Name: A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprenda a converter um ensaio ELISA de TNF Alpha para a plataforma Luminex xMAP, avaliando pares de anticorpos alternativos simultaneamente. Este método aumenta a sensibilidade e a faixa dinâmica enquanto reduz custos em detecção de citocinas.

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Este trabalho foi financiado pela Luminex Corporation.

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<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Este trabalho foi feito em Luminex Corporation com equipamentos fabricados no Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore são parceiros estratégicos da Luminex Corporation; licenciada para desenvolver e comercializar ensaios multiplex xMAP base.

A conversão de um ensaio de ELISA para a plataforma xMAP Luminex pode ser tão simples como a substituição de estreptavidina peroxidase de rábano (SA-HRP) em um típico kit de ELISA com estreptavidina ficoeritrina (SA-PE), e optimizar o desempenho. Para aqueles que deseja criar um imunoensaio xMAP de baixo para cima, isto pode ser realizado com um protocolo simples, que também permite a avaliação multiplex rápido, um dos pares de anticorpos. Os reagentes para o ensaio xMAP foram facilmente preparado utilizando o kit de Anticorpo xMAP acoplamento para acoplar os anticorpos de captura designados para MagPlex baixa concentração microesferas. O uso de baixa concentração de microesferas reduz o custo do desenvolvimento do ensaio enquanto fornece o desempenho do ensaio mesmo de maior concentração microesferas. A quantidade de tempo necessário para preparar acoplado MagPlex microesferas é de aproximadamente 3 horas, o que é muito mais rápido do que o 22 - 24 horas necessário para revestir o poço de uma placa de ELISA, seguido de tratamentodos poços revestidos. O desempenho do ensaio xMAP é também superior ao ELISA em termos de limite de detecção (&lt;4 pg / mL vs&gt; 31 pg / mL) e gama dinâmica (&lt;4 pg / mL a&gt; 8000 pg / mL vs 16 pg / mL a 1000 pg / mL). Leitores de placas têm uma gama limitada OD que é 3 ou 4 OD, restringindo o limite superior da gama dinâmica para um ensaio. Sem dúvida, nem todos os anticorpos vai trabalhar em um formato de ELISA e nem todos os anticorpos que funcionam bem em um ELISA são facilmente transferíveis para o formato de ensaio xMAP. No entanto, uma vez que os ensaios xMAP podem ser multiplexados (isto é, executar simultaneamente), é possível avaliar a captura e várias combinações de anticorpos de detecção em simultâneo para identificar a melhor par a ser usado para um ensaio. Este processo poupa tempo significativo e reagentes em comparação com o processo de desenvolvimento de ELISA, que é limitado para a avaliação de um par de cada vez. No caso de dois ou mais pares de anticorpos realizar equivalentemente; outros parâmetros do ensaio podeser considerado para determinar a adequação do par (por exemplo, a disponibilidade, custo, etc.) Além disso para o desempenho do ensaio melhorado e flexibilidade com o ensaio xMAP, há também poupanças de custos significativas. A quantidade recomendada de anticorpo necessária para revestir um único poço de uma placa de ELISA é 400ng, enquanto que a quantidade requerida para as esferas utilizadas em um poço de um ensaio de xMAP é aproximadamente 7,5 ng. Assim, a quantidade de anticorpo necessária para um ELISA bem irá fornecer mais de 50 resultados do teste, se for utilizado num ensaio xMAP. Para aplicações que envolvam amostras preciosos, xMAP também tem uma vantagem significativa. O volume da amostra recomendado para o ELISA é de 100 L ao passo que o volume necessário para o ensaio xMAP pode ser metade do que, ou menos. Em resumo, a conversão de um ensaio de ELISA para a plataforma xMAP Luminex é simples, eficiente e de economia de custos, enquanto a produção de um ensaio com uma gama dinâmica superior e sensibilidade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Descrição </td><td> Vendedor </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Inclui monoclonais e biotina acoplados anticorpos policlonais e recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Captura de anticorpos, clone CH8820 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotina anticorpo de detecção acoplado, o clone AS1 </td></tr><tr><td> TNF proteína alfa </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Captura de anticorpos, clone 4H31 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotina anticorpo de detecção acoplado, o clone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF proteína alfa </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Captura de anticorpos, clonar 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticorpo policlonal para o TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Coelho policlonal anticorpo de detecção </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Ficoeritrina </td><td> Musgo </td><td> SAPE-001 </td><td> O reagente de repórter fluorescente para Luminex Assay xMAP </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software Xponent </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPiX Xponent- </td><td> Instrumento Luminex </td></tr><tr><td> Anticorpo xMAP Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Inclui EDC reagente, Sulfo-NHS reagente, tampão de activação, o tampão de lavagem, 1,5 mL tubos de reacção, e pipetas descartáveis </td></tr><tr><td> MagPlex Microesferas, baixa concentração </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Baixos grânulos de concentração (@ 2,5 x 10 6 grânulo / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21.335 </td><td> Kit Biotinilação para detecção de anticorpos não modificada </td></tr><tr><td> Tecan Infinito F200 Leitor </td><td> Tecan </td><td></td><td> Leitor de placas ELISA </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% de PBS-BSA, Tampão de Ensaio </td></tr><tr><td> Uma Pint-Cleaner Compact Ultrasonic, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Produzir uma freqüência de operação efetiva de 55 kHz </td></tr><tr><td> Separador Tubo Magnético </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Para a separação único tubo 1,5 ml magnética em passos de lavagem de acoplamento </td></tr><tr><td> Separador de placa magnética </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Para a separação de 96 poços da placa magnética em passos de lavagem de ensaio </td></tr></tbody></table>

a conversão de um elisa de captura para um ensaio de xmap luminex usando um método de rastreio de anticorpos multiplex

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a principal ferramenta para a detecção de analitos de interesse em amostras biológicas, tanto para pesquisas de ciências humanas e diagnósticos clínicos. Contudo, Elisa tem limitações. É tipicamente realizada em uma microplaca de 96 poços, e os poços são revestidos com anticorpo de captura, exigindo uma quantidade relativamente grande de amostra para capturar um antigénio de interesse. A grande área de superfície dos poços ea ligação hidrofóbica de anticorpo de captura pode também conduzir a não-específica ligação de fundo e aumentada. Além disso, a maioria dos ELISAs dependem mediada por enzima de amplificação de sinal, a fim de alcançar a sensibilidade razoável. Tal amplificação não é sempre linear e pode distorcer resultados assim. Nos últimos 15 anos, uma nova tecnologia surgiu, que oferece os benefícios do ELISA, mas também permite um maior rendimento, maior flexibilidade, volume da amostra reduzida, e menor custo, com um wo semelhanterkflow 1, 2. Luminex xMAP A tecnologia é uma plataforma de micro-array (pérola), permitindo tanto monoplex e ensaios multiplex que podem ser aplicadas tanto para proteína e aplicações de ácido nucléico 3-5. Os grânulos têm o anticorpo de captura covalentemente imobilizada sobre uma área de superfície menor, exigindo menos anticorpo de captura e um menor volume de amostra, em comparação com ELISA, e ligação não específica é significativamente reduzida. Volumes menores de amostra são importantes quando se trabalha com amostras limitantes, como líquor, líquido sinovial, etc 6. Multiplexação o ensaio reduz ainda mais os requisitos de volume de amostra, permitindo vários resultados de uma única amostra. Recentes melhorias por Luminex incluem: o sistema de MAGPIX novo, uma menor, menos caro, analisador mais fácil de usar; de baixa concentração Magnética MagPlex Microesferas que eliminam a necessidade de dispendiosos placas de filtro e vêm em uma concentração de trabalho mais adequado para o desenvolvimento de ensaios ede baixo rendimento aplicações; eo anticorpo xMAP Acoplamento Kit (ABC), que inclui um protocolo, os reagentes e produtos de consumo necessários para o acoplamento pérolas para o anticorpo de captura de interesse. (Veja a seção Materiais para uma lista detalhada do conteúdo do kit.) Nesta experiência, nós converter um pré-optimizado ensaio ELISA para TNF-alfa citocina para a plataforma xMAP e comparar o desempenho dos dois métodos 7-11. TNF-alfa é um biomarcador utilizado na medição das respostas inflamatórias em pacientes com doenças auto-imunes. Começamos por acoplamento quatro anticorpos de captura candidatos para quatro conjuntos de microesferas ou regiões diferentes. Quando misturado em conjunto, estes quatro conjuntos permitir o teste simultâneo de todos os quatro candidatos com quatro anticorpos de detecção separado para determinar a melhor par de anticorpos, os reagentes de poupança, amostra e do tempo. Dois ensaios xMAP são então construído com os dois pares de anticorpos mais óptimas e seu desempenho écomparada com a do ensaio de ELISA original em relação à intensidade do sinal, a gama dinâmica, e sensibilidade.

Um ELISA pode ser facilmente convertido para um ensaio de xMAP Luminex e, através dos benefícios da multiplexação, vários anticorpos podem ser rastreados simultaneamente para identificar um par de anticorpos óptima, resultando em aumento da sensibilidade e gama dinâmica, enquanto reduz o custo do ensaio.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido, há muito tempo, a principal ferramenta para a detecção de analitos de interesse em amostras biológicas, tanto para as ciências da vida...

O objetivo geral do experimento a seguir é converter um ensaio Eliza previamente otimizado para a citocina TNF alfa para a plataforma Xap, ao mesmo tempo em que avalia pares alternativos de anticorpos. Isso é realizado acoplando o anticorpo de captura do kit ELIZA, juntamente com outros três anticorpos de captura candidatos, a quatro conjuntos diferentes de microesferas ou partículas quando misturados. Esses quatro conjuntos permitem o teste simultâneo de todos os quatro candidatos com quatro anticorpos de detecção separados, a fim de determinar o melhor par de anticorpos.Os dois próximos ensaios Xap são montados com os dois pares de anticorpos mais otimizados. O desempenho dos ensaios é então comparado ao do ensaio EISA original quanto à intensidade do sinal, faixa dinâmica e sensibilidade. Os resultados mostram que anticorpos semelhantes podem apresentar desempenhos muito diferentes sob as mesmas condições e que diversos anticorpos podem ser triados simultaneamente utilizando o ensaio Luminex Xap, revelando que este possui maior sensibilidade e faixa dinâmica em comparação ao EISA.A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a EIS A, é que os imunossenzados baseados em xap permitem ao pesquisador testar múltiplos alvos, ou como neste caso, testar múltiplos anticorpos simultaneamente. Para identificar o melhor anticorpo demonstrado. O procedimento será realizado por Erica Lopez, cientista associada da Luminex Corporation.Inicie este protocolo com a seleção e preparação de quatro anticorpos de captura e quatro anticorpos de detecção específicos para a proteína humana TNF alfa, conforme descrito no protocolo escrito. Além disso, prepare um anticorpo de confirmação específico para a espécie hospedeira dos anticorpos de captura. Leve os reagentes do kit de acoplamento de anticorpos à temperatura ambiente.Rotule quatro tubos de reação com os números das regiões das microesferas selecionadas para a reação de acoplamento. Transfira o conteúdo dos quatro frascos de microesferas magnéticas para os quatro tubos de reação rotulados. Lave cada conjunto de microesferas duas vezes com 500 microlitros de tampão de ativação e ative cada conjunto de microesferas com as soluções de sulfo ONHS e EDC conforme descrito no kit de acoplamento de anticorpos.Manual do usuário: após uma incubação de 20 minutos em um agitador rotativo, repita o passo anterior de lavagem com as esferas agora ativadas, um total de três vezes, com 500 microlitros de tampão de ativação. Para cada lavagem, prepare quatro soluções separadas de 500 microlitros, cada uma contendo 7,5 microgramas de anticorpo de captura no tampão de inativação.Adicione estas quatro soluções de anticorpos de captura aos respectivos tubos de reação. Vortexe imediatamente cada tubo e incube por duas horas em um rotator. Repita o passo de lavagem com as perlas agora conjugadas um total de três vezes com 500 microlitros do tampão de lavagem fornecido com o kit de conjugação de anticorpos.Após a etapa final de lavagem, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem a cada tubo de reação para fornecer uma concentração final de estoque de 5 milhões de microesferas conjugadas com anticorpo por mililitro, vórtex, e então sonique os tubos de reação para dispersar as microesferas. Conte o número de microesferas recuperadas após a reação de conjugação utilizando um contador de células ou hemocitômetro. A recuperação da reação de conjugação é tipicamente superior a 90%. Confirme que a reação de conjugação foi bem-sucedida preparando soluções-teste dos estoques de microesferas conjugadas para cada conjunto, com uma concentração final de 100 microesferas por microlitro em tampão de ensaio, e prepare uma diluição da espécie anticorpo marcada com FICO eritingo.Anticorpo de confirmação de IgG a quatro microgramas por mililitro em tampão do ensaio. Aliquotar 50 microlitros de cada solução-teste em quatro poços de uma placa de 96 poços com fundo redondo, totalizando 16 poços. Em seguida, adicionar 50 microlitros de tampão do ensaio em oito dos poços para medir o fundo e 50 microlitros do anticorpo de confirmação diluído nos oito poços restantes. Misturar suavemente as reações pipetando para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta multicanal.Cubra a placa e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador de placa. Coloque a placa em um separador magnético por um a dois minutos para atrair as esferas para fora da solução. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver no separador, sobre um recipiente de resíduos.Lave cada poço duas vezes adicionando 100 microlitros de tampão de ensaio e removendo o SANE da placa de maneira semelhante. Usando o separador magnético de placas, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de ensaio pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com um pipetador multicanal. Analise no instrumento Luminex xap, como o instrumento Magix.A intensidade do sinal fluorescente dessa reação é diretamente proporcional à quantidade de proteína na superfície das microesferas, fornecendo uma avaliação rápida da quantidade relativa de proteína conjugada às microesferas. Para determinar o par de anticorpos mais eficaz no ensaio xap, prepare uma mistura inicial com os quatro conjuntos de microesferas, adicionando 10 microlitros de cada um a 0,96 mililitros de tampão de ensaio. Prepare as soluções de anticorpo de detecção diluindo cada anticorpo a um micrograma por mililitro em tampão de ensaio.Também um tampão de ensaio. Prepare o padrão de proteína TNF alfa dos sistemas r e d em 2000 picogramas por mililitro e dilua a estreptavidina R FICO eryn até oito microgramas por mililitro. Adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos acoplados a microesferas a cada um dos 16 poços de uma placa de 96 poços com fundo redondo da CoStar para o ensaio de triagem.Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão do ensaio a oito das 16 poças para medir o fundo. Em seguida, pipete 50 microlitros do padrão de TNF alfa nas outras oito poças para medir a resposta. Incube durante uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, sob agitação em um agitador para placas de ensaio.Em seguida, adicione 50 microlitros de cada um dos quatro anticorpos de detecção a quatro poços, dos quais dois são poços de fundo e dois são poços de resposta. Incube por 30 minutos nas mesmas condições após a adição de 50 microlitros do reagente SAPE a todos os poços. Incube novamente por 15 minutos nas mesmas condições.Coloque a placa em um separador magnético por um minuto. Em seguida, remova o líquido invertendo com força a placa enquanto estiver sobre o separador, acima de um recipiente de resíduos. Pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada uma das 16 poças.Em seguida, remova o líquido das microesferas utilizando separação magnética. Depois, adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada uma das 16 poças. Leitura da placa com o instrumento Luminex mag picks, consultando o manual do usuário para operação adequada.Selecione um par de anticorpos que atenda à intensidade de sinal desejada. Após selecionar o melhor anticorpo para captura, dilua 100 microlitros da solução estoque de anticorpos conjugados em 10 mililitros de tampão de ensaio. Adicione 50 microlitros das microesferas diluídas em 78 poços de duas placas de 96 poços, fundo redondo, da CoStar.Cada placa será usada para avaliar o desempenho de um anticorpo de detecção diferente. Em seguida, prepare uma curva padrão de 12 pontos iniciando em 8.000 picogramas por mililitro e terminando em quatro picogramas por mililitro. Com os sistemas r e d.Adicione seis réplicas de 50 microlitros de cada diluição do padrão de TNF alfa a cada uma das placas, além de seis poços com 50 microlitros de tampão do ensaio cada, como fundo, totalizando 78 poços por placa. Incube as placas por uma hora à temperatura ambiente, protegidas da luz, sob agitação em um agitador para placas de ensaio. Em seguida, adicione 50 microlitros do primeiro anticorpo de detecção a todos os 78 poços da primeira placa.Repita para o segundo anticorpo de detecção na segunda placa. Incube as placas por 30 minutos nas mesmas condições. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente SAPE a todas as cavidades de cada placa.Após agitar as duas placas por 15 minutos protegidas da luz, coloque as placas sobre separadores magnéticos por um minuto. Remova o líquido invertendo com força a placa sobre o separador acima de um recipiente de resíduos. Em seguida, pipete 100 microlitros de tampão de ensaio para cada um dos 78 poços das placas antes de remover o líquido das microesferas magnéticas como anteriormente.Após adicionar cem microlitros de tampão de ensaio às esferas em cada uma das 78 poças nas placas, analise as placas no instrumento mag picks, consultando o manual do usuário para a operação adequada. Siga as instruções incluídas com o kit ELISA DUOset TNF Alfa T NF SF um humano dos sistemas r e d. Meça a resposta gerada pelo padrão fornecido com o kit r e d.Repita o ensaio ELI a mais três vezes, substituindo os anticorpos de captura e detecção dos sistemas r e d pelos anticorpos dos outros fornecedores. Por simplicidade, associe os anticorpos por fornecedor e avalie cada par independentemente, conforme exigido pelo formato EISA, com cada um dos três padrões proteicos de TNF Alfa. Os ensaios Luminex Xap foram realizados em multiplex para avaliar os quatro anticorpos de captura como uma mistura, combinando quatro conjuntos de anticorpos anti-TNF alfa conjugados a microesferas Mag PLX; os anticorpos de captura foram avaliados com cada um dos quatro anticorpos de detecção biotinilados individualmente, de modo que a interação de um anticorpo de detecção com cada um dos quatro anticorpos de captura pudesse ser determinada simultaneamente.Os resultados indicaram que o par de anticorpos do conjunto DUO dos sistemas r e d apresentou o melhor desempenho, com uma resposta resultante de 6.183 unidades de intensidade de fluorescência mediana ou MFI. Também foi observado que os anticorpos de detecção da Millipore e da ABAM proporcionaram uma resposta razoável no ensaio XAP quando combinados com o anticorpo de captura dos sistemas RD, enquanto os anticorpos de captura da Millipore, ACAM e Novus produziram uma resposta menos desejável no ensaio XAP. O protocolo do conjunto DUO dos sistemas r e d foi utilizado para comparar os quatro pares de anticorpos em formato EISA.O protocolo dos sistemas r e d foi utilizado com todos os pares de anticorpos porque reflete os protocolos típicos de EIA amplamente usados atualmente e é análogo aos protocolos empregados com a tecnologia xap. Os testes de EISA mostraram que o par de anticorpos dos sistemas r e d novamente apresentou os melhores resultados. O par de anticorpos da Acam não produziu resposta, e os pares de anticorpos da Millipore e da Novas produziram respostas modestas, a fim de avaliar qualquer variação na reatividade dos anticorpos.Com o padrão, todos os quatro pares de anticorpos foram testados com três diferentes proteínas padrão de TNF alfa recombinante de três fornecedores distintos. Os dados mostram que as proteínas padrão de TNF alfa recombinante dos três fornecedores apresentaram resultados equivalentes. A proteína de TNF alfa dos sistemas r e d foi utilizada para gerar curvas-padrão com os ensaios ELSA e XAP.Embora o ensaio ELI A tenha sido realizado com o par de anticorpos do sistema r e d, os ensaios Xap utilizaram o anticorpo de captura do sistema r e d e, como anticorpo de detecção, o anticorpo do próprio sistema r e d ou o da Millipore. A proteína TNF alfa do sistema r e d foi diluída para produzir uma faixa de concentrações de 8.000 a quatro picogramas por mililitro apenas. O par de anticorpos do sistema r e d produziu o resultado esperado no ensaio Xap, com uma resposta superior a 20.000 MFI, conforme mostrado.Quando o anticorpo de detecção da Millipore foi usado com o ensaio Xap no lugar do anticorpo de detecção dos sistemas r e d, a resposta foi cerca de 30% da resposta obtida com o anticorpo de detecção dos sistemas RD. A linha verde neste gráfico representa a curva padrão do ELA, que tinha uma faixa recomendada pelo fabricante de TNF alfa de 16 a 1000 picogramas por mililitro. Devido ao limite do espectrofotômetro, não foi possível aumentar a faixa do ensaio Eliza.Além disso, a faixa dinâmica e a sensibilidade de ambos os métodos são melhor ilustradas quando representadas em escala logarítmica. Uma distinção clara entre a inclinação da resposta da EISA e as respostas dos ensaios xap pode ser observada, indicando ainda uma capacidade mais limitada de detecção do TNF alfa com a EL iza em concentrações tanto mais altas quanto mais baixas. Os limites de detecção, ou LOD, para os dois ensaios funcionais de TNF alfa xap foram aproximados identificando-se a menor concentração de TNF alfa com um nível de resposta observado superior ao fundo, acrescido de três vezes o desvio padrão (SD) obtido a partir de seis réplicas.Aqui pode-se observar que, ao utilizar o par de sistemas r e d, a menor concentração de TNF alfa, de 3,91 picogramas por mililitro, produziu uma resposta de 66 MFI, superior à resposta do fundo mais três desvios padrão atendendo a este critério. Quando o anticorpo de detecção Millipore foi usado com o anticorpo de captura do sistema r e d, o limite de detecção foi inferior a 7,81 picogramas por mililitro.Neste caso, a segunda menor concentração de TNF alfa produziu uma resposta aceitável de 17 MFI, superior à resposta da menor concentração de TNF alfa mais três vezes seu desvio padrão. Da mesma forma, estimou-se que o limite de detecção para o conjunto duplo de sistemas r e d da Eliza fosse entre 63 e 31 picogramas por mililitro. Após este procedimento, outras etapas, como testes, diferentes matrizes de amostras ou concentrações de anticorpo no sistema de detecção, podem ser realizadas para otimizar ainda mais o ensaio xap.

conversion-capture-elisa-to-luminex-xmap-assay-using-multiplex

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Biology

Biologia

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

O vídeo mostra a implementação da tecnologia de chip instantâneo para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. A simples ação de encaixar duas lâminas de microarray, cada uma contendo reagentes diferentes, garante a transferência de reagentes sem contaminação cruzada e ajuda a detectar várias proteínas usando imunoensaio sanduíche.

Uma tecnologia Snap Chip para um imunoensaio sanduíche multiplexado livre de reatividade cruzada

Este vídeo demonstra a detecção bacteriana quantitativa multiplexada empregando microesferas de poliestireno magnético carboxilado tingidas em conjuntos distintos. O procedimento engloba a formação de complexos de bactérias, separação magnética e análise baseada em fluxo, permitindo a quantificação precisa e simultânea de várias bactérias no mesmo poço de reação.

Detecção Bacteriana Quantitativa Multiplexada usando Microesferas Magnéticas Marcadas com Corante

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.

Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Em linha com a necessidade urgente de triagem para diabetes tipo 1, doença celíaca e doença por coronavírus 2019, desenvolvemos um ensaio de eletroquimioluminescência 6-Plex de alto rendimento para detectar simultaneamente todos os quatro autoanticorpos de ilhotas, autoanticorpos de transglutaminase tecidual e anticorpos para o domínio de ligação ao receptor do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave.

Uma triagem multiplexada de alto rendimento para diabetes tipo 1, doenças celíacas e COVID-19

Um sistema de análise de fluxo de fluorescência de três canais de duplo repórter foi usado para desenvolver um imunoensaio multiplex baseado em esferas que avalia simultaneamente amostras de soro para IgG e IgM eliciadas contra múltiplos antígenos de diferentes espécies de Borrelia que causam borreliose de Lyme na Europa e América do Norte.

Detecção Simultânea de Diferentes Classes de Anticorpos em um Teste Sorológico Multiplexado

Aprenda a converter um ensaio ELISA de TNF Alpha para a plataforma Luminex xMAP, avaliando pares de anticorpos alternativos simultaneamente. Este método aumenta a sensibilidade e a faixa dinâmica enquanto reduz custos em detecção de citocinas.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

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