Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Este é um ímã Max MIDI. Ele diz, cuidado com campos magnéticos extremamente fortes. Olá, sou Melanie Matthew, do laboratório Mike Collins do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine.

Hoje vamos mostrar uma preparação de seleção negativa de células T CD quatro positivas usando os kits de biotecnologia Milton. Então, aqui temos os ímãs minimax e minimax e os minimax são usados para separações maiores. Você pode executar até 10 até a nona célula através de uma coluna que se encaixa no minimax e o minimax é usado para volumes muito menores de células.

Portanto, dependendo se você está ou não fazendo uma separação positiva ou negativa, você rotulará suas células com o anticorpo apropriado. Eles têm uma batida magnética que se prende ao ímã. No caso de uma seleção negativa, as células nas quais você está interessado percorrerão a coluna e você poderá coletar o poluente EL, que conterá as células de interesse.

Devo mencionar que as técnicas que estou mostrando esta noite não são estéreis. E então, se você quiser usar essas células para cultura de células, você deve fazer tudo na capa de cultura de tecidos com instrumentos estéreis. Portanto, embora eu esteja mostrando a vocês uma preparação para células T positivas para CD quatro, muitas dessas técnicas são aplicáveis na purificação de outros tipos de células usando os minúsculos kits de biotecnologia milit.

Ok, então eu removi os gânglios linfáticos do camundongo e mostro como fazer isso em detalhes na edição sete da preparação de linfonodos Joe para imagens de dois fótons. E agora vou triturar os gânglios linfáticos em uma única suspensão celular dentro de um filtro de células de 70 mícrons. Ok, então agora vou triturar os gânglios linfáticos em uma única suspensão celular usando a parte de trás de uma seringa de seis mililitros.

Os gânglios linfáticos estão em RPMI dentro de um filtro, e é importante fazer uma suspensão de célula única adequada. E a razão pela qual estamos fazendo isso em um filtro é que você quer ter certeza de que não tem aglomerados de células. Então, quando eu terminar de moer, vou tirar o filtro da mídia e depois usar os todos que passaram pelo filtro e pela suspensão de célula única.

Quando você está moendo, você quer ter certeza de que você interrompe todo o tecido o máximo possível. Esta suspensão de célula única é o que purificaremos nossas células T positivas CD quatro. Ok, agora terminei de moer o tecido e você pode ver que a maioria dos gânglios linfáticos praticamente desapareceu.

Ainda temos alguns pequenos pedaços de gordura e uma espécie de casca de um linfonodo aqui com um pouco de tecido conjuntivo que está todo grudado em todos os seis linfonodos. E agora eu removo o filtro da célula. E você pode ver aqui que a mídia está muito nublada.

Está cheio de células da suspensão de célula única para garantir que obtenhamos um número máximo de células do filtro e algumas delas grudarão nele. Eu lavo com alguns mils de mídia e, em seguida, pipeto toda a mídia no tubo Falcon de 15 mil e giro isso para baixo para descascar as células por meio de purificação posterior. Então aqui está minha suspensão de célula única, girada e peletizada a 300 G por 10 minutos.

Se você acha que terá uma alta população de células mortas em sua suspensão de célula única, é uma boa ideia usar o kit de remoção de células mortas da Milit Tene. Então, agora que eu tenho isso derrubado, vou derramar a mídia e fazer uma lise de glóbulos vermelhos, e então vou contar as células e, em seguida, fazer um kit de seleção negativa de quatro células T positivas nessas células em particular. Ok, então agora vou fazer uma lise de hemácias.

Vamos analisar os glóbulos vermelhos que peletizamos junto com os linfócitos, diminuindo a osmolaridade da solução, primeiro adicionando água e depois trazendo-a de volta para uma solução de um x, adicionando 10 X-D-B-P-S. Nossos linfócitos são mais resistentes à mudança na osmolaridade do que os glóbulos vermelhos, mas ainda temos que trabalhar rapidamente ou vamos trabalhar nossos linfócitos, o que não queremos fazer. Parte do trabalho rápido é que eu preencho os volumes que vou precisar para a lise antes de realmente adicionar água ao sistema.

Então, eu quero ser capaz de adicionar meus 10 X-D-B-P-S-A alguns segundos depois de adicionar minha água para ter certeza de que não lisar meus linfócitos e ajustar os glóbulos vermelhos. Então eu tomo 900 microlitros de água. É quase um moinho e cem microlitros de 10 X-D-B-P-S.

Eu tenho os dois tubos prontos para ir. Na lise, adiciono a água, espero alguns segundos, talvez agite um pouco o tubo e depois adiciono os 10 X-D-B-P-S, agito o tubo um pouco mais. E se você tem muitos glóbulos vermelhos que são lisina, você verá um grande tipo de forma de bolha amorfa de todas as membranas celulares quebradas.

Temos um pouco disso aqui e você pode ver que é um pouco de membranas celulares quebradas. Então, depois de fazer a lise, caso tenha havido algum erro na pipetagem, gosto de adicionar alguns moinhos de mídia às células para ter certeza de que a osmolaridade está correta e não continuamos mais com a lisina. Ok, agora eu tenho meus linfócitos na suspensão de célula única.

Novamente, fiz a lise dos glóbulos vermelhos e vou girá-los e derrubá-los. Antes de fazer isso, vou contá-los no hemocitômetro para determinar quanto anticorpo precisamos adicionar para o kit de seleção negativa de quatro células T positivas para CD. Ok, agora eu gasto as células no buffer máximo e você pode ver que o pellet é muito mais branco depois de fazermos a lise de hemácias.

E vou fazer uma seleção negativa para CD quatro células T positivas. Então, vou despejar toda a mídia, todo o buffer máximo em que passo as células. E vou rotular com o coquetel de anticorpos de biotina, que é o primeiro passo na seleção negativa para CD quatro células T positivas.

E então eu incubo na geladeira por 10 minutos. Ok, então minhas células terminaram sua incubação inicial. Agora vou adicionar o antibiótico às microesferas e colocá-las de volta na geladeira por 15 minutos.

Então, para essa separação celular específica, usamos uma coluna LS da pequena biotecnologia Milit e nós, o que vamos fazer é colocá-la no suporte magnético e preparar a coluna executando três moinhos de buffer máximo Através dele, vamos abrir a coluna e colocá-la de forma que as pontas fiquem voltadas para dentro do ímã. Agora vou adicionar o buffer máximo à coluna, e você deve vê-lo descer pela coluna LS e começar a pingar na parte inferior. Não se preocupe com a coluna secando.

A tensão superficial do líquido impedirá que ele seque até que você adicione suas células. Antes de adicionar suas células, é importante deixar o buffer máximo beber completamente através da coluna. Ok, então, após a incubação de 15 minutos com nossas contas magnéticas de biotina que gastei nas células e no buffer máximo, vou despejar o buffer, suspendê-los novamente em uma quantidade de buffer apropriada à nossa contagem de células.

Então você terá que verificar seu protocolo mili minúsculo para isso. E então vou aplicá-los à coluna que acabamos de enxaguar com o buffer máximo. Então, agora vamos adicionar a suspensão da célula à coluna.

E como esta é uma coluna de seleção negativa, vamos coletar as células que fluíram e todas devem ser células T positivas para CD quatro neste caso. Então, agora vou lavar a coluna com 12 mils de tampão máximo e, novamente, estamos coletando a eluição, que deve conter apenas quatro células T positivas em CD. Então, agora vou girar o CD quatro células T positivas, ressuspendê-las e rotulá-las com o corante apropriado que vou usar para imagens de tau.

Também vou pegar uma pequena amostra das células que purifiquei e rotulá-las com anti CD três e anti CD quatro e executá-las com base em fatos para ter certeza de que tenho uma população limpa de células T CD quatro positivas. Então, aqui está uma olhada nas células que acabamos de girar. Esta deve ser uma população de células T CD três puras, CD quatro positivas.

Então, acabei de mostrar a seleção negativa para CD quatro células T positivas. Usando o minúsculo kit de biotecnologia Milit, vamos transferir adotivamente essas células para um camundongo e usá-las para um de nossos próprios experimentos com fótons e máquinas. Boa sorte com seus próprios experimentos.