As formulações para liofilização de bactérias e sua influência na sobrevivência das células

O objetivo do seguinte experimento é observar o efeito que diferentes tipos de formulações para liofilização têm na sobrevivência celular. Para começar, preparam-se diferentes formulações para liofilização de culturas celulares. Em seguida, cada formulação é misturada com a cultura celular, liofilizada, posteriormente reidratada e as taxas de sobrevivência são medidas.

Os resultados mostram diferenças nas taxas de sobrevivência que podem ser associadas às propriedades caracterizadas. Este método pode ajudá-lo a compreender quais propriedades físicas e estruturais de uma formulação são importantes para a sobrevivência celular durante a desidratação. Para preparar uma cultura inicial de pseudomonas putter, comece inoculando 100 mililitros de caldo tripticaseína de soja, ou TSB, com uma colônia de células cultivadas em ágar suplementado com caldo tripticaseína de soja ou TSB; incube a cultura a 30 graus Celsius, sob agitação de 130 RPM, por sete horas.

Transfira uma alíquota do cultivo para TSB fresco e incube por 16 horas. Recolha as células por centrifugação a 1.500 × g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Lave o pellet celular por ressuspensão em cloreto de sódio 150 milimolar.

Centrifugue as células e reconstitua. Suspenda-as em meio de formulação. Para preparar soluções de formulação para liofilização de células.

Pese os respectivos componentes da matriz e dissolva-os em água para obter condições isotônicas. Ajuste a solução com o excipiente, cloreto de sódio, ou outros solutos compatíveis com células. Para ressuspender homogeneamente as células em uma solução de baixa viscosidade, agite-as em vórtex; para as soluções de alta viscosidade, agite-as vigorosamente.

Adicione uma barra de agitação e agite a mistura. Em seguida, divida as formulações em frascos pré-pesados para liofilização e pese os frascos. Retire 100 microlitros de cada amostra e faça diluições seriadas dez vezes, plaque as diluições desejadas e incube-as à temperatura ambiente. Se os frascos forem selados dentro do liofilizador, coloque uma rolha de borracha em cada frasco a partir das células plaqueadas.

Conte as células em cada formulação. Utilizando o método dune, meça a tensão superficial das misturas bacterianas previamente secas. Limpe o anel de platina colocando-o numa chama incolor até que fique vermelho.

Usando acetona e um lenço sem fiapos, enxágue e limpe o recipiente de medição e use uma chama para queimar o interior. Encha o recipiente com a solução e deixe a superfície estabilizar antes de medir, para soluções que demoram a atingir o equilíbrio. A montagem utilizada aqui fornecerá dados qualitativos para formulações com altas viscosidades.

Utilize uma solução de concentração mais baixa para medir a tensão superficial e extrapolar as condições de liofilização, que precisam ser ajustadas de acordo com as propriedades físicas da formulação. O parâmetro mais importante é a temperatura de transição vítrea ou TG da formulação, denominada TG linha para a amostra congelada concentrada, o que indica que ainda há presença de água. Para determinar o comportamento de congelamento da fórmula, encerre de cinco a dez miligramas da amostra em um recipiente de alumínio para calorimetria exploratória diferencial (DSC) com tampa.

Prepare uma panela vazia como referência. Configure o programa de varredura de temperatura do DSC para imitar a etapa de congelamento no programa de liofilização. Isso é feito porque a cinética de resfriamento pode influenciar a temperatura de transição vítrea (TG') das formulações não liofilizadas antes do início da varredura de aquecimento.

Reduza a temperatura bem abaixo da tg esperada. Para as formulações investigadas, escolha uma taxa de aquecimento apropriada. O sinal de fluxo de calor registrado é expresso em watts e será influenciado pela taxa de aquecimento.

Uma taxa de aquecimento mais alta fornecerá um sinal maior de TG primária; defina a faixa de temperatura de modo que cubra tanto a TG primária quanto a fusão da formulação. Após o comportamento de congelamento ter sido determinado, ajuste os parâmetros do processo de liofilização para que a temperatura da amostra esteja sempre abaixo da TG da amostra e para que a pressão da câmara permita a sublimação rápida do gelo e da água residual na formulação. Para proteger os produtos secos após a liofilização.

Controle a atmosfera da amostra selando as amostras no liofilizador antes que o vácuo seja liberado ao final do ciclo de liofilização. Alternativamente, os frascos podem ser preenchidos com uma atmosfera desejada. É importante evitar expor as amostras às condições ambientes, pois qualquer umidade ou oxigênio presente na atmosfera de armazenamento influenciará a sobrevivência das células.

Por fim, pese os frascos para analisar as amostras por raios X. Coloque uma pequena quantidade da matriz bacteriana em um suporte de amostra e fixe o suporte no refratômetro de raios X. Utilize o software compatível com o equipamento de raios X para analisar qualquer fase cristalina presente na amostra.

Para analisar a matriz bacteriana por microscopia eletrônica, monte uma pequena quantidade em fita de carbono fixada em um suporte para microscopia eletrônica de varredura (MEV). Insira o suporte do MEV em um aparelho de metalização e recubra a amostra com ouro e paládio ou platina para obter a imagem. Coloque o suporte do MEV na câmara e selecione os parâmetros de imagem apropriados.

Por exemplo, neste instrumento utilizamos uma tensão de aceleração de cinco quilovolts, um tamanho de ponto três, uma distância de trabalho de cinco milímetros e o detector de elétrons secundários. Esta tabela lista dados para diferentes formulações, incluindo eventos térmicos registrados por DSC durante o aquecimento das formulações congeladas, estrutura das amostras secas e a tensão superficial das soluções de formulação. A temperatura de transição vítrea (Tg') da sacarose é de menos 40 graus Celsius e pode ser difícil detectar concentrações de sacarose abaixo de 20% peso por peso.

O evento térmico a menos 35 graus Celsius provavelmente está relacionado ao início da dissolução do gelo mostrado aqui. Dados de sobrevivência para a bactéria gram-negativa P putter e a gram-positiva, a CHLOROPHYL cus, formuladas em diferentes formulações à base de sacarídeos. Observe que a tendência no desempenho da formulação no suporte à sobrevivência celular é semelhante para ambas as espécies bacterianas.

Este gráfico ilustra a correlação entre a sobrevivência após liofilização e as tensões superficiais das formulações, indicando que tensões superficiais mais altas resultam em maiores taxas de sobrevivência. As imagens de MEV mostradas aqui representam formulações secas de quatro polímeros diferentes, cujas matrizes apresentam aparência de papel crocante ou folhas lisas interconectadas com padrões ondulados de bactérias embutidas para fi, ccal e sacarose. As folhas têm cerca de um mícron de espessura e de 10 a 20 mícrons de largura, sendo que fi ccal apresenta uma superfície mais lisa em comparação com HPMC e HEC, que formam folhas muito mais finas.

E as bactérias são mais facilmente visíveis, possivelmente porque a proporção polímero-bactérias é menor nessas formulações à base de celulose. Além disso, cristais de sal foram observados em HEC e HPMC, sendo que este último apresentou maior quantidade de precipitados na superfície das lâminas poliméricas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a sobrevivência celular depende das propriedades da formulação, utilizando as técnicas aqui apresentadas.