Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Este é um ímã Max MIDI. Diz: cuidado, campos magnéticos extremamente fortes. Olá, sou Melanie Matthew do laboratório de Mike Collins, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia, em Irvine.

Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento de seleção negativa de células T CD4 positivas utilizando os kits da Milton Biotechnology. Aqui temos o Minimax e os ímãs Minimax, sendo que o Minimax é usado para separações maiores. É possível processar até 10⁹ células em uma coluna que se encaixa no Minimax, enquanto os Minimax são utilizados para volumes muito menores de células.

Assim, dependendo de você estar realizando uma separação positiva ou negativa, você rotulará suas células com o anticorpo apropriado. Eles possuem uma microesfera magnética que se ligará ao ímã. No caso de uma seleção negativa, as células nas quais você está interessado passarão através da coluna e você poderá coletar o efluente, que conterá suas células de interesse.

Devo mencionar que as técnicas que estou mostrando a vocês esta noite não são estéreis. Portanto, se quiserem usar essas células para cultivo celular, devem realizar todos os procedimentos na cabine de segurança biológica com instrumentos estéreis. Assim, embora eu esteja demonstrando um protocolo para preparação de células T positivas para CD4, muitas dessas técnicas são aplicáveis na purificação de outros tipos celulares utilizando os kits da Miltenyi Biotec.

Ok, removi os linfonodos do camundongo, e mostro como fazer isso em detalhes na edição sete do JoVE sobre o preparo de linfonodos para imagem de dois fótons. Agora vou triturar os linfonodos até obter uma suspensão simples de células dentro de um filtro celular de 70 mícrons. Ok, agora vou triturar os linfonodos até obter uma suspensão simples de células usando a parte traseira de uma seringa de seis mililitros.

Os linfonodos estão em RPMI dentro de um filtro, e é importante obter uma suspensão adequada de células únicas. A razão pela qual realizamos isso em um filtro é garantir que não haja agregados celulares. Assim, quando terminar de macerar, vou retirar o filtro do meio e usar as células que passaram pela peneira, obtendo a suspensão de células únicas.

Quando você estiver moendo, é importante garantir que você rompa todos os tecidos ao máximo. Essa suspensão de células isoladas é a partir da qual purificaremos nossas células T positivas para CD4. Ok, então agora terminei de moer o tecido e você pode ver que a maior parte dos linfonodos praticamente desapareceu.

Ainda temos alguns pequenos fragmentos de gordura e uma espécie de cápsula de um linfonodo aqui, com um pouco de tecido conjuntivo que está tudo grudado, proveniente dos seis linfonodos. Agora removo o filtro celular. E você pode ver aqui que o meio está muito turvo.

Está cheio de células da suspensão unicelular para garantir que obtenhamos o número máximo de células do filtro, e algumas delas aderirão a ele. Lavo com alguns mililitros de meio e, em seguida, pipeto todo o meio para o tubo Falcon de 15 mililitros e centrifugo para sedimentar as células para posterior purificação. Aqui está minha suspensão unicelular, centrifugada e sedimentada a 300 ×g por 10 minutos.

Se você acredita que terá uma alta população de células mortas na sua suspensão de células isoladas, é uma boa ideia usar o kit de remoção de células mortas da Miltenyi. Agora que já centrifuguei esta amostra, vou desprezar o meio e realizar uma lise de glóbulos vermelhos, depois contarei as células e então aplicarei um kit de seleção negativa de linfócitos T CD4 positivos nessas células específicas. Ok, agora vou realizar uma lise de hemácias.

Vamos lisar as células vermelhas do sangue que sedimentamos juntamente com os linfócitos, diminuindo a osmolaridade da solução primeiramente adicionando água e, em seguida, reajustando-a para uma solução 1x mediante a adição de D-P-B-S 10x. Nossos linfócitos são mais resistentes às alterações na osmolaridade do que as células vermelhas do sangue, mas ainda assim precisamos trabalhar rapidamente para não lisar os linfócitos, o que não desejamos. Parte do trabalho rápido consiste em eu já preparar os volumes necessários para a lise antes de adicionar água ao sistema.

Então, quero conseguir adicionar meu 10 X-D-B-P-S alguns segundos após adicionar minha água, para garantir que eu não lisarei meus linfócitos e apenas lisarei as hemácias. Então, pego 900 microlitros de água. É quase um mililitro e cem microlitros de 10 X-D-B-P-S.

Eu tenho ambas as pipetas prontas para uso. Na lise, adiciono a água, aguardo alguns segundos, talvez agite um pouco o tubo e, em seguida, acrescento o D-B-P-S 10 X, agitando o tubo um pouco mais. E se você tiver muitas hemácias que está lisando, verá a formação de um grande agregado amorfo proveniente de todas as membranas celulares rompidas.

Temos um pouco disso aqui e você pode ver que são fragmentos de membranas celulares rompidas. Então, após realizar a lise, caso tenha havido algum erro durante a pipetagem, gosto de adicionar alguns mililitros de meio às células para garantir que a osmolaridade esteja correta e não continuemos com mais lise. Ok, agora tenho meus linfócitos em suspensão de células isoladas.

Mais uma vez, realizei a lise das hemácias e agora vou centrifugá-las para obter o pellet. Antes de fazer isso, vou contá-las no hemocitômetro para determinar a quantidade de anticorpo que precisamos adicionar para o kit de seleção negativa de células T CD4 positivas. Ok, então agora centrifuguei as células em tampão max e você pode observar que o pellet é bem mais branco após a lise das hemácias.

E vou realizar uma seleção negativa de linfócitos T positivos para CD4. Então, vou descartar todo o meio e todo o tampão máximo no qual as células foram depositadas. E vou rotular com o coquetel de anticorpos biotinilados, que é a etapa um da seleção negativa de linfócitos T positivos para CD4.

Em seguida, incubo na geladeira por 10 minutos. Pronto, minhas células terminaram a incubação inicial. Agora vou adicionar o antibiótico às microesferas e colocá-las de volta na geladeira por 15 minutos.

Para essa separação celular específica, utilizamos uma coluna LS da Miltenyi Biotec e, o que vamos fazer é colocá-la no suporte magnético e preparar a coluna passando três mililitros do tampão MACS através dela. Vamos abrir a coluna e posicioná-la de modo que as presilhas fiquem voltadas para dentro, em direção ao ímã. Agora vou adicionar o tampão MACS à coluna, e você deverá observar que ele desce pela coluna LS e começa a gotejar na parte inferior. Não se preocupe se a coluna ficar seca.

A tensão superficial do líquido impedirá que ele seque até que você adicione suas células. Antes de adicionar suas células, é importante permitir que o tampão máx. seja completamente absorvido pela coluna. Ok, então após a incubação de 15 minutos com nossas microesferas magnéticas de biotina, que foram adicionadas às células e ao tampão máx., vou derramar o tampão e ressuspender as células em um volume de tampão apropriado para a nossa contagem celular.

Portanto, você precisará verificar o seu protocolo milimétrico para isso. Em seguida, vou aplicar a suspensão à coluna que acabamos de lavar com tampão max. Agora vamos adicionar a suspensão celular à coluna.

E como esta é uma coluna de seleção negativa, vamos coletar as células que passaram pelo fluxo, e que, neste caso, devem ser todas células T CD4 positivas. Agora vou lavar a coluna com 12 mililitros de tampão máx, coletando novamente o eluato, que deve conter apenas células T CD4 positivas. Em seguida, vou centrifugar as células T CD4 positivas, ressuspendê-las e, então, marcá-las com o corante apropriado que vou utilizar para a imagem de tau.

Também vou coletar uma pequena amostra das células que purifiquei e marcá-las com anti-CD3 e anti-CD4, analisando-as em citometria de fluxo para garantir que tenho uma população pura de linfócitos T CD4 positivos. Aqui está uma visualização das células que acabamos de centrifugar. Esta deve ser uma população pura de linfócitos T positivos para CD3 e CD4.

Acabei de mostrar a vocês a seleção negativa de linfócitos T CD4 positivos. Utilizando o kit da Miltenyi Biotec, vamos transferir adotivamente essas células para um camundongo e utilizá-las em um de nossos próprios experimentos com T Photon e máquina. Boa sorte em seus próprios experimentos.