Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

O objetivo do experimento a seguir é determinar o papel dos macrófagos polarizados em um processo biológico in vivo. Isso é conseguido primeiro esgotando os macrófagos dos camundongos. Em seguida, novos macrófagos, que expressam características únicas e têm funções distintas, são gerados.

Em seguida, os macrófagos polarizados são transferidos adotivamente para camundongos para determinar seu papel no processo biológico de interesse. Em última análise, as diferenças na inflamação mediada por macrófagos com base na doença clínica e histológica podem ser medidas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o cruzamento de camundongos em um fundo CD 11 BDTR, é que esse método é mais rápido do que a criação de camundongos.

Para experimentos. É relativamente fácil e econômico e pode ser realizado com camundongos de qualquer origem genética. Embora esse método possa fornecer informações sobre o papel dos macrófagos no intestino, ele também pode ser aplicado a uma variedade de outros órgãos, incluindo fígado, baço e pulmão.

Duas horas antes da injeção, remova os tubos de lipossomas e PBS do armazenamento de quatro graus Celsius. Quando os lipossomas atingirem a temperatura ambiente, inverta os tubos oito a 10 vezes para garantir uma distribuição uniforme. Em seguida, carregue 200 microlitros da suspensão quente a lipossoma em uma seringa de um mililitro e conecte uma agulha de calibre 26.

Role a seringa entre as palmas das mãos e inverta-a seis vezes para distribuir a solução lipossomal uniformemente antes da injeção. Agora use uma mão para raspar, um rato logo abaixo das orelhas, segurando pele suficiente para imobilizar sua cabeça e membros, e então incline o rato para que sua cabeça fique ligeiramente voltada para o chão. Em seguida, segurando a seringa em um ângulo de 30 a 40 graus.

Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen e injete 200 microlitros de solução de lipossomas. Depois de sacrificar um camundongo de oito a 12 semanas e prender os membros em uma posição esticada, remova os fêmures e tíbias cortando o máximo de músculo possível durante o processo de dissecação. Em seguida, carregue uma seringa de cinco mililitros com IMDM com 10%FCS.

Anexe uma agulha de calibre 26 e lave a medula dos ossos. Dilua os aspirados de medula óssea em 40 mililitros de IMDM com FCS e, em seguida, transfira as células para um frasco quadrado de cultura de tecidos de 75 centímetros. Incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono após quatro horas.

Recolher o supinato num tubo cónico de 50 mililitros e centrifugar os progenitores não aderentes durante cinco minutos a 300 vezes G e à temperatura ambiente. Após a contagem, cultivar as células recuperadas em uma concentração de 0,5 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio completo em frascos quadrados frescos de 75 centímetros. No quarto dia, gire as células de não aderência e devolva-as aos frascos em meio fresco.

No sétimo dia, descarte as células de não aderência, substituindo-as por meios frescos. No dia 10, descarte a mídia. Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de dissociação celular ao frasco.

Após cinco minutos, bater firmemente na lateral do balão com a palma de uma das mãos várias vezes. Examinar as células ao microscópio para se certificar de que foram retiradas do fundo do frasco. Em seguida, pipetar as células ressuspensas em um tubo cônico de 15 mililitros.

Lave o frasco com mais 10 mililitros de IMDM mais FCS e, em seguida, gire as células por cinco minutos a 300 vezes G e temperatura ambiente. Após a contagem, ressuspenda as células recuperadas a uma concentração de 10 a sete células por mililitro em PBS estéril, reservando uma vez 10 a seis macrófagos para avaliações do fenótipo de macrófagos, comece equipando uma seringa de um mililitro cheia de 100 microlitros na suspensão de macrófagos recém-preparada com uma agulha de calibre 26. Em seguida, o mouse mais quente usa uma lâmpada de calor por cinco a 10 minutos para dilatar a veia da cauda.

Depois de transferir o mouse para um dispositivo de contenção, gire a cauda 90 graus para que a veia fique voltada para cima. Limpe o local da injeção com um algodão embebido em álcool e, em seguida, segure a agulha com o lado do bisel virado para cima. E em um pequeno ângulo, insira a agulha quase paralela à veia.

Se a agulha for inserida corretamente, nenhuma resistência deve ser sentida e a veia deve ficar clara após a injeção após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Essas seções imuno-histoquímicas de um cólon de camundongo demonstram que a injeção intraperitoneal de clodronato contendo lipossomas resulta em uma diminuição em F quatro 80 macrófagos positivos durante a colite induzida por DSS, como evidenciado pela diminuição na coloração F quatro 80 em marrom em comparação com o controle PBS injetado em camundongos arginase um positivo. Alternativamente, os macrófagos ativados em marrom também são esgotados com sucesso usando injeções de lipossomas de clodronato.

A mancha azul nesta e na figura anterior representa núcleos, pois o gráfico de barras mostra a avaliação quantitativa de F quatro 80 macrófagos derivados de MCSF positivos e arginase um positivo. Alternativamente, MCSF ativado derivado mais IL quatro macrófagos tratados indica que ambas as populações estão significativamente esgotadas em camundongos que recebem injeções intraperitoneais de lipossomas de clodronato. Esses dados demonstram os resultados de um ensaio de graxa típico, que mede os níveis de óxido nítrico em resposta ao lipopolissacarídeo, detectando seu metabólito a jusante, o nitrito.

Assim, os macrófagos derivados de MCSF classicamente ativados produzem níveis significativamente mais altos de nitrito em comparação com MCSF alternativamente ativado derivado mais IL quatro macrófagos tratados. Os macrófagos classicamente ativados também produzem uma proporção mais alta de IL 12 P 70 para IL 10 em comparação com macrófagos ativados alternadamente, medidos por ELA, consistentes com um fenótipo ativado alternativamente. Macrófagos derivados de MCSF tratados com IL quatro expressam constitutivamente YM um e arginase um, conforme detectado por fio dental imuno ocidental.

Aqui, o número total de macrófagos M1 classicamente ativados e o número de macrófagos M dois ativados alternativamente em enumerados em cortes histológicos de camundongos injetados com macrófagos derivados da medula óssea polarizada são mostrados. A barra de dados C indica camundongos de controle que receberam uma injeção de PBS sem macrófagos. O impacto que a transferência de macrófagos polarizados tem no cólon durante a colite induzida por SDS é indicado pelo índice de atividade da doença, uma pontuação aditiva baseada na perda de peso, sangramento retal e diminuição da consistência das fezes.

Observe que os macrófagos M1 não afetam a inflamação, enquanto os macrófagos M dois reduzem significativamente o índice de atividade da doença. Portanto, esses resultados demonstram que os macrófagos transferidos adotivamente derivados de dex vivo podem trafegar para o cólon e impactar a inflamação induzida após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam a biologia de macrófagos explorarem o papel da polarização de macrófagos em camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar o papel dos macrófagos polarizados na homeostase e na doença em camundongos.