Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

O objetivo geral deste procedimento é analisar a metilação do DNA em um único oócito. Isso é feito removendo primeiro as células do cumulus e a palita de sabão dos oócitos coletados. O segundo passo é incorporar o oócito em uma solução de lise de aros dois para um para proteger a pequena quantidade de DNA de ser perdida ou degradada.

Em seguida, a mutagênese de bissulfito é realizada, seguida de amplificação por meio da reação em cadeia da polimerase aninhada. A etapa final é ligar e clonar o produto de PCR. Os clones são então escolhidos, amplificados por PCR e enviados para sequenciamento.

Em última análise, a mutagênese e o sequenciamento de bissulfito são usados para mostrar a metilação do DNA no guinéu de fosfato de citosina ou dinucleotídeos CPG de uma região de interesse em um único oócito. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a mutagênese de bissulfito de grandes números de células, é que os dados podem ser obtidos de um único oócito sem agrupar citos, viés de PCR e contaminação de células quimioterápicas. No dia da coleta de oócitos, prepare as soluções listadas no protocolo escrito ao fazer soluções, reduza a chance de contaminação do DNA trocando as luvas com frequência e usando pontas de filtro também mantenha os tubos afastados quando abertos e retampe todos os tubos quando não estiverem em uso.

Comece a coleta de OSI colocando os ovadutos de camundongo dissecados em M dois meios e rasgando a polia M para extrair o complexo de células cumulus. Em seguida, separe os citos do complexo de células do cumulus usando 0,3 miligramas por mililitro de solução de hialuronidase em uma gota de 30 microlitros de M dois meios. Mantenha os citos em solução apenas o tempo necessário para remover as células do cumulus, pois a exposição prolongada pode danificá-las.

Lave os oócitos em gotas de 30 microlitros de M dois meios, transferindo os oócitos de gota em gota. Removendo as células do cumulus periodicamente por um total de três lavagens. Remover o Z de LUCITA utilizando uma solução ácida de tiro.

Primeiro coloque os oócitos em uma gota de 30 microlitros de solução e, em seguida, transfira para outra gota de 30 microlitros. Como qualquer meio transportado irá diluir o ácido e reduzir sua eficiência. Mantenha os citos em solução apenas o tempo necessário para remover a zona, pois a exposição prolongada pode danificá-los.

Após a remoção da zona, lave os citos novamente em uma gota de 30 microlitros de M dois meios para realizar a incorporação de agros em primeiro lugar a solução de lise em um bloco de calor de 70 graus Celsius. Adicione o baixo ponto de fusão pré-aquecido, ou LMP Agros à solução de lise, produzindo uma solução de dois para um AGROS para lise. Em seguida, coloque um único oócito em uma lâmina de vidro limpa em no mínimo M dois meios.

O próximo passo é incorporar o único cite na solução de Agros e lise. Isso deve ser feito rapidamente, pois os agros endurecerão em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius. Pegue 10 microlitros da solução de lise Agros em uma ponta de pipeta sob um microscópio.

Expulse suavemente cerca de um microlitro ou menos da solução de lise agrícola na lâmina de vidro, permitindo que ela se misture com o meio mínimo. Pegue suavemente o oócito na ponta da pipeta. Em seguida, coloque todos os 10 microlitros em um tubo einor com 300 microlitros de óleo mineral para que o cordão resultante assuma uma forma esférica.

Incube o tubo no gelo por 10 minutos para realizar a lise. Remova os 300 microlitros de óleo mineral e adicione 500 microlitros do tampão de lise SDS. Incubar a amostra durante a noite em banho-maria regulado para 50 graus Celsius no segundo dia.

Preparar as soluções de mutagénese bissulfeto frescas, tal como descrito no protocolo escrito. Comece a mutagênese removendo totalmente os 500 microlitros de tampão de lise SDS. Lembre-se de que qualquer tampão de lise remanescente diluirá o agros quando for aquecido e o cordão será mais suscetível a se dissolver nas etapas subsequentes.

Após a remoção completa do tampão de lise, adicione 300 microlitros de óleo mineral. Incube a amostra por dois minutos e meio em um bloco de calor de 90 graus Celsius. Tome quilates para misturar ou mexer, estender ou flutuar a temperatura.

Depois de dois minutos e meio. Incubar a amostra no gelo durante 10 minutos. Para realizar a desnaturação, remova o óleo mineral e adicione um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 molar ao movimento do tubo e inverta o tubo cinco a seis vezes.

Incubar a amostra durante 15 minutos. Em um banho-maria ajustado para 37 graus Celsius invertendo a cada três ou quatro minutos, o cordão deve flutuar no hidróxido de sódio. Observe que o cordão não está mais na parte inferior do tubo.

Para realizar o tratamento com sulfito, primeiro gire o tubo suavemente após a remoção do hidróxido de sódio. Adicione 300 microlitros de óleo mineral e 500 microlitros de solução de sulfito BIS. Tome cuidado para evitar a exposição à luz e incube o tubo por três horas e meia em banho-maria a 50 graus Celsius.

Agora execute a desinação. Primeiro incube a amostra no gelo por três minutos antes de remover o óleo mineral e a solução de sulfito BIS. Após uma centrifugação suave, adicione um mililitro de hidróxido de sódio 0,3 molar e inverta o tubo cinco a seis vezes.

Incubar a amostra durante 15 minutos. Em um banho-maria de 37 graus Celsius invertendo a cada três a quatro minutos, novamente, o grânulo deve flutuar no hidróxido de sódio antes de iniciar a PCR. Lave as amostras girando primeiro suavemente.

Em seguida, remova o hidróxido de sódio e adicione um mililitro de um xte pH 7,5. Agite por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Após uma segunda centrifugação suave, remova o XTE.

Repita este processo de lavagem duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de autoclave, água duplamente destilada. Agite por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente, gire suavemente pela terceira vez e retire a água.

Repita a lavagem com água destilada duas vezes. Por fim, remova todo o sobrenadante, deixando apenas o cordão de aro. Verifique se o pH do sobrenadante é 5,0.

Se o sobrenadante ainda for muito básico, lave as contas novamente com água bidestilada Enquanto isso, adicione a primeira mistura de PCR redonda ao tubo de PCR conforme descrito no protocolo escrito. Deslize a velocidade agro sólida até a borda do tubo einor.

Em seguida, transfira cuidadosamente a velocidade agro para o calor do tubo PCR a 70 graus Celsius por um minuto e misture, em seguida, amplie é sugerido no protocolo escrito. Após a amplificação da primeira rodada, prepare a reação de PCR da segunda rodada usando cinco microlitros do produto da primeira rodada como modelo. Certifique-se de bipa abaixo da camada de óleo mineral.

Prossiga para realizar a segunda rodada de amplificação conforme indicado no texto como um teste de diagnóstico. As amostras da segunda rodada podem ser cortadas com uma enzima de restrição que é metilação ou eletroforese específica da cepa os produtos de digestão em um gel de 8% de acrilamida. Quaisquer bandas heterogêneas resultantes representam mais de uma sequência para clonar o produto da segunda rodada ligar-se ao vetor e realizar a clonagem de TA conforme descrito no manuscrito que acompanha este vídeo após a placa de clonagem de TA, toda a reação se mistura em uma placa de ágar e LB, suplementada com ampicilina, ex gal e IPTG e incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, adicione a mistura principal de PCR da colônia ao tubo de PCR, conforme listado no protocolo escrito. Escolha uma colônia bacteriana branca da placa com uma ponta de pipeta e agite-a em 35 microlitros da mistura principal de PCR da colônia em um tubo de PCR. Prossiga para amplificar a suspensão conforme descrito no texto após a eletroforese de amplificação por PCR quatro microlitros do produto de PCR em um gel 1.5%AGROS.

Finalmente, envie aproximadamente 30 microlitros do produto de PCR para sequenciamento de cinco PCRs de colônia por cite. Uma vez obtidos os resultados do sequenciamento, os padrões de metilação podem ser lidos em qualquer citosina guanina original que permaneceu como tal foi metilada. Por outro lado, qualquer citosina guanina original que agora é uma tiamina guanina foi desmetilada após amplificação por PCR aninhada usando primers convertidos em bissulfito.

É possível confirmar uma conversão bem-sucedida visualizando um tamanho de fragmento correto em uma metáfase individual de gel de aro. Dois oócitos representam um alelo parental e, em teoria, têm um padrão de metilação impresso Como tal. Os produtos de PCR de segunda rodada podem ser testados quanto à contaminação não intencional.

Uma enzima de restrição sensível à metilação do DNA pode ser usada para digerir o produto de PCR de segunda rodada para avaliar se ele contém um alelo metilado ou não metilado. Aqui, uma citosina metilada dentro da sequência de reconhecimento enzimático é clivada. Enquanto uma citosina não metilada que é convertida em timina não é mais reconhecida pela enzima e não é cortada, qualquer amostra de oócito metafásico dois contendo alelos metilados e não metilados deve ser descartada, pois é indicativa de contaminação de células do cumulus ou inclusão de corpo polar após a ligação e transformação.

A amplificação bem-sucedida da PCR da colônia pode ser visualizada em um gel AROS para garantir que as amostras com o tamanho correto do produto sejam enviadas para sequenciamento. Para este exemplo, o tamanho esperado do amplicon após a ligação é de cem 56 pares de bases. Aqui, o clone cinco tem um tamanho de amplicon incorreto e não deve ser enviado para sequenciamento.

A sequência de cinco clones individuais de um oócito metafásico dois deve produzir cinco padrões de metilação idênticos e taxas de conversão não CPG idênticas. Todas as amostras que contenham mais de um padrão devem ser descartadas. Como os citos ovulados da metáfase dois têm duas cópias cromossômicas ou um corpo polar anexado, existe a possibilidade de obter dois padrões de sequência semelhantes.

Os dados devem ser descartados de quaisquer citos que tenham padrões de metilação altamente diferentes. Como a contaminação das células do cumulus não pode ser descartada Ao tentar este procedimento, é importante lembrar primeiro de lavar os oócitos várias vezes em meio fresco, após o tratamento HI IDE para remover o maior número possível de células cumulativas. Em segundo lugar, os agros de baixo ponto de fusão endurecerão em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius, portanto, trabalhe com cuidado, mas rapidamente.

E, finalmente, o sulfato de bis de sódio e a hidroquinona são sensíveis à luz, portanto, os tubos e soluções de reação devem ser embrulhados em papel alumínio.