Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic C. elegans

O objetivo deste procedimento é quantificar de forma eficiente as dimensões e o brilho de sinais fluorescentes pontuais em gans. Assim, grandes populações de objetos podem ser analisadas. Proteínas sinápticas são imagiadas estatisticamente.

Nesta demonstração, o primeiro passo do procedimento é gerar culturas sincronizadas de alta densidade dos ELEGANS de interesse. Em seguida, obtenha imagens confocais das sinapses marcadas, minimizando a variabilidade de imagem para imagem. As puncta sinápticas são automaticamente identificadas e diferenciadas da fluorescência de fundo.

O passo final é tabular e organizar os dados para uma análise downstream eficiente. Em última instância, os resultados podem demonstrar com precisão como as condições experimentais afetam a distribuição de proteínas sinápticas ou qualquer outra proteína localizada em perfurações de alto contraste. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de projeções Zack, é que todos os dados são preservados, incluindo os volumes de sinapses, e a identificação automatizada permite a coleta rápida de centenas de amostras por condição. Testado.

Este protocolo exige culturas de alta densidade de vermes adultos CL egan's cultivados em placas de ágar NGM com 10 centímetros de altura, contendo bactérias NA 22 e Coli. Tenha exatamente uma placa pronta para cada coloração imunológica planejada. Comece colhendo os vermes com alguns mililitros de água. Transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros e repita este processo até que a maioria dos vermes seja coletada.

Centrifugue os vermes e lave o pellet com água até três vezes, até que o sobrenadante fique claro. Isso remove bactérias residuais; sempre transfira soluções que possam ou contenham vermes ou ovos com pipetas de plástico, pois eles podem aderir ao vidro. Agora é fundamental avançar rapidamente pelos passos restantes para evitar a perda da viabilidade dos ovos.

Libere os ovos do verme dobrando-os novamente em cinco mililitros de solução alcalina de hipoclorito. Agite suavemente os tubos e examine-os ao microscópio estereoscópico aproximadamente uma vez por minuto. Após cinco minutos, ou assim que cerca da metade dos vermes em um tubo parecer dobrada e rompida.

Encha o tubo até o topo com tampão de ovo e inverta-o várias vezes. Após centrifugar e obter o pellet de vermes, aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet três vezes com tampão de ovo.

Após as lavagens, Reese suspende o pellet em cinco mililitros de água, seguido pela adição de cinco mililitros de sacarose estéril a 60% em água, misturando bem. Após a centrifugação da suspensão, os ovos ficarão no menisco e apresentar-se-ão turvos.

Transfira cada coleta de ovos para sua própria placa de ágar NGM de 10 centímetros sem semeadura. Pode-se usar água para enxaguar X para a placa, mas tente minimizar a quantidade de líquidos transferidos. Incube as placas durante a noite a 20 graus Celsius nas primeiras horas. Ventile as placas deixando as tampas ligeiramente abertas, mas certifique-se de cobri-las durante a noite.

Após a eclosão, transfira as larvas L1 para um tubo cônico de 15 mililitros contendo S basil. Faça o pellet das larvas L1 e re-suspenda-as em um volume mínimo de S basil. Em seguida, divida cada coleta de L1 em duas placas de ágar NGM de 10 centímetros semeadas com bactérias NA22.

Monitore as culturas uma ou duas vezes ao dia. Se estiverem em risco de passar fome, transfira-as para placas novas de NA 22 antes que ocorra a privação de alimento, enquanto linhas do tipo N se agrupam e se movem juntas como uma onda, afastando-se das zonas com alimento esgotado; nesses casos, o alimento será completamente esgotado em algumas horas.

Quando as minhocas atingirem a idade desejada, estarão prontas para imunomarcação ou microscopia in vivo para montagem das minhocas. Para microscopia confocal, utilize meio de montagem Antifa para ajustar sua densidade a algumas centenas de minhocas por microlitro.

Com experiência, essa densidade pode ser reconhecida pela turbidez da suspensão. Idealmente, os vermes estarão densamente empacotados na lâmina do microscópio, mas sem sobreposição excessiva. Na lâmina, faça uma almofada de 2%aros em ESP basil cercada por um anel fino de Vaseline.

Para evitar a evaporação durante a aquisição de imagens, aplique a vaselina por meio de uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 25 graus com a ponta cortada. Em seguida, pipete algumas microlitros da suspensão de vermes sobre uma lamínula utilizando uma ponteira de pipeta com a extremidade cortada para evitar o cisalhamento dos vermes e posicione suavemente o suporte de agarose sobre a lamínula, distribuindo uniformemente os vermes sobre o suporte sob o microscópio. As sinapses de interesse devem ser orientadas de modo a apontar diretamente para a lente ou dentro de um ângulo de 45 graus em relação a ela.

Passe alguns segundos nisso para evitar o desbotamento da imagem. O cultivo e as condições devem fornecer vermes suficientes para atender a este critério rigoroso mostrado aqui como uma orientação ideal, com o cordão ventral orientado diretamente em direção à lente objetiva. Este próximo seria rejeitado porque o cordão ventral está orientado diretamente para longe da lente objetiva.

Observe como o cordão dorsal orientado em direção à lente neste espécime produz uma imagem mais nitidamente focalizada. Aqui há outro que seria rejeitado porque os cordões dorsal e ventral estão orientados nas bordas do verme. Assim, a luz de excitação e emissão precisa atravessar mais tecido do verme e se tornaria distorcida.

O principal desafio é minimizar a variabilidade dentro dos grupos de tratamento; a sincronização por idade e a escolha de vermes nos quais a estrutura de interesse está orientada diretamente em direção à objetiva podem ajudar muito. Começar com culturas grandes aumenta a seleção de vermes para obter a máxima consistência. Para obter os melhores resultados de imagem, escolha amostras relativamente planas que possam ser abrangidas em uma pilha de 14 ou menos imagens.

Seções de 0,4 mícron de espessura. Imagens de alta velocidade e baixa resolução são suficientes para coleta rápida e precisa de dados. Evite saturar o detector com intensidades de sinal excessivas, pois isso causará subestimação dos sinais de fluorescência.

Esta demonstração utiliza o pacote de software comercialmente disponível Velocity, que deve ser pelo menos na versão 4.0. Muitas alternativas de software perdem informações tridimensionais. Após abrir os arquivos de saída multi-TIFF do microscópio confocal, selecione imagem, depois foco estendido e, em seguida, desenho livre.

Agora, a ROI recorta áreas da imagem que não contêm a estrutura de interesse. Usando a ferramenta ativada, o foco estendido fornece uma projeção no plano Z para facilitar a seleção da ROI. Isso não afeta os dados subjacentes.

Da mesma forma, os ajustes de brilho e contraste não afetam os dados subjacentes. Conclua o recorte selecionando ações e recortando para a seleção. Em seguida, meça o comprimento da área analisada.

Usando a ferramenta de linha, o comprimento da linha será calculado e adicionado à tabela de dados. Agora, identifique objetos utilizando o filtro de objetos por intensidade no modo de medições. A inclusão de um marcador sináptico independente marcado com uma cor única pode ajudar a identificar de forma inequívoca as sinapses; especifique um limiar de modo que os aglomerados sinápticos sejam destacados e o fundo não sináptico não o seja.

Faça isso apenas uma vez usando uma amostra controle e utilize-a para todas as amostras subsequentes; limiarizar cada amostra separadamente é inaceitável porque introduz a possibilidade de viés do pesquisador. Os objetos são selecionados e tabulados automaticamente. As sinapses típicas variam de algumas a algumas centenas de vóxeis; antes de exportar os dados, ordene-os por tamanho de objeto.

Isso facilita a remoção posterior de objetos com dois ou menos vóxeis, que geralmente são apenas artefatos do fundo. Agora, exporte os dados em formatos CSV, que podem ser abertos por qualquer programa de planilha eletrônica. Cada imagem produz um arquivo de saída para classificar e exportar micrografias do cordão nervoso ventral de gânglios CL mostrando 49 receptores GABA, produzidas com o protocolo descrito.

Todos os animais apresentaram tamanho e maturidade muito semelhantes. Os valores totais de fluorescência sináptica de cinco vermes foram normalizados em relação ao comprimento do cordão nervoso analisado. Esses dados mostraram valores de erro padrão de cerca de 10% da média.

A imagem à esquerda é bruta, sem limiarização nem remoção de fundo específico. As sinapses foram tratadas com muscarmal, um agonista do receptor GABA que provoca a downregulação dos receptores após exposição prolongada. A fluorescência total foi quantificada e normalizada em relação ao comprimento do cordão nervoso e à probabilidade cumulativa.

Foram calculados histogramas do conteúdo de fluorescência dos sinapses individuais. O mesmo foi calculado para o volume dos sinapses. Essas medidas mostram que a exposição ao agonista reduz significativamente o conteúdo sináptico e o volume.

No geral, os resultados quantitativos devem sempre refletir o que pode ser apreciado visualmente. Caso contrário, a inspeção das imagens e dos objetos identificados pela velocidade deve revelar onde o erro ocorreu e sugerir ações corretivas, como limiarização ou remoção de artefatos, durante a tentativa deste procedimento. É fundamental escolher os vermes para imagem com base em sua orientação geométrica, e não em uma avaliação subjetiva da qualidade da imagem; sempre que possível, a pontuação cega é altamente recomendada.