. Clone 5 tem um tamanho de fragmento amplificado incorrecta e não deve ser enviada para a sequenciação. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Figura 5. Representativas sequenciação resultados para SNRPN a partir de um oócito MII único. SNRPN é metilado em oócitos. Círculos pretos indicam CpGs metilados. Círculos brancos indicam CpGs não metiladas. Número de CpG e colocação é representativo para um rato B6 estirpe feminina. a) Esperado sequenciação resultados para SNRPN a partir de um oócito MII único. Apenas um cordão único de DNA deve amplificar em todos os cinco clones. Oócitos com um único padrão de metilação e patter conversão idêntica não CpGn devem ser incluídos nas análises (percentagem de conversão de não-CpGs indicado à direita foi calculada como o número de não-CpG citosinas convertidos para timina como uma percentagem do total não-CpG citosinas). b) resultados de sequenciação para SNRPN a partir de um ovócito MII único com a contaminação de células cumulus. Observe a dessemelhança entre os estados de metilação e padrões de conversão, indicando amplificação vertente múltipla. c) Seqüenciamento resultados para SNRPN a partir de um ovócito MII única com ambas as cópias do cromossoma ou inclusão corpo polar.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este ensaio único óvulo contém muitas etapas com um número que são críticas e requerem cuidados especiais. A primeira é a lavagem do oócito. É particularmente importante para lavar cada oócito várias vezes em meio fresco cai após o tratamento hialuronidase para remover as células do cumulus tantas quanto possível. Além disso, quando a transferência de ovócitos a solução ácida de Tyrode para zona pelúcida remoção certifique-se envolvente meio é claro de células do cumulus. O oócito é muito pegajosa após a remoção zona, e...

Tabela de reagentes específicos e equipamentos. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td colspan="4"> Recolha de ovócitos </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Ácida de Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> IGEPAL 10% </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solução de lise </td></tr><tr><td> Tris pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LIDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS Tampão de Lise </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Conversão Bissulfito </td></tr><tr><td> Hidróxido de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrogenossulfito de sódio (bissulfito de sódio) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hidroquinona </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> Meio M2 </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO água destilada </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclavado duas vezes água destilada (dd) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Iniciar Hot Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml de levedura tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de reacção 5x Verde GoTaq </td><td> PróMega </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Interno e externo primers aninhados </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligadura </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Vector Fácil </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Competentes células de E.coli </td><td> Zymo Research Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C e 90 ° C Calor Blocos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C e 50 ° C Os tanques de imersão (42 ° C para as transformações) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cadeira de balanço </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Máquina de PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutagênese bissulfito Único de ovócitos

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenética engloba todas hereditárias e modificações reversíveis de cromatina que alter acessibilidade gene e, portanto, são os principais mecanismos de regulação da transcrição do gene 1. Metilação do DNA é uma modificação epigenética, que atua predominantemente como uma marca repressiva. Através da adição covalente de um grupo metilo em citosinas na dinucleótidos CpG, pode recrutar adicionais proteínas repressores e modificações histona para iniciar processos envolvidos na condensação da cromatina e silenciamento de genes 2. Metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento normal, pois desempenha um papel fundamental na programação do desenvolvimento, diferenciação celular, a repressão de elementos retrovirais, inativação do cromossomo X e imprinting genômico. Um dos métodos mais poderosos para a análise de metilação de DNA é a mutagénese bissulfito. Bissulfito de sódio é um agente mutagénico DNA que deaminates citosinas em uracilos. Após amplificação por PCR e Seque<html> ncing, estes eventos de conversão são detectados como timinas. Citosinas metiladas são protegidos de desaminação e, assim, permanecer como citosinas, permitindo a identificação de metilação de ADN a nível individual de nucleótidos 3. Desenvolvimento da mutagênese bissulfito avançou daqueles originalmente informados 4-6 para aqueles que são mais sensíveis e reprodutíveis 7. Um avanço chave foi a incorporação de pequenas quantidades de DNA em um grânulo de agarose, protegendo assim o DNA a partir do tratamento com bissulfito dura 8. Esta análise de metilação habilitado a ser realizada em piscinas de oócitos e embriões em estágio de blastocisto 9. O protocolo de mutagênese mais sofisticado bissulfito de data é para cada estágio de blastocisto-embriões 10. No entanto, uma vez que os blastocistos têm, em média 64 células (contendo 120-720 pg de DNA genómico), este método não é eficaz para os estudos de metilação em oócitos individuais ou de clivagem-stage embriões. tenda &quot;&gt; Tomar pistas de agarose incorporação de quantidades de DNA minutos, incluindo oócitos 11, aqui apresentamos um método pelo qual os oócitos são diretamente incorporado em um agarose e solução de lise talão de recuperação imediatamente a seguir e remoção da zona pelúcida do ovócito. Isso nos permite ignorar os dois principais desafios da mutagénese único oócito bissulfito:. protectores uma pequena quantidade de DNA a partir de degradação, e subsequente perda durante os passos do protocolo numerosas importante, como os dados são obtidos a partir de oócitos individuais, a questão da PCR viés dentro piscinas é eliminado Além disso. , a contaminação de células do cumulus inadvertida é detectável por este método uma vez que qualquer amostra com mais do que um padrão de metilação pode ser excluídos da análise 12. Este protocolo fornece um método melhorado para análises de sucesso e reprodutível de metilação do DNA ao nível de uma única célula e é idealmente adequado para oócitos individuais, bem como estágios de clivagem dos embriões.

Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

A epigenética abrange todas as modificações hereditárias e reversíveis da cromatina que alteram a acessibilidade gênica e, portanto, são os mecanismos primários para...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a metilação do DNA em um único ovócito. Isso é realizado primeiramente removendo as células do cúmulo e a palita de sabão dos ovócitos coletados. O segundo passo é embutir o ovócito em uma solução de lise de aros na proporção de dois para um, a fim de proteger a pequena quantidade de DNA contra perda ou degradação.Em seguida, realiza-se a mutagênese com bisulfito, seguida de amplificação por reação em cadeia da polimerase aninhada. O passo final consiste em ligar e clonar o produto da PCR. Os clones são então selecionados, amplificados por PCR e enviados para sequenciamento.No final, a mutagênese com bissulfito e o sequenciamento são utilizados para demonstrar a metilação do DNA em dinucleotídeos citosina-fosfato-guanina, ou CpG, de uma região de interesse em um único ovócito. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a mutagênese com bissulfito em grandes números de células, é que os dados podem ser obtidos a partir de um único ovócito sem a necessidade de agrupar cito, viés de PCR e contaminação por células quiméricas. No dia da coleta dos ovócitos, prepare frescamente as soluções listadas no protocolo escrito; ao preparar as soluções, reduza a chance de contaminação do DNA trocando as luvas com frequência, utilizando ponteiras com filtro, mantendo os tubos inclinados quando abertos e recolocando as tampas em todos os tubos quando não estiverem em uso.Inicie a coleta de OSI colocando os ovidutos dissecados do camundongo em meio M dois e rompendo a polpa M para extrair o complexo de células do cúmulo. Em seguida, separe os cítos do complexo de células do cúmulo utilizando uma solução de hialuronidase a 0,3 miligramas por mililitro em uma gota de 30 microlitros de meio M dois. Mantenha os cítos em solução apenas pelo tempo necessário para remover as células do cúmulo, pois exposições prolongadas podem danificá-los.Lave os ovócitos em gotas de 30 microlitros de meio M2, transferindo os ovócitos de uma gota para outra. Remova periodicamente as células do cúmulo, para um total de três lavagens. Remova a zona pelúcida utilizando solução ácida de tiró.Primeiro, coloque os ovócitos em uma gota de 30 microlitros de solução, depois transfira para outra gota de 30 microlitros. Qualquer meio carregado pode diluir o ácido e reduzir sua eficiência. Mantenha os ovócitos na solução apenas pelo tempo necessário para remover a zona, pois exposições prolongadas podem danificá-los.Após a remoção da zona, lave novamente os ócitos em uma gota de 30 microlitros de meio M dois para realizar a inclusão em agarose. Primeiro, coloque a solução de lise em um bloco de aquecimento a 70 graus Celsius. Adicione a agarose de ponto de fusão baixa, ou LMP Agarose, pré-aquecida à solução de lise, produzindo uma proporção de dois para um de agarose para solução de lise. Em seguida, coloque um único ovócito em uma lâmina de vidro limpa com quantidade mínima de meio M dois.O próximo passo é incorporar o único citoplasma na solução de agarose e lise. Isso deve ser feito rapidamente, pois a agarose endurece em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius. Aspire 10 microlitros da solução de agarose e lise para dentro de uma ponteira de pipeta sob um microscópio.Expulse suavemente cerca de um microlitro ou menos da solução de lise agros sobre a lâmina de vidro, permitindo que se misture com o meio mínimo. Levante suavemente o ovócito para dentro da ponteira do pipeto. Em seguida, coloque os 10 microlitros em um tubo einor com 300 microlitros de óleo mineral, de modo que a gota resultante assuma uma forma esférica.Incube o tubo no gelo por 10 minutos para realizar a lise. Remova 300 microlitros de óleo mineral e adicione 500 microlitros do tampão de lise SDS. Incube a amostra durante a noite em banho-maria ajustado a 50 graus Celsius no segundo dia.Prepare as soluções de mutagênese com sulfeto frescas conforme descrito no protocolo escrito. Inicie a mutagênese removendo completamente os 500 microlitros de tampão de lise SDS. Tenha em mente que qualquer tampão de lise remanescente diluirá os agros quando for aquecido, e as esferas serão mais suscetíveis à dissolução nas etapas subsequentes.Após a remoção completa do tampão de lise, adicione 300 microlitros de óleo mineral. Incube a amostra por dois minutos e meio em um bloco térmico a 90 graus Celsius. Tenha cuidado para não misturar, agitar, estender ou variar a temperatura.Após dois minutos e meio, incubar a amostra em gelo por 10 minutos. Para realizar a desnaturação, remover o óleo mineral e adicionar um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 molar ao tubo, agitar e inverter o tubo de cinco a seis vezes.Incube a amostra por 15 minutos. Em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius, inverta o tubo a cada três a quatro minutos; a esfera deve flutuar no hidróxido de sódio. Observe que a esfera não está mais no fundo do tubo.Para realizar o tratamento com sulfito, gire suavemente o tubo após a remoção do hidróxido de sódio. Adicione 300 microlitros de óleo mineral e 500 microlitros da solução de sulfito BIS. Tenha cuidado para evitar exposição à luz e incube o tubo por três horas e meia em banho-maria a 50 graus Celsius.Agora realize a desnaturação. Primeiro, incube a amostra em gelo por três minutos antes de remover o óleo mineral e a solução de bisulfito. Após uma centrifugação suave, adicione um mililitro de hidróxido de sódio 0,3 molar, agite e inverta o tubo de cinco a seis vezes.Incube a amostra por 15 minutos. Em banho-maria a 37 graus Celsius, invertendo a cada três a quatro minutos, novamente, a esfera deve flutuar no hidróxido de sódio antes de iniciar a PCR. Lave as amostras primeiramente centrifugando suavemente.Em seguida, remova o hidróxido de sódio e adicione um mililitro de um XTE pH 7,5. Agite por cinco a dez minutos à temperatura ambiente. Após uma segunda centrifugação suave, remova o XTE 1X.Repita este processo de lavagem duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de água destilada autoclavada. Agite por cinco a dez minutos à temperatura ambiente, centrifugue suavemente pela terceira vez e remova a água.Repita a lavagem com água destilada duas vezes. Por fim, remova todo o sobrenadante, deixando apenas a esfera de aros. Verifique se o pH do sobrenadante é 5,0.Se o sobrenadante ainda estiver muito básico, lave as esferas novamente com água bidestilada. Enquanto isso, adicione a mistura da primeira rodada de PCR ao tubo de PCR conforme descrito no protocolo escrito. Deslize o agitador sólido até a borda do tubo einor.Em seguida, transfira cuidadosamente a agro velocidade para o tubo de PCR e aqueça a 70 graus Celsius por um minuto, misture e, então, proceda à amplificação conforme sugerido no protocolo escrito. Após a amplificação da primeira rodada, prepare a reação de PCR da segunda rodada utilizando cinco microlitros do produto da primeira rodada como molde. Certifique-se de pipetar abaixo da camada de óleo mineral.Prossiga para realizar a segunda rodada de amplificação conforme indicado no texto como um teste diagnóstico. As amostras da segunda rodada podem ser cortadas com uma enzima de restrição específica para metilação ou cepa, e os produtos da digestão podem ser separados por eletroforese em gel de acrilamida a 8%. Quaisquer bandas heterogêneas resultantes representam mais de uma sequência; para clonar o produto da segunda rodada, ligue-o ao vetor e realize a clonagem TA conforme descrito no manuscrito que acompanha este vídeo. Após a clonagem TA, plaque toda a mistura da reação em uma placa de ágar e LB, suplementada com ampicilina, X-gal e IPTG, e incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite.Em seguida, adicione a mistura mestra de PCR de colônia ao tubo de PCR conforme indicado no protocolo escrito. Escolha uma colônia bacteriana branca da placa com a ponteira de uma pipeta e agite-a em 35 microlitros da mistura mestra de PCR de colônia em um tubo de PCR. Prossiga com a amplificação da suspensão conforme descrito no texto, seguido de eletroforese de quatro microlitros do produto de PCR em um gel de AGROS 1,5%.Por fim, envie aproximadamente 30 microlitros do produto de PCR para sequenciamento de cinco PCRs de colônia por cito. Após obter os resultados de sequenciamento, os padrões de metilação podem ser lidos: qualquer citosina-guanina original que permaneceu inalterada estava metilada. Inversamente, qualquer citosina-guanina original que agora é uma timina-guanina estava desmetilada após amplificação por PCR aninhada utilizando primers convertidos por bisulfito.É possível confirmar uma conversão bem-sucedida ao visualizar um tamanho correto do fragmento em um gel de arfos em metáfase individual. Dois ovócitos representam um alelo parental e, em teoria, possuem um padrão de metilação genomicamente impresso. Dessa forma, os produtos da segunda rodada de PCR podem ser testados para contaminação não intencional.Uma enzima de restrição sensível à metilação do DNA pode ser usada para digerir o produto da PCR da segunda rodada, a fim de avaliar se ele contém um alelo metilado ou não metilado. Aqui, uma citosina metilada dentro da sequência de reconhecimento da enzima é clivada. Enquanto uma citosina não metilada, que é convertida em timina, não é mais reconhecida pela enzima e permanece não cortada, qualquer amostra de oócito em metáfase II que contenha ambos os alelos, metilado e não metilado, deve ser descartada, pois é indicativa de contaminação por células do cumulus ou inclusão do corpo polar, após a ligação e transformação.A amplificação bem-sucedida da PCR de colônia pode ser visualizada em um gel AROS para garantir que as amostras com o tamanho correto do produto sejam enviadas para sequenciamento. Para este exemplo, o tamanho esperado do amplicon após a ligação é de cento e cinquenta e seis pares de bases. Aqui, o clone cinco apresenta um tamanho incorreto de amplicon e não deve ser enviado para sequenciamento.A sequência de cinco clones individuais de um óvulo em metáfase dois deve produzir cinco padrões idênticos de metilação e taxas idênticas de conversão não CPG. Quaisquer amostras que contenham mais de um padrão devem ser descartadas. Como os óvulos em metáfase dois ovulados possuem duas cópias cromossômicas ou um corpúsculo polar anexo, existe a possibilidade de obter dois padrões de sequência semelhantes.Os dados devem ser descartados de qualquer cito que apresente padrões de metilação altamente dissimilares. Como a contaminação por células do cúmulo não pode ser descartada ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se, primeiramente, de lavar múltiplas vezes os ovócitos em meio fresco, após o tratamento com HI IDE, para remover o maior número possível de células do cúmulo. Em segundo lugar, o agarose de ponto de fusão baixo irá endurecer em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius, portanto trabalhe com cuidado, mas rapidamente.E, por fim, o bisulfato de sódio e a hidroquinona são sensíveis à luz, portanto os tubos de reação e as soluções devem ser envolvidos em papel alumínio.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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