A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

O objetivo geral do experimento a seguir é converter um ensaio Eliza pré-otimizado para a citocina TNF Alpha na plataforma Xap enquanto avalia pares alternativos de anticorpos. Isso é obtido acoplando o anticorpo de captura do kit ELIZA, juntamente com três outros anticorpos de captura candidatos a quatro conjuntos diferentes de microesferas ou esferas quando misturados. Esses quatro conjuntos permitem o teste simultâneo de todos os quatro candidatos com quatro anticorpos de detecção separados para determinar o melhor par de anticorpos.

Os próximos dois ensaios Xap são construídos com os dois pares de anticorpos mais ideais. O desempenho dos ensaios é então comparado ao do ensaio EISA original em relação à intensidade do sinal, faixa dinâmica e sensibilidade. Os resultados mostram que anticorpos semelhantes podem ter um desempenho muito diferente nas mesmas condições e que vários anticorpos podem ser rastreados simultaneamente usando o ensaio Luminex Xap, revelando que o ensaio aumentou a sensibilidade e a faixa dinâmica quando comparado ao EISA.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o EIS A, é que os imunoensaios baseados em xap permitem que o pesquisador teste vários alvos ou, como neste caso, teste vários anticorpos simultaneamente. Identificar o melhor anticorpo demonstrado. O procedimento será de Erica Lopez, cientista associada da Luminex Corporation.

Comece este protocolo com a seleção e preparação de quatro anticorpos de captura e quatro anticorpos de detecção específicos para TNF alfa humano, conforme descrito no protocolo escrito. Além disso, prepare um anticorpo de confirmação específico para a espécie hospedeira dos anticorpos de captura. Leve os reagentes do kit de acoplamento de anticorpos à temperatura ambiente.

Rotule quatro tubos de reação com os números da região do cordão selecionados para a reação de acoplamento. Transfira o conteúdo dos quatro frascos para injetáveis de microesferas magnéticas para os quatro tubos de reação marcados. Lave cada um dos conjuntos de esferas duas vezes em 500 microlitros de tampão de ativação e ative cada conjunto de esferas com as soluções de sulf ONHS e EDC conforme descrito no kit de acoplamento de anticorpos.

Manual do usuário após uma incubação de 20 minutos em um rotador, repita a etapa de lavagem anterior com os grânulos agora ativados um total de três vezes com 500 microlitros de tampão de ativação. Para cada lavagem, prepare quatro soluções separadas de 500 microlitros. Cada um contendo 7,5 microgramas de tampão de inativação de anticorpos de captura.

Adicione essas quatro soluções de anticorpos de captura aos seus respectivos tubos de reação. Vortex cada tubo imediatamente e incubar por duas horas em um rotador. Repita a etapa de lavagem com os grânulos agora acoplados um total de três vezes com 500 microlitros do tampão de lavagem incluído no kit de acoplamento de anticorpos.

Após a etapa final de lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem a cada tubo de reação para fornecer uma concentração final de estoque de 5 milhões de grânulos acoplados a anticorpos por vórtice de mililitro e, em seguida, sonicar os tubos de reação para dispersar os grânulos. Conte o número de grânulos recuperados após a reação de acoplamento usando um contador de células ou hemocitômetro. A recuperação da reação de acoplamento é normalmente superior a 90% Confirme se a reação de acoplamento foi bem-sucedida preparando soluções de teste dos estoques de grânulos acoplados para cada conjunto com uma concentração final de 100 grânulos por microlitro no tampão de ensaio, prepare a diluição da espécie antis marcada com FICO erything.

Anticorpo de confirmação de IgG a quatro microgramas por mililitro em alíquota tampão de ensaio 50 microlitros de cada solução de teste em quatro poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços para um total de 16 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio em oito dos poços para medir o fundo e 50 microlitros de anticorpo de confirmação diluído nos oito poços restantes. Misture as reações suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes com um pipetador multicanal.

Cubra o prato e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador de pratos. Coloque a placa em um separador de placa magnética por um a dois minutos para retirar as esferas da solução. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver no separador sobre um recipiente de resíduos.

Lave cada poço duas vezes adicionando 100 microlitros de tampão de ensaio e removendo o SANE da placa de maneira semelhante. Usando o separador de placa magnética, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de ensaio, pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com um pipetador multicanal. Analise no instrumento luminex xap, como o instrumento magix.

A intensidade do sinal fluorescente dessa reação é diretamente proporcional à quantidade de proteína na superfície dos grânulos, fornecendo uma avaliação rápida da quantidade relativa de proteína acoplada aos grânulos. Para determinar o par de anticorpos mais eficaz no ensaio xap, prepare uma mistura inicial de todos os quatro conjuntos de esferas adicionando 10 microlitros de cada um a 0,96 mililitros de tampão de ensaio. Preparar as soluções de anticorpos de detecção diluindo cada anticorpo a um micrograma por mililitro em tampão de ensaio.

Também um tampão de ensaio. Preparar o padrão de proteína TNF alfa dos sistemas r e d a 2000 picogramas por mililitro e diluir a estreptavidina R FICO eryn a oito microgramas por mililitro. Adicione 50 microlitros da mistura de esferas acopladas a anticorpos a cada um dos 16 poços de uma placa de fundo redondo CoStar de 96 poços para o ensaio de triagem.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio a oito dos 16 poços para medir o fundo. Em seguida, pipete 50 microlitros do padrão TNF alfa para os outros oito poços para medir a resposta. Incube por uma hora em temperatura ambiente protegido da luz enquanto agita em um agitador de placas de ensaio.

Em seguida, adicione 50 microlitros de cada um dos quatro anticorpos de detecção a quatro poços, dois dos quais são poços de fundo e dois dos quais são poços de resposta. Incubar por 30 minutos nas mesmas condições após a adição de 50 microlitros do reagente SAPE a todos os poços. Incubar novamente durante 15 minutos nas mesmas condições.

Coloque a placa em um separador magnético de placas por um minuto. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver no separador sobre um recipiente de resíduos. Pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada um dos 16 poços.

Em seguida, remova o líquido das esferas usando separação magnética. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada um dos 16 poços. Leia a placa com o instrumento de palhetas magnéticas Luminex consultando o manual do usuário para operação adequada.

Selecione um par de anticorpos que atenda à intensidade do sinal desejada. Depois de selecionar o melhor para capturar o anticorpo, dilua 100 microlitros desse estoque de batida acoplado a anticorpos para 10 mililitros com tampão de ensaio. Adicione 50 microlitros dos grânulos diluídos a 78 poços de duas placas de fundo redondo CoStar de 96 poços.

Cada placa será usada para avaliar o desempenho de um anticorpo de detecção diferente. Em seguida, prepare uma curva padrão de 12 pontos começando em 8.000 picogramas por mililitro e terminando em quatro picogramas por mililitro. Com os sistemas de r e d.

O padrão TNF Alpha adiciona seis réplicas de 50 microlitros de cada diluição a cada uma das placas, além de seis poços com 50 microlitros de tampão de ensaio cada como pano de fundo para um total de 78 poços por placa. Incube as placas por uma hora em temperatura ambiente protegidas da luz enquanto agita em um agitador de placas de ensaio. Em seguida, adicione 50 microlitros do primeiro anticorpo de detecção a todos os 78 poços da primeira placa.

Repita para o segundo anticorpo de detecção na segunda placa. Incube as placas por 30 minutos nas mesmas condições. Em seguida, adicione os 50 microlitros do reagente SAPE a todos os alvéolos de cada placa.

Depois de agitar as duas placas por 15 minutos protegidas da luz, coloque as placas em separadores magnéticos de placas por um minuto. Remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver no separador sobre um recipiente de resíduos. Em seguida, pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada um dos 78 poços nas placas antes de remover o líquido das esferas magnéticas antes.

Depois de adicionar cem microlitros de tampão de ensaio aos grânulos em cada um dos 78 poços nas placas, analise as placas no instrumento de palhetas magnéticas consultando o manual do usuário para operação adequada. Seguindo as instruções incluídas nos sistemas r e d, o TNF humano Alpha T NF SF one a DUO set ELI A kit. Meça a resposta gerada pelo padrão fornecido com o kit r e d.

Repetir o ensaio ELI a mais três vezes, substituindo os anticorpos de captura e detecção dos sistemas r e d pelos anticorpos dos outros fornecedores. Para simplificar, emparelhe os anticorpos por fornecedor, avalie cada par de forma independente, conforme exigido pelo formato EISA, com cada um dos três padrões de proteína TNF Alfa. Os ensaios Luminex Xap foram realizados como um multiplex para avaliar todos os quatro anticorpos de captura como uma mistura, combinando quatro conjuntos de anticorpos TNF alfa acoplados a microesferas Mag PLX, os anticorpos de captura foram avaliados com cada um dos quatro anticorpos de detecção biotinilados individualmente, de modo que a interação de um anticorpo de detecção com cada um dos quatro anticorpos de captura pudesse ser determinada simultaneamente.

Os resultados indicaram que o par de anticorpos do conjunto DUO dos sistemas r e d teve melhor desempenho com uma resposta resultante em 6.183 unidades medianas de intensidade de fluorescência ou MFI. Observou-se também que os anticorpos de detecção de Millipore e ABAM forneceram uma resposta razoável no ensaio XAP quando combinados com o anticorpo de captura dos sistemas RD, os anticorpos de captura de Millipore, ACAM e Novus produziram uma resposta menos desejável no ensaio XAP. O protocolo de conjunto DUO dos sistemas r e d foi usado para comparar os quatro pares de anticorpos em um formato EISA.

O protocolo de sistemas r e d foi usado com todos os pares de anticorpos porque reflete os protocolos EIA típicos amplamente usados hoje e é análogo aos protocolos usados com a tecnologia xap. Os testes EISA mostraram que o par de anticorpos dos sistemas r e d novamente deu os melhores resultados. O par de anticorpos da Acam não produziu resposta, e os pares de anticorpos da Millipore e Novas produziram respostas modestas para avaliar qualquer variação na reatividade do anticorpo.

Com o padrão, todos os quatro pares de anticorpos foram testados com três padrões diferentes de proteína alfa TNF recombinante de três fornecedores diferentes. Os dados mostram que os padrões de proteína alfa TNF recombinante dos três fornecedores deram resultados equivalentes. A proteína TNF alfa dos sistemas r e d foi usada para gerar curvas padrão com os ensaios ELSA e XAP.

Enquanto o ensaio ELI A foi feito com o par de anticorpos do sistema r e d, os ensaios xap utilizaram o anticorpo de captura do sistema r e d e o anticorpo de detecção dos sistemas r e d ou Millipore. A proteína alfa TNF dos sistemas r e d foi diluída para produzir uma faixa de concentrações de 8.000 a quatro picogramas por mililitro apenas. O par de anticorpos dos sistemas r e d produziu o resultado esperado no ensaio Xap com uma resposta superior a 20.000 MFI, conforme mostrado.

Quando o anticorpo de detecção da Millipore foi usado com o ensaio Xap no lugar do anticorpo de detecção dos sistemas r e d, a resposta foi de cerca de 30% da resposta obtida com o anticorpo de detecção dos sistemas RD. A linha verde neste gráfico representa a curva padrão do ELA, que tinha uma faixa alfa de TNF recomendada pelo fabricante de 16 a 1000 picogramas por mililitro. Devido ao limite do espectrofotômetro, não foi possível aumentar a faixa do ensaio Eliza.

Além disso, a faixa dinâmica e a sensibilidade de ambos os métodos são melhor ilustradas quando plotadas em uma escala logarítmica. Uma distinção clara entre a inclinação da resposta EISA e as respostas dos ensaios xap pode ser vista e indica ainda uma capacidade mais limitante para a detecção de TNF alfa com o EL iza em concentrações mais altas e mais baixas. Os limites de detecção ou LOD para os dois ensaios funcionais de TNF alfa xap foram aproximados identificando a menor concentração de TNF alfa com um nível de resposta observado maior que o fundo, mais três vezes seu desvio padrão ou DP de seis repetições.

Aqui pode-se observar que, ao usar o par de sistemas r e d, a menor concentração de TNF alfa em 3,91 picogramas por mililitro produziu uma resposta de 66 MFI, que é maior do que a resposta para o fundo mais três encontros SD. Este critério. Quando o anticorpo de detecção millipore foi usado com o anticorpo de captura dos sistemas r e d, o limite de detecção foi inferior a 7,81 picogramas por mililitro.

Nesse caso, a segunda menor concentração de TNF alfa produzida em resposta aceitável de 17 MFI maior do que a resposta da menor concentração de TNF alfa mais três vezes seu desvio padrão. Da mesma forma, o limite de detecção para o conjunto duplo de sistemas r e d Eliza foi estimado entre 63 e 31 picogramas por mililitro. Após este procedimento, outras etapas como testes, várias matrizes de amostra ou concentrações de anticorpos no repórter podem ser realizadas para otimizar ainda mais o ensaio xap.