Name: NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a monitorar o estado redox mitocondrial em corações isolados de coelho usando imagem de fluorescência de NADH. Este método permite estudar metabolismo cardíaco em condições fisiológicas.

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Este trabalho foi financiado por uma subvenção do NIH (R01-HL095828 para Kay MW).

1. Configurando para o Estudo <ol><li> Preparar quatro litros de solução modificada de Krebs-Henseleit 16 (em mM: NaCl 118, KCl 3,30, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glicose, 2,00 NaPyruvate, e 20,0 mg / L de albumina ). A solução deve ser preparada como se perto do início da experiência quanto possível. O pH deve ser ajustado para 7,4 após a filtragem estéreis (tamanho de poro: 22 uM, Corning). Osmolalidade da solução deve situar-se entre 275 e 295 mOsm / kg. </li><li> Lavar todos os tubos e as câmaras de trabalho do coração do sistema com água purificada. Executar bombas até que toda a água ter sido removido do sistema. </li><li> Adicionar filtros de membrana de celulose (dimensão do poro: 5 m, Advantec), em conformidade com cada uma das bombas de perfusão (Langendorff bomba de perfusão, a bomba de perfusão do coração esquerdo, e uma bomba de perfusão do coração direito). </li><li> Realizar uma calibração de dois pontos (0 e 60 mmHg) para cada sensor de pressão. </li><li>Ligue os banhos de água. Um banho de água aquecida circulantes (Cole Palmer) é utilizado para aquecer os tubos jaqueta de água e permutadores de calor. Perfusato é pré-aquecida num banho de água separada (Oakton Instruments). Ambos os banhos são ajustados para manter uma temperatura de solução de 37 ° C. </li><li> Ligar as bombas para circular o perfusato num circuito fechado. Perfusato passa através oxigenadores microfibra (hemofiltros) gaseificada com 95% de O2 e 5% de CO2 a 80 kPa. Perfusato oxigenado então flui através permutadores de calor para mantê-lo a uma temperatura de 37 ° C antes de entrar no cânulas coração. </li></ol> 2. Excisão Coração <ol><li> Comece por definir o sistema de coração a trabalhar para operar em modo de pressão constante Langendorff. Regule a pressão do bloco da aorta dentro do intervalo de 50 a 60 mmHg. </li><li> Anestesiar o coelho com uma injecção intramuscular de cetamina (44 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Após o coelho é sedado, pentobarbital (50 mg / Kg) e heparina (2000 U) é injectados intravenosamente através da veia marginal da orelha ou a veia safena lateral, do lado de dentro do membro posterior. </li><li> Quando o coelho é completamente não-responsivo, tal como determinado por uma falta de dor reflexa, a cavidade torácica é rapidamente aberto, o pericárdio é cortada, a aorta é fixada, eo coração e os pulmões são excisados. Neste ponto, os pulmões devem ser unida ao coração para ajudar com isolando as veias pulmonares. </li><li> Isolar e canular a aorta com uma cânula de diâmetro 5 mm que está ligada a uma seringa preenchida com 60 ml de perfusato e 200 unidades de heparina. Proteger da aorta para a cânula com tamanho de sutura de seda zero e lentamente deprimir a seringa para lavar o coração de sangue. </li></ol> 3. A canulação biventricular <ol><li> Ligue o coração para o bloco da aorta do sistema de coração de trabalho. Prevenir a entrada de ar da aorta, que pode causar embolia coronária. É melhor para prender a cânula da aorta para o block aproximando o conector da aorta num ângulo oblíquo e permitindo perfusato suavemente para escorrer desde o conector para dentro da cânula enquanto ele está ligado. </li><li> Enquanto o coração é perfundido no modo de pressão constante Langendorff, retire a gordura e tecido conjuntivo e localizar os seguintes navios: inferior e veia cava superior, veia ázigos, artéria pulmonar, veias pulmonares. </li><li> Ligadura da veia cava superior. Corte a artéria pulmonar logo abaixo de onde se ramifica para as artérias pulmonares direita e esquerda. </li><li> Grupo de todos os vasos restantes (das veias pulmonares) entre o coração e os pulmões e ligar todos eles usando uma sutura. Remover os pulmões. </li><li> Corte um pequeno buraco no canto do apêndice atrial esquerdo. Certifique-se que a LA está cheio de perfusato. Canular a LA assegurando ao mesmo tempo que a cânula é completamente preenchida com perfusato enquanto ele é inserido. Suturar a cânula ao apêndice LA. </li><li> Ligue o lado esquerdo da bomba (bomba # 2) para fornecer um caudal de tele átrio esquerdo. Regule a pressão pré-carga entre 2-6 mmHg e ajustar ± 2 mmHg, tal como determinado pela dilatação atrial. </li><li> Mudar o coração para o modo de trabalho do coração, desligando a bomba Langendorff (bomba # 1). </li><li> Momentaneamente diminuir a pressão aórtica a 10 mmHg e, em seguida, lentamente aumentá-la para dentro do intervalo de 80 a 100 mmHg. Isto irá permitir que a válvula aórtica para abrir e funcionar como seria durante condições fisiológicas normais. A pressão de pós-carga final irá depender da contractilidade do VE. Ele deve ser definido para um valor que é cerca de 20 mmHg inferior a pico de pressão do VE. </li><li> LV débito cardíaco pode ser determinada pela medição da taxa de fluxo de perfusato sair do bloco da aorta (mL / min). Débito cardíaco normal está entre 14,77 e 16,43 mL / min por 100 g de peso corporal 17 e médias 340 mL / min para um coelho kg 2,2. Pressão aórtica deve ser semelhante ao sinal de pressão mostrado na Figura 1. </li><li> Canular a RA através do inferior veia cava. Assegure-se que tanto a AR ea cânula são completamente preenchido com perfusato e inserir a cânula enquanto impede a formação de bolhas de ar. Suturar a cânula na veia. </li><li> Ligue o lado direito da bomba (bomba # 3) para fornecer o fluxo para a aurícula direita. Regule a pressão para aproximadamente 3 mmHg. </li><li> Assegurar que o RV é preenchido com perfusato e canular a artéria pulmonar. Assegure-se que a cânula é completamente preenchida com perfusato enquanto ele é inserido para evitar bolhas de ar. Suturar a cânula na artéria pulmonar. </li></ol> 4. Aquisição do Sinal: Pressões, potenciais de ação monofásico, e fNADH <ol><li> Uma vez que a canulação biventricular está completa, cuidadosamente inserir o cateter transdutor de pressão (Millar) na aorta através da cânula da aorta. Gentilmente navegá-lo para além da válvula aórtica e para o LV. Monitorizar o sinal de pressão do VE para garantir o posicionamento correcto da ponta do cateter. Um exemplo da pressão do VE é mostradona Figura 1. </li><li> Pressione suavemente o eléctrodo de potencial monofásico ação contra epicárdio ventricular. Monitorar o sinal para alcançar medidas de potencial de ação apropriadas. Artefacto ligeiro movimento no sinal é normal. </li><li> Coloque um eléctrodo bipolar estímulo no átrio direito a andar o coração. No nosso protocolo, os corações foram ritmo, em comprimentos de ciclo entre 300 e 150 mseg, correspondendo a 200 e 400 bpm, respectivamente. </li><li> Medir a temperatura da superfície do epicárdio do VE. Se o estudo exige que a temperatura seja mantida a 37 ° C, em seguida, posicionar o coração dentro de uma câmara do coração de água com camisa ou submergir o coração num banho de superfusate aquecido para manter uma temperatura constante durante todo o coração. </li><li> Posicione a câmera CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixels) e focar a lente de tal forma que um campo apropriado do ponto de vista é observado. A câmera é conectada a uma estação de trabalho e as imagens são adquiridas em 2 fps usando Andor SOLIS software. </li><li> Ligar a luz da lâmpada de mercúrio antes do início das imagens. A luz é dirigida através de um filtro de excitação (350 ± 25 nm, Tecnologia Chroma) e em um guia de luz de fibra óptica (Horiba Jobin Yvon modelo 1950-1M) para iluminar a superfície do coração. A atenuação da luz UV por meio do guia de luz é pequena. Iluminação UV pode ser feita utilizando um sistema de LED de alta potência composto por luzes LED (Mightex PLS-0365-030-S) e uma unidade de controle (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Desligue a luz ambiente e minimizar qualquer tipo de iluminação ambiente. Mire as virolas do guia de luz (ou projectores LED) no coração para atingir a iluminação epicárdica uniforme. Emitida NADH fluorescência (fNADH) passa através de um filtro de emissão (460 ± 20 nm Tecnologia Chroma) e é representada pela câmara CCD. </li><li> Monitorar as mudanças fNADH ao longo do tempo, selecionando uma região de interesse utilizando o software de imagem. Selecione viver-atualizar o modo de monitorar a intensidade de pixel média na região of interesse. </li><li> O coração deve estar funcionando no modo de trabalhar biventricular para gerar pressões adequadas. níveis fNADH deve ser baixa e estável ao longo da superfície epicárdica para confirmar a perfusão coronária adequada. Neste ponto no estudo um protocolo experimental específico devem ser implementados para testar uma hipótese. </li><li> Quando o estudo estiver concluído, remova o coração do sistema e drenar toda a perfusato. Enxaguar o tubo do sistema e câmaras com água purificada. Para a manutenção de rotina, o sistema deve ser periodicamente lavados com solução Mucasol ou uma solução de peróxido de hidrogénio diluído, conforme necessário. </li></ol> 5. Off-line Processamento de Imagens fNADH <ol><li> Uma forma de conjuntos de dados de comparação NADH (fNADH (i, j, t)) entre os experimentos é normalizar cada imagem de fluorescência usando uma imagem de referência (fNADH (i, j, t 0)) a partir do conjunto de dados de 9, como mostrado na equação abaixo . Outra forma de normalizar NADH fluorescência é plÁs um pequeno pedaço de vidro de uranilo no campo de visão antes da experiência 9, 18, ​​19. Vidro de uranilo vontade de fluorescência (450 - 550 nm) quando iluminada com luz UV para proporcionar um sinal que pode ser utilizado como uma referência estável. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Os resultados representativos Vistas anterior e basal de uma preparação de coração de coelho trabalhando biventricular são mostrados na Figura 1. Pressão do ventrículo esquerdo foi medido por navegar um cateter transdutor de pressão (Millar SPR-407) para além da válvula aórtica e para o ventrículo esquerdo. Pressões artéria aorta, pulmonar, e do ventrículo esquerdo (LVP) são mostrados na Figura 1C. LVP diastólica é geralmente entre 0 e 10 mmHg. A pressão aórtica diastólica mínimo é de cerca de 60 mmHg. Pico sistólico LVP é dependente de pressão de enchimento (a pré-carga ou pressão LA) e contratilidadee, optimamente, deve estar entre 80 e 100 mmHg. A pressão máxima da aorta e máximo LVP deve corresponder estreitamente, como mostrado na Figura 1C. Potenciais de acção monofásica (MAPs) com uma fase de despolarização rápido e uma fase de repolarização que são típicos para corações de coelho são mostrados na Figura 1D. MAPs pode ser gravado de forma relativamente fácil de um coração contratante, mas terá geralmente artefacto pequeno movimento durante a diástole, como mostrado na Figura 1D. MAPs são úteis para a confirmação de arrastamento bem sucedida do coração (captura) durante a estimulação e também pode ser usado para medir as alterações locais electrofisiológicos devido à isquemia ou outras perturbações agudas. Um ECG poderia também ser medido por submersão do coração em um banho de superfusate quente e colocando um eléctrodo no banho nos lados esquerdo e direito do coração. Um terceiro eléctrodo indiferente ou é colocado no banho, para fora do coração, ou está ligado à aorta.Um ECG irá fornecer informações sobre a excitação global e processo de repolarização, que é útil para avaliar a função eléctrica global e para revelar a presença de isquemia. fNADH imagiologia revela alterações no estado redox mitocondrial do coração, que podem ser utilizados para medir a progressão espaço-temporal das regiões isquémicas ou hipóxico. Para este estudo, epicárdica fNADH foi medida para monitorar mudanças no estado redox durante três taxas de estimulação na duração do ciclo (CLS) de 300, 200 e 150 ms. Os valores médios fNADH a partir de uma região de interesse (caixa vermelha, Figura 2) mostram que os níveis basais fNADH aumentar à medida que o comprimento do ciclo é encurtado. Quando frequência de estimulação está perto de ritmo sinusal (CL = 300 ms) basal nível fNADH é relativamente constante. Como a duração do ciclo é reduzido abaixo de 300 ms, base fNADH aumento dos níveis, com o maior aumento no menor CL (150 ms). Alta resolução fNADH imagem da superfície total anteriora 200 e 400 bpm é mostrado na Figura 3. níveis fNADH a 200 bpm eram constantes e espacialmente homogênea. A 400 batimentos por minuto, os níveis de fNADH aumentou substancialmente ao longo do epicárdio. Heterogeneidade espacial significativa foi observada com os maiores aumentos ocorreram nas regiões do septo do VD e VE. O sinal de fNADH oscila com contracção (artefacto de movimento) ea frequência de oscilação corresponde à frequência cardíaca (Figura 2). Em canulação biventricular, a base do coração é mantido por 4 cânulas, o que ajuda a impedir que o coração de balançar durante a contracção. Portanto, a amplitude de oscilação é sempre menor do que qualquer escala mais tempo (seg 5-10) tendências fNADH que são causadas por isquemia ou hipóxia. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Pressões típicas e os potenciais de ação monofásico de um biventricular isolado rabbit coração. A. vista Basal do coração, mostrando as cânulas quatro: 1, da aorta; 2, artéria pulmonar; 3, da esquerda atrial; e 4, atrial direita B. vista anterior do coração mostrando o ventrículo esquerdo (LV) e do ventrículo direito. (RV). C. pressões representativas. Top: pressão ventricular esquerda (linha sólida) ea pressão aórtica (linha pontilhada). Conclusão: pressão pulmonar. D. Representante monofásicos potenciais de ação. O sinal é alinhado com as pressões mostrado no painel C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH imagem de um biventricular isolado coração de coelho. Top: Um desenho do campo de visão (esquerda) e três imagens fNADH são mostrados. O comprimento do ciclo de estimulação correspondente (CL) é indicado em cada imagem.A região de interesse para o sinal de fNADH no painel de fundo é indicado pela caixa vermelha. A ponta do eléctrodo do potencial de acção monofásica é visto à direita da região de interesse. O epicárdio foi iluminada usando uma lâmpada de mercúrio e de guia de luz, como mostrado na Figura 5. Apenas a superfície epicárdica em torno da região de interesse foi iluminada inferior:. FNADH média para a região de interesse indicado pela caixa vermelha no painel de topo. Média aumenta fNADH com comprimento de ciclo reduzido. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH imagens de toda a superfície anterior de uma biventricular isolado coração de coelho. O coração estava acelerado da RA a 200 bpm e 400 bpm. fNADH foi fotografada (2 fps, 128x128 pixels com uma resolução de 0,4 mm), enquanto iluminando todo o epicárdio anterior usando dois LEDs de alta potência (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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Não há conflitos de interesse declarados.

O coração isolado perfundido Langendorff continua a ser uma ferramenta importante para o estudo da fisiologia cardíaca 2. É especialmente útil em estudos de arritmias cardíacas, particularmente aqueles que utilizam imagens de fluorescência do potencial transmembranar 20. Uma vantagem é que o epicárdio inteira do coração isolado pode ser observado 21, 22. Outra vantagem é que, em contraste com o sangue, a perfusão com uma solução clara cristalóide tampão não interferir com os sinais de fluorescência. Uma limitação é que a técnica de Langendorff não é bem adequado para estudos de metabolismo cardíaco, que muitas vezes exigem o coração para realizar o trabalho dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Para elevar a relevância de preparações de coração isolado para estudos metabólicos, Neely introduzidas modificações à técnica Langendorff estabelecer adequada pré-carga do ventrículo esquerdo (LV) e as pressões pós-carga 3.O modelo é conhecido como o modelo de coração isolado LV de trabalho e tem sido utilizado extensivamente para estudar LV desempenho e metabolismo 4-6. A LV modelo de coração de trabalho é superior ao modelo Langendorff para avaliações funcionais, no entanto, não fornece um ventrículo carregado corretamente direito (VD). Demmy et al. relatada pela primeira vez um modelo biventricular (VE e VD) como uma modificação do modelo de coração LV de trabalho 7, 8. Eles descobriram que o desenvolvimento do volume sistólico, débito cardíaco e pressão melhorou nos corações convertidos do modo de trabalho LV para o modo de trabalhar biventricular 8. A RV carregado corretamente também melhora a função septal diminuindo gradientes de pressão anormais através do septo. Biventriculares corações de trabalho têm sido mostrados para manter o débito da aorta, fluxo pulmonar, pressão média da aorta, a média pressão pulmonar, a frequência cardíaca e enfarte do ATP, e os níveis de fosfato de creatina por até 3 horas 8. Biventriculares estudos cardíacos trabalho normalmente usam corações franimais om pequenos, tais como ratos e coelhos, porque o débito cardíaco e do volume necessário de perfusato são muito menos do que aquele para corações de animais maiores. No entanto, estudos cardíacos biventriculares de trabalho foram realizadas em corações de suínos, caninos, e até seres humanos 23, 24. A procura metabólica de corações isolados em modo de funcionamento biventricular é consideravelmente mais elevada do que a de perfusão de Langendorff. É importante que a solução perfusato fornecer oxigénio suficiente e substrato metabólico para suportar a função cardíaca biventricular. Padrão soluções tampão cristalóide, tais como solução de Krebs-Henseleit 16, 17, 25 ou Tyrodes 26, 27, têm solubilidades de oxigénio tão elevada como 5,6 mg / L. Quando estas soluções são gaseificada com carbogénio (uma mistura gasosa de 95% de O2 e 5% de CO 2) e contêm substrato metabólico adequado (glucose, dextrose, e / ou de piruvato de sódio), eles são apropriados para biventriculares corações de trabalho batendo na normaal taxas sinusal (aproximadamente 180 bpm para um coelho). Aumenta a demanda metabólica para ritmos rápidos e da quantidade de oxigênio dissolvido no perfusato padrão pode não ser suficiente para suportar totalmente o coração biventricular trabalho que está se contraindo a taxas elevadas. Soluções tampão cristalóides contendo eritrócitos ou misturado com sangue inteiro têm sido utilizados em preparações de coração de trabalho para assegurar a disponibilidade de oxigénio adequada. Estudos anteriores demonstraram que a adição de eritrócitos a uma solução de Krebs-Henseleit a melhoria da função cardíaca de trabalho durante a protocolos de estimulação rigorosas e também reduziu a incidência de fibrilação ventricular 16. Uma limitação do uso de eritrócitos ou misturas de sangue total é que a hemoglobina interfere com comprimentos de onda de luz que são usados ​​para a fluorescência de imagem 13. Outros substratos, tais como albumina, podem também ser adicionados ao perfusato soluções para prolongar a viabilidade do coração e reduzir o edema 28. Durante as imagens de fluorescência a intensidade da luz de excitação deve ser elevada ea distribuição da luz deve ser uniforme. Conseguir uma iluminação uniforme nem sempre é fácil devido à curvatura da superfície epicárdica. Nos nossos estudos, imagem fNADH por filtragem de luz (350 ± 25 nm) a partir de uma lâmpada de mercúrio. A bifurcada fibra óptica guia de luz é usada para direcionar a luz UV para a superfície epicárdica. Iluminação uniforme pode ser conseguido através do posicionamento adequado dos dois virolas de saída. UV fontes de luz LED poderia também ser usado, como já demonstrado na Figura 3. Fontes de LED são relativamente baratos para múltiplas fontes poderia ser incorporada um sistema de imagem. LEDs podem também ser reciclados e desligar a taxas elevadas para sincronizar luz de excitação com a aquisição de imagem. Fotobranqueamento de NADH deve ser minimizada 29, reduzindo o tempo de iluminação do tecido. Isto pode ser feito por bicicleta a iluminação e desligado usando um electrãoic do obturador e uma lâmpada ou com um sistema de iluminação de LED e um controlador. Se a iluminação é sincronizado com o ciclo cardíaco, em seguida, a aquisição da imagem fNADH poderia ser confinada a diástole, o que reduziria artefacto movimento nos sinais de fluorescência. Trigging iluminação e aquisição de imagem usando um sinal de pressão, tais como pressão do VE, seria uma maneira de fazer isso. Nos nossos estudos observou-se que alterações na fNADH por unidade de tempo pode ser mais do que 5X superior a 400 batimentos por minuto do que a 200 batimentos por minuto. Isto indica que os ritmos rápidos elevar o estado redox do coração. Seja ou não este é causado por hipóxia ou a incapacidade de miócitos para oxidar NADH a NAD + com rapidez suficiente para evitar o acúmulo de NADH é ainda uma questão sem resposta. O desempenho de uma preparação cardíaca biventricular de trabalho é subordinada múltiplos fatores. Um dos mais importante é definir pressões adequadas de pré-carga e pós-carga para imitar o fisiológicocondições que estão sob investigação. Em particular, a pós-carga LV (pressão aórtica) deve ser ajustada para representar a pressão sistémica. Se for demasiado elevada, a VE não será capaz de ultrapassar a pressão, resultando em regurgitação. Pressão muito baixa afetará adversamente a perfusão coronária. A pressão de pré-carga LV (pressão do átrio esquerdo) deve também ser ajustada para proporcionar um volume final diastólica, que é apropriado para o protocolo experimental. fNADH imagiologia de tecido vivo é um modo estabelecido de fluorescência de imagem 13. Sua aplicação em tecido cardíaco foi ilustrado por Barlow e Chance quando relataram elevações marcantes da fNADH no tecido regional isquêmico após a ligadura de um vaso coronário 14. Suas imagens fNADH foram registrados em filme usando uma câmera osciloscópio Fairchild e fotografia com flash UV. Coremans et al. expandida este conceito usando o NADH rácio de reflectância de fluorescência / UV para measure no estado metabólico do epicárdio do coração de Langendorff sangue-perfundidos de rato 30. Um videofluorimeter foi usado para geração de imagens e os dados foram registados usando um gravador de vídeo. Mais tarde, Scholz et ai. utilizado um espectrógrafo de matriz e fotodiodo para medir fNADH média a partir de uma grande área de VE. Essa abordagem reduz os efeitos de heterogeneidades epicárdicos fluorescência e variações locais em circulação, enquanto revelando macroscópicas relacionadas ao trabalho variações de fNADH 31. Esta abordagem é semelhante aos níveis médios de computação fNADH para uma região de interesse em todos os quadros de um conjunto de dados de imagem fNADH, como ilustrado na Figura 2. Como já apresentado neste artigo, a tecnologia de hoje oferece câmeras de alta velocidade controlada digitalmente CCD e holofotes de alta potência UV. Essas tecnologias permitem que a dinâmica espaço-temporais de fNADH e metabolismo cardíaco a ser estudado a partir de muitas perspectivas novas. O custo relativamente baixo das ópticas e fonte de luz faz com que fNADH a imagem de um acessório útil para cardíacos convencionais sistemas de mapeamento ópticos. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> De NaHCO3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 233-S </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158.968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescência de imagem biventricular isolado de coelho

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Desde a sua criação por Langendorff 1, o coração isolado perfundido continua a ser uma ferramenta importante para o estudo da fisiologia cardíaca 2. No entanto, não é bem adequado para estudos de metabolismo cardíaco, que requerem o coração para realizar o trabalho dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Modificações introduzidas Neely para a técnica de Langendorff para estabelecer adequada pré-carga do ventrículo esquerdo (LV) e as pressões pós-carga 3. O modelo é conhecido como o modelo de coração isolado LV de trabalho e tem sido utilizado extensivamente para estudar LV desempenho e metabolismo 4-6. Este modelo, no entanto, não proporciona um ventrículo adequadamente carregado direito (VD). Demmy et al. relatada pela primeira vez um modelo biventricular como uma modificação do modelo de coração LV de trabalho 7, 8. Eles descobriram que o desenvolvimento do volume sistólico, débito cardíaco e pressão melhorou nos corações convertidos do modo de trabalho LV para o modo de trabalhar biventricular 8 </sup&gt;. A RV carregado corretamente também diminui gradientes de pressão anormais através do septo para melhorar a função septal. Biventriculares corações de trabalho têm sido mostrados para manter o débito da aorta, fluxo pulmonar, pressão média da aorta, a frequência cardíaca, e os níveis de ATP miocárdio por até 3 horas 8. Ao estudar os efeitos metabólicos da lesão do miocárdio, tais como isquemia, é frequentemente necessário para identificar a localização do tecido afectado. Isto pode ser feito por imagem a fluorescência de NADH (a forma reduzida do dinucleótido de nicotinamida adenina) 9-11, uma coenzima encontrados em grandes quantidades nas mitocôndrias. NADH fluorescência (fNADH) exibe uma relação inversa com perto de linearmente 12 locais de oxigénio concentração e fornece uma medida do estado redox mitocondrial 13. fNADH imagiologia durante condições hipóxicas e isquémicas tem sido utilizado como um método de corante-se livre para identificar regiões hipóxicas 14, 15 e para monitorizar a progressão dacondições hipóxicas ao longo do tempo 10. O objectivo do método é para monitorar o estado redox mitocondrial de biventriculares corações de trabalho durante protocolos que alteram a taxa de metabolismo dos miócitos ou induzir hipóxia ou criar uma combinação dos dois. Corações provenientes de coelhos brancos da Nova Zelândia foram ligados a um sistema de coração biventricular de trabalho (Hugo Sachs Elektronik) e perfundidos com solução modificada de Krebs-Henseleit 16 a 37 ° C. Aórtica, LV, da artéria pulmonar, e esquerda e direita pressões atriais foram registrados. A atividade elétrica foi medida usando um eletrodo de potencial monofásico ação. Para imagem fNADH, a luz de uma lâmpada de mercúrio foi filtrada (350 ± 25 nm) e usado para iluminar o epicárdio. Luz emitida foi filtrada (460 ± 20 nm) e fotografada com uma câmara CCD. As alterações na fNADH epicárdica de biventriculares corações de trabalho durante as taxas de estimulação de diferentes são apresentadas. A combinação do modelo de coração e de imagem fNADHfornece uma ferramenta nova e valiosa para o estudo experimental patologias cardíacas agudas dentro do contexto de realistas condições fisiológicas.

O objectivo é para monitorar o estado redox mitocondrial de corações isolados dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Um modelo de coração biventricular trabalhando coelho é apresentado. Alta resolução espaço-temporal de imagens de fluorescência de NADH é usado para monitorar o estado redox mitocondrial do tecido epicárdico.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Desde a sua criação por Langendorff1, o coração isolado perfundido continua a ser uma ferramenta proeminente para o estudo da fisiologia cardíaca2. No entanto, não é adequado...

O objetivo geral deste procedimento é estudar o metabolismo. Utilizando a imagem de NADH em uma preparação de coração funcionando, isso é realizado primeiramente isolando o coração de coelho. O segundo passo do procedimento é canular com sucesso as quatro câmaras do coração para obter um modelo de coração funcionando.O passo final consiste em configurar o equipamento de imageamento e coletar dados de NADH em diferentes taxas de estimulação. Em última análise, os resultados podem demonstrar alterações metabólicas do coração por meio da imagem de NADH fluorescente. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a perfusão retrograda de Langendorff, é que o coração está operando em seu estado fisiológico, com fluxo na direção normal e com o próprio coração gerando a pressão necessária para a perfusão coronariana.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na eletrofisiologia e nos mecanismos de arritmias letais. Isso é feito por meio de um modelo fisiológico para estudar a ligação entre o metabolismo do fluxo coronariano e a atividade elétrica. A demonstração visual deste método é essencial porque os passos de cânula nas artérias e câmaras cardíacas são difíceis de aprender.Técnica inadequada pode danificar o coração e comprometer o restante do experimento. Antes de realizar um experimento, enxágue todos os tubos nas câmaras do sistema de coração isolado com água purificada e, em seguida, remova a água do sistema acionando as bombas. Adicione filtros de membrana de celulose em linha com a bomba de perfusão LOR, a bomba de perfusão do coração esquerdo e a bomba de perfusão do coração direito.Após adicionar o PERFUSE oito ao sistema, realize uma calibração de dois pontos para cada sensor de pressão. Ligue o banho de água aquecido e circulante que aquece os tubos com jaqueta de água e os trocadores de calor. Ligue o banho de água, utilizado para aquecer o PERFUSE oito.Ligue as bombas que circulam o PERFUSE oito em um circuito fechado, ligue o tanque de circulação para oxigenar o Perfuse. Oito, certifique-se de que o oxigenador de microfibra ou os filtros hemáticos estão fornecendo 95% de oxigênio ao perfusato oito a 80 quilopascal. Por fim, verifique se os trocadores de calor estão mantendo a temperatura do perfusato em circulação.Oito a 37 graus Celsius, inicie a excisão cardíaca configurando primeiro o sistema cardíaco de trabalho para operar em pressão constante. Modo LRF. Ajuste a pressão do bloqueio aórtico entre 50 e 60 após sedar um coelho.Injete pentobarbital e heparina na veia marginal da orelha ou na veia safena lateral na face interna do membro posterior. Assim que o coelho perder o reflexo de dor, abra rapidamente a cavidade torácica. Corte o pericárdio, prenda a aorta e excise o coração e os pulmões.Os pulmões são mantidos presos para facilitar o isolamento das veias pulmonares. Em seguida, encha uma seringa com 60 mililitros por F oito e 200 unidades de heparina. Fixe uma cânula de cinco milímetros e cânule a aorta.Fixe a aorta à cânula com suturas de seda número zero. Em seguida, pressione lentamente a seringa para lavar o sangue através do coração. Monte o sistema de coração funcionando conectando primeiro o coração ao bloco aórtico.Aproxime-se do conector em um ângulo oblíquo e permita que o Perfuse oito a goteje suavemente do conector para a cânula enquanto estiver conectado. Isso impede que o ar entre na aorta, prevenindo assim embolias coronárias enquanto o coração é perfundido em pressão constante. Modo L endorf.Remova a gordura e o tecido conjuntivo e localize os seguintes vasos. Veia cava inferior e superior, veia aorta, artéria pulmonar e veias pulmonares. Em seguida, ligue a veia cava superior.Corte a artéria pulmonar logo abaixo do ponto em que se divide nas artérias pulmonares direita e esquerda. Os vasos restantes são as veias pulmonares. Agrupe-as entre o coração e os pulmões e ligue todas usando um único ponto de sutura.Isso é crítico por duas razões. Primeiro, amarrar os vasos conectados aos pulmões garantirá que não haja vazamento assim que a cânula for colocada. E segundo, é importante isolar ambas as veias cavas para a cânula posterior.Agora remova os pulmões. Corte um orifício de tamanho apropriado no canto da aurícula esquerda e certifique-se de que esteja cheio com profuse eight. Em seguida, canule a aurícula enquanto a cânula estiver completamente preenchida com perfuse eight.Em seguida, enquanto segura o tecido, suturar a cânula à apêndice. O tecido do apêndice auricular esquerdo é extremamente delicado e pode rasgar facilmente. Por isso, é importante canular o átrio esquerdo na primeira tentativa, caso contrário pode não ser mais possível.Ligue a bomba número dois para fornecer fluxo ao átrio esquerdo. Ajuste a pré-carga entre dois e seis tor durante todo o experimento. Pode ser necessário ajustar a pressão.Mantenha-o dentro de dois milímetros da pressão alvo. Agora, mude o coração para o modo de coração funcionando desligando momentaneamente a bomba número um, a bomba de Langendorff. Reduza a pressão aórtica para dez torr e, em seguida, aumente lentamente até a faixa de 80 a 100 torr.Isso permite que a válvula aórtica se abra e funcione como o faria durante condições fisiológicas normais. Ajuste a pressão final de pós-carga para um valor que seja aproximadamente 20 unidades menor que a pressão pico do VE, utilizando uma cânula diretamente conectada ao sistema.Realize a cânula no átrio direito através da veia cava inferior e fixe a cânula com sutura na veia. Evite introduzir bolhas de ar. Ligue a bomba número três, a bomba do lado direito, para fornecer fluxo ao átrio direito.Regule a pressão para aproximadamente três torr. Por fim, canule o ventrículo direito sem permitir a entrada de ar e sutura a cânula à artéria pulmonar. Isso conclui a canulação biventricular.Agora prossiga para a aquisição do sinal. Insira cuidadosamente o cateter do transdutor de pressão na aorta por meio da cânula da aorta. Navegue suavemente por dentro da válvula aórtica e até o ve.O sinal de pressão do VE aparecerá conforme esperado quando a ponta do cateter estiver adequadamente posicionada. Em seguida, pressione suavemente o eletrodo de potencial de ação monofásico contra o epicárdio ventricular. Um leve artefato de movimento no sinal do eletrodo é normal.Em seguida, posicione um eletrodo bipolar de estímulo sobre o átrio direito para estimular o coração de acordo com a posição definida no desenho experimental. E foque a câmera CCD na região de interesse do coração. Deve haver um filtro de emissão acoplado à câmera.Para detectar a fluorescência do NADH, desligue as luzes ambiente para iluminar uniformemente o epicárdio com uma fonte de luz ultravioleta na estação de trabalho, à qual a câmera está conectada. Configure o software para adquirir imagens a duas quadros por segundo. Em seguida, selecione o modo de atualização contínua para monitorar a intensidade média dos pixels dentro da região de interesse.Se a perfusão foi adequada, os níveis de NADH representados pela fluorescência devem ser baixos e estáveis sobre a superfície epicárdica. Agora, execute o experimento quando estiver completo. Remova o coração.Drene o PERFUSE oito e os tubos e câmaras do sistema com água purificada. Enxágue periodicamente o sistema com solução TM mucosal ou uma solução diluída de peróxido de hidrogênio utilizando o protocolo descrito. Os corações foram estimulados em comprimentos de ciclo entre 200 e 400 batimentos por minuto.A pressão ventricular esquerda diastólica (PVE) geralmente estava entre zero e 10 tor; a pressão aórtica diastólica mínima era aproximadamente 60 tor. A pressão ventricular esquerda sistólica de pico depende da pressão de enchimento e da contratilidade, e idealmente deveria estar entre 60 e 80 tor; a pressão aórtica máxima e a PVE máxima deveriam ser muito semelhantes. Os potenciais de ação monofásicos típicos do coração de coelho apresentam uma fase de despolarização rápida e uma fase de repolarização característica. Os potenciais de ação foram facilmente registrados nas preparações, mas geralmente apresentavam um pequeno artefato de movimento durante a diástole.Valores médios de NADH fluorescente de uma região de interesse na caixa vermelha foram medidos para monitorar alterações no estado redox mitocondrial durante três ciclos de estimulação com durações de 300, 200 e 150 milissegundos, quando a frequência de estimulação estava próxima ao ritmo sinusal. O nível basal de NADH foi relativamente constante à medida que o ciclo foi encurtado. Abaixo de 300 milissegundos, os níveis basais de NADH aumentaram, com o maior aumento ocorrendo em 150 milissegundos; o sinal oscila com a contração e a frequência da oscilação corresponde à frequência cardíaca.A amplitude dessas oscilações foi sempre menor do que qualquer tendência em escalas de tempo mais longas causada por isquemia ou hipóxia. A imagem fluorescente de alta resolução do NADH na superfície anterior completa a 200 batimentos por minuto foi constante e espacialmente homogênea a 400 batimentos por minuto. Os níveis de NADH aumentaram substancialmente em todo o epicárdio.Observou-se uma heterogeneidade espacial significativa, com os maiores aumentos ocorrendo nas regiões septais do VD e do VE uma vez dominada a técnica. Este procedimento pode ser realizado em menos de 45 minutos, se for executado corretamente. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que bolhas de ar entrem na aorta ou no átrio esquerdo após este procedimento.Métodos adicionais, como carregar o coração com um corante sensível à voltagem, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como relacionar a atividade elétrica e metabólica na superfície do coração durante cenários patológicos, tais como isquemia local, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores em fisiologia cardíaca estudarem o metabolismo cardíaco e distúrbios de condução durante condições patológicas, utilizando um modelo mais fisiologicamente relevante.

nadh-fluorescence-imaging-isolated-biventricular-working-rabbit

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

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Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

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Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

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Modelos de coração de trabalho isolados podem ser usados para medir o efeito das condições de carga, frequência cardíaca e medicamentos no desempenho miocárdico e no consumo de oxigênio. Descrevemos métodos para a preparação de um modelo de trabalho do coração esquerdo de roedores que permite o estudo do desempenho sistólico e diastólico e do consumo de oxigênio sob várias condições.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

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O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

O presente estudo demonstra um modelo animal altamente reprodutível de lesão aguda de isquemia e reperfusão miocárdica regional em coelhos, utilizando uma minitoracotomia esquerda para casos de sobrevida ou uma esternotomia mediana para casos de não sobrevida.

Modelo de Lesão de Isquemia e Reperfusão em Coelhos

Aprenda a monitorar o estado redox mitocondrial em corações isolados de coelho usando imagem de fluorescência de NADH. Este método permite estudar metabolismo cardíaco em condições fisiológicas.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

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