Name: Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda a preparar lâminas de gelatina fluorescente para quantificar a degradação da matriz extracelular mediada por invadópodos em células individuais e grupos multicelulares. Este método permite analisar manipulações genéticas e farmacológicas.

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Este trabalho foi financiado por fundos de doações da West Virginia University Maria Babb Randolph Cancer Center. Agradecemos Susette Mueller (Georgetown University) e Laura Kelley para aconselhamento precoce e assistência. O uso da Universidade de West Virginia Facilidade imagens de microscopia (apoiado pela Babb Mary Randolph Cancer Center e, subvenções NIH P20 RR16440, P30 e P30 RR032138 GM103488) é reconhecido agradecimento.

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A habilidade de visualizar as células que degradam a matriz extracelular ajudou na descoberta dos mecanismos moleculares utilizados nos passos iniciais da invasão celular. Lançado pela Wen-Tien Chen no início dos anos 1980 4,14,15, revestimento fluorescente etiquetado proteínas extracelulares em lamínulas para posterior análise microscópica emergiu como a principal técnica para avaliação da função invadopodia em uma ampla gama de tipos de células. O protocolo prescrito demonstra o método básico utilizado para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Instrumento </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td> Pele de porco </td></tr><tr><td> sacarose </td><td> Pescador </td><td> BP220 </td><td></td></tr><tr><td> 12 milímetros lamínulas </td><td> Pescador </td><td> 50-121-5159 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> Pescador </td><td> 08-772-1 </td><td> BD Falcon </td></tr><tr><td> ácido nítrico </td><td> Ricca </td><td> R5326000 </td><td> Solução a 20% </td></tr><tr><td> poli-L-lisina </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19320-B </td><td> Solução a 0,1% </td></tr><tr><td> glutaraldeído </td><td> Sigma </td><td> G7526 </td><td> Solução a 8% </td></tr><tr><td&gt; Oregon Verde 488-conjugado gelatina </td><td> Invitrogen </td><td> G-13186 </td><td></td></tr><tr><td> boro-hidreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> 213462 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescador </td><td> BP151 </td><td></td></tr><tr><td> rodamina-faloidina </td><td> Invitrogen </td><td> R415 </td><td></td></tr><tr><td> anti-cortactina (clone 4F11) </td><td> Millipore </td><td> 05-180 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-FLAG </td><td> Millipore </td><td> MAB3118 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 de cabra anti-IgG de ratinho </td><td> Invitrogen </td><td> A21235 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> Domínio público </td><td></td><td> <a href="http://www.macbiophotonics.ca/imagej/" target="_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</a> </td></tr><tr><td> Software X2.2 Autoquant </td><td> Media Cybernetics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements software </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em contextos individuais e multicelulares

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Invasão celular em tecidos locais é um processo importante no desenvolvimento e homeostase. Invasão Malregulated e movimento subsequente é característica de células de vários processos patológicos, incluindo a inflamação, doença cardiovascular e metástases de células do tumor 1. Degradação proteolítica focalizado de matriz extracelular (ECM) em componentes da membrana basal epitelial e endotelial, é um passo crítico na iniciação invasão celular. Em células tumorais, extensa análise in vitro determinou que a degradação de ECM é realizado por ventrais estruturas ricas em actina de membrana denominado protrusivos invadopodia 2,3. Invadopodia forma em aposição próxima da ECM, onde moderada avaria ECM através da acção de metaloproteinases de matriz (MMPs). A capacidade das células tumorais para formar invadopodia correlaciona-se directamente com a capacidade de invadir a estroma local e associados componentes vasculares 3. _content &quot;&gt; A visualização das invadopodia degradação mediada por ECM de células por microscopia de fluorescência usando proteínas marcadas com corante de matriz revestida em vidro lamelas tem emergido como a técnica mais comum para avaliar o grau de proteólise da matriz e do potencial invasivo celular 4,5. Aqui descrevemos uma versão do método padrão para a geração de lamelas de vidro marcados por fluorescência utilizando um equipamento comercialmente disponível Oregon Green-488 conjugado gelatina. Este método pode ser facilmente dimensionada para produzir rapidamente um grande número de lamelas revestidas. Mostramos alguns dos erros comuns microscópicas que são frequentemente encontrados durante este processo, e como estes podem ser evitados. Finalmente, descrevemos métodos normalizados, utilizando software de computador facilmente disponível para permitir a quantificação da degradação da matriz de gelatina marcada mediada por células individuais e por toda a populações celulares. Os procedimentos descritos proporcionam a capacidade de controlar de forma precisa e reprodutível invadopodiaactividade, e pode também servir como uma plataforma para a avaliação da eficácia da expressão da proteína de modulação ou ensaio de anti-invasivos compostos sobre a degradação da matriz extracelular em locais individuais e multicelulares.

Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

A invasão celular em tecidos locais é um processo importante no desenvolvimento e na homeostase. A invasão desregulada e a subsequente movimentação celular são...

Essa técnica padrão produz lamínulas recobertas com gelatina marcadas com fluorescência, adequadas para ensaios quantitativos de degradação da matriz por invadopódios. Após revestir as lamínulas com gelatina fluorescentemente marcada, plaque as células e cultive-as para degradação da matriz. Em seguida, fixe e marque fluorescentemente as células para proteínas marcadoras de invadopódios, adquira as imagens e quantifique a degradação da matriz.Os resultados típicos podem quantificar as diferenças na degradação da matriz mediada por invadopódios entre células com manipulação diferencial de genes selecionados ou tratamento com agentes farmacológicos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a preparação de lamínulas revestidas com gelatina e fluorescência homogênea é difícil de alcançar devido ao revestimento irregular da gelatina fluorescente ou ao manuseio inadequado das lamínulas revestidas com gelatina. O procedimento será demonstrado pela professora assistente de pesquisa Karen Martin, o pesquisador pós-doutorando Mandy Ammer e os estudantes de pós-graduação Elise Walk, Karen Hayes e Steve Markwell.Para preparar a solução estoque de gelatina e sacarose a 5% não marc

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Modelos de invasão das células tumorais em três dimensões da matriz extracelular melhor refletir...

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Este vídeo descreve a técnica de utilização de uma matriz nativa para estudar a invasão de células tumorais. A técnica usada neste ensaio fornece a capacidade de avaliar as interações epitelial-mesenquimais em um ambiente 3D sem a necessidade de uma matriz sintética ou estranha.

Ensaio de invasão de células tumorais: um método baseado em matriz nativa 3D in vitro para avaliar as interações epitelial-mesenquimais

Este vídeo mostra a microscopia quantitativa de lapso de tempo para avaliar a disseminação de Listeria monocytogenes dependente da rigidez da matriz extracelular através de células endoteliais. Um hidrogel mais macio facilita a disseminação bacteriana mais rápida através das células endoteliais em comparação com contrapartes mais rígidas, destacando a influência da rigidez da matriz na disseminação bacteriana.

Microscopia quantitativa de lapso de tempo para avaliação da disseminação bacteriana dependente da rigidez da matriz extracelular

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar continuamente os processos de adesão celular e de aderência com alta resolução temporal de uma forma não-invasiva por impedância célula-substrato e imagens de células vivas analisa. Estas abordagens revelar a dinâmica dos processos de adesão célula / de aderência desencadeadas por modificação da matriz e a sua relação temporal com os eventos de sinalização dependentes de adesão.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Muitos genes regulados estimulam a migração e invasão de células tumorais, levando a um prognóstico ruim. Determinar quais genes regulam a migração e invasão de células tumorais é fundamental. Este protocolo apresenta um método para investigar os efeitos do aumento da expressão de um gene sobre a migração e invasão de células tumorais em tempo real.

Mensuração Quantitativa em Tempo Real da Migração e Invasão de Células Tumorais Após Transfecção de RNAm Sintético

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda a preparar lâminas de gelatina fluorescente para quantificar a degradação da matriz extracelular mediada por invadópodos em células individuais e grupos multicelulares. Este método permite analisar manipulações genéticas e farmacológicas.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

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