NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

O objetivo geral deste procedimento é estudar o metabolismo. Usando imagens NADH em uma preparação de coração funcional, isso é feito isolando primeiro o coração do coelho. A segunda etapa do procedimento é caninar com sucesso todas as quatro câmaras do coração para obter um modelo de coração funcional.

A etapa final é configurar o equipamento de imagem e coletar dados NADH em diferentes taxas de ritmo. Em última análise, os resultados podem mostrar alterações metabólicas do coração por meio de imagens de NADH fluorescente. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a retroprofusão de lanor, é que o coração está operando em seu estado fisiológico com fluxo na direção normal e com o coração fornecendo sua própria pressão para a perfusão coronária.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em eletrofisiologia e os mecanismos de arritmias letais. Isso é feito fornecendo um modelo fisiológico para estudar a ligação entre o metabolismo do fluxo coronário e a atividade elétrica. A demonstração visual desse método é fundamental porque as etapas de canulação do vaso e da câmara cardíaca são difíceis de aprender.

A técnica inadequada pode danificar o coração e comprometer o resto do experimento. Antes de executar um experimento, enxágue todos os tubos nas câmaras do sistema cardíaco em funcionamento com água purificada e, em seguida, purgue a água do sistema ligando as bombas. Adicione filtros de membrana de celulose alinhados com a bomba de perfusão LOR, a bomba de perfusão cardíaca esquerda e a bomba de perfusão cardíaca direita.

Depois de adicionar o perfusível oito ao sistema, execute uma calibração de dois pontos para cada sensor de pressão. Ligue o banho-maria circulante aquecido que aquece os tubos com camisa de água e os trocadores de calor Ligue o banho-maria. Usado para aquecer o PERFUSE oito.

Ligue as bombas que circulam o PERFUSE oito em circuito fechado, ligue o tanque de circulação para oxigenar o Perfuse. Oito, certifique-se de que o oxigenador de microfibra ou hemofiltros estejam fornecendo 95% de oxigênio para o perfuse oito a 80 quilopascais. Por fim, certifique-se de que os trocadores de calor estejam mantendo a temperatura do perfusível circulante.

Oito a 37 graus Celsius, comece a excisão do coração primeiro configurando o sistema cardíaco em funcionamento para operar em pressão constante. Modo LRF. Defina a pressão do bloqueio aórtico entre 50 e 60 para depois de sedar um coelho.

Injete pentobarbital e heparina na veia marginal da orelha ou na veia safena lateral no interior do membro posterior. Quando o coelho não tiver um reflexo de dor, abra rapidamente a cavidade torácica. Corte o pericárdio, clampeie a aorta e excise o coração e os pulmões.

Os pulmões são mantidos ligados para facilitar o isolamento das veias pulmonares. Em seguida, encha uma seringa com 60 mililitros por F oito e 200 unidades de heparina. Anexe uma cânula de cinco milímetros e canule a aorta.

Prenda a aorta à cânula com suturas de seda tamanho zero. Em seguida, pressione lentamente a seringa para eliminar o sangue pelo coração. Configure o sistema cardíaco em funcionamento conectando primeiro o coração ao bloqueio aórtico.

Aproxime-se do conector em um ângulo oblíquo e deixe o Perfuse oito pingar suavemente do conector para a cânula enquanto estiver conectado. Isso impede que o ar entre na aorta, evitando assim êmbolos coronários enquanto o coração é perfundido em pressão constante. Modo L endorf.

Remova a gordura e o tecido conjuntivo e localize os seguintes vasos. Veia inferior e superior, veia aose, artéria pulmonar e veias pulmonares. Em seguida, ligue a veia superior cva.

Corte a artéria pulmonar logo abaixo de onde ela se ramifica para as artérias pulmonares direita e esquerda. Os vasos restantes são as veias pulmonares. Agrupe-os entre o coração e os pulmões e ligue-os todos usando uma sutura.

Isso é fundamental por dois motivos. Primeiro, amarrar os vasos conectados aos pulmões garantirá que não haja vazamento quando a canulação for concluída. E segundo, é importante isolar ambas as cavas VNA e a canulação posterior.

Agora remova os pulmões. Faça um orifício de tamanho apropriado no canto do apêndice atrial esquerdo e certifique-se de que esteja preenchido com oito abundantes. Em seguida, canule o apêndice enquanto a cânula está completamente preenchida com perfuse oito.

Em seguida, enquanto segura o tecido, suture a cânula no apêndice. O tecido do apêndice atrial esquerdo é extremamente delicado e pode rasgar facilmente. Portanto, é importante canular o átrio esquerdo na primeira tentativa, caso contrário, pode não ser possível.

Ligue a bomba número dois para fornecer fluxo para o átrio esquerdo. Defina a pré-carga entre dois e seis tor durante todo o experimento. A pressão pode precisar ser ajustada.

Mantenha-o dentro de dois milímetros da pressão alvo. Agora mude o coração para o modo de coração de trabalho desligando a bomba número um, a bomba langor momentaneamente. Diminua a pressão aórtica para tender tor e, em seguida, aumente-a lentamente para dentro da faixa de 80 a 100 tor.

Isso permite que a válvula aórtica se abra e funcione como faria durante condições fisiológicas normais. Defina a pressão final de pós-carga para um valor que seja aproximadamente 20. Rasgou menos do que a pressão de pico do VE usando uma cânula diretamente conectada ao sistema.

Canule o átrio direito através do AVC da veia inferior e suture a cânula na veia. Evite introduzir bolhas de ar. Ligue a bomba número três, a bomba do lado direito para fornecer fluxo para o átrio direito.

Ajuste a pressão para aproximadamente três tor. Por fim, canule o ventrículo direito sem permitir a entrada de ar e suture a cânula na artéria pulmonar. Isso completa a canulação biventricular.

Agora prossiga para a aquisição de sinais. Insira cuidadosamente o cateter transdutor de pressão na aorta através da cânula da aorta. Navegue suavemente pela válvula aórtica e entre no lv.

O sinal de pressão do VE aparecerá conforme o esperado quando a ponta do cateter estiver posicionada corretamente. Em seguida, pressione suavemente o eletrodo de potencial de ação monofásico contra o epicárdio ventricular. Um leve artefato de movimento no sinal do eletrodo é normal.

Em seguida, coloque um eletrodo de estímulo bipolar no átrio direito para estimular o coração de acordo com a posição do projeto experimental. E foque a câmera CCD na região de interesse do coração. Deve haver um filtro de emissão conectado à câmera.

Para passar a fluorescência NADH, desligue as luzes ambientes para iluminar uniformemente o epicárdio com uma fonte de luz UV na estação de trabalho, na qual a câmera está conectada. Para configurar o software para adquirir imagens a dois quadros por segundo. Em seguida, selecione o modo de atualização ao vivo para monitorar a intensidade média de pixels na região de interesse.

Se a profusão for adequada, os níveis de NADH representados pela fluorescência devem ser baixos e estáveis sobre a superfície epicárdica. Agora, execute o experimento quando ele estiver concluído. Remova o coração.

Drene o PERFUSE oito e a tubulação e câmaras do sistema com água purificada. Enxágue periodicamente o sistema com solução de mucosa TM ou uma solução diluída de peróxido de hidrogênio usando o protocolo descrito. Os corações foram colados em ciclos entre 200 e 400 batimentos por minuto.

A PVE diastólica estava geralmente entre zero e 10 tor, a pressão aórtica diastólica mínima era de aproximadamente 60, a PVE sistólica de pico Tor depende da pressão de enchimento e contratilidade e, idealmente, deve estar entre 60 e 80. Para a pressão aórtica máxima e a LVP máxima devem corresponder de perto à ação monofásica Os potenciais típicos do coração de um coelho têm uma fase de despolarização rápida e uma fase de repolarização característica. Os potenciais de ação foram facilmente registrados a partir das preparações, mas geralmente tinham um pequeno artefato de movimento durante a diástole.

Os valores médios de NADH fluorescente de uma região de interesse na caixa vermelha foram medidos para monitorar as mudanças no estado redox mitocondrial durante três ciclos de estimulação em comprimentos psico de 300, 200 e 150 milissegundos quando a taxa de estimulação estava próxima do ritmo sinusal. O nível basal de NADH foi relativamente constante à medida que a duração do ciclo foi reduzida. Abaixo de 300 milissegundos, os níveis basais de NADH aumentaram com o maior aumento em 150 milissegundos, o sinal oscila com a contração e a frequência de oscilação corresponde à frequência cardíaca.

A amplitude dessas oscilações foi sempre menor do que quaisquer tendências de escala de tempo mais longas causadas por isquemia ou hipóxia. A imagem fluorescente NADH de alta resolução de toda a superfície anterior a 200 batimentos por minuto foi constante e espacialmente homogênea a 400 batimentos por minuto. Os níveis de NADH aumentaram substancialmente em todo o epicárdio.

Heterogeneidade espacial significativa foi observada, com os maiores aumentos ocorrendo nas regiões septais do VD e do VE, uma vez dominados. Esta técnica pode ser feita em menos de 45 minutos se for realizada corretamente. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar que bolhas de ar entrem na aorta ou no átrio esquerdo Após este procedimento.

Métodos adicionais, como carregar o coração com um corante sensível à voltagem, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como vincular a atividade elétrica e metabólica na superfície do coração durante cenários patológicos, como isquemia local após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em fisiologia cardíaca estudarem o metabolismo cardíaco e os distúrbios de condução durante condições patológicas usando um modelo fisiologicamente mais relevante.