Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Essa técnica padrão produz lamínulas recobertas com gelatina marcadas com fluorescência, adequadas para ensaios quantitativos de degradação da matriz por invadopódios. Após revestir as lamínulas com gelatina fluorescentemente marcada, plaque as células e cultive-as para degradação da matriz. Em seguida, fixe e marque fluorescentemente as células para proteínas marcadoras de invadopódios, adquira as imagens e quantifique a degradação da matriz.

Os resultados típicos podem quantificar as diferenças na degradação da matriz mediada por invadopódios entre células com manipulação diferencial de genes selecionados ou tratamento com agentes farmacológicos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a preparação de lamínulas revestidas com gelatina e fluorescência homogênea é difícil de alcançar devido ao revestimento irregular da gelatina fluorescente ou ao manuseio inadequado das lamínulas revestidas com gelatina. O procedimento será demonstrado pela professora assistente de pesquisa Karen Martin, o pesquisador pós-doutorando Mandy Ammer e os estudantes de pós-graduação Elise Walk, Karen Hayes e Steve Markwell.

Para preparar a solução estoque de gelatina e sacarose não marcada a 5%, combine a gelatina e a sacarose em PBS e dissolva completamente a 37 graus Celsius. Em seguida, armazene a quatro graus Celsius. Prossiga para limpar as lamínulas de vidro.

Distribua um lamínula individual em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, adicionando a cada poço 500 microlitros de ácido nítrico a 20% e incube por 30 minutos. Após a remoção da solução de ácido nítrico, lave os lamínulas três vezes com água deionizada. Em seguida, revista.

Cada lamínula com 500 microlitros de 50 microgramas por mililitro de poliol, lycina, e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Remova a solução de polilisina e lave três vezes com PBS. O revestimento com polilisina facilita o revestimento uniforme e a ligação do gelatina marcada sobrejacente. Coloque as placas de 24 poços sobre gelo e adicione 500 microlitros de glutaraldeído 0,5% recém-preparado a cada poço.

Incube bem as placas no gelo durante 15 minutos. Realize três lavagens com PBS frio e, em seguida, aspire todos os vestígios de PBS antes do revestimento com gelatina. Enquanto isso, durante a incubação com glutaraldeído, reconstitua a gelatina conjugada com Oregon Green 488.

Conforme o protocolo do fabricante, aqueça-o e a solução estoque de sacarose gelatina 5% não rotulada a 37 graus Celsius. Em seguida, dilua 500 microlitros de gelatina rotulada em quatro mililitros de gelatina não rotulada. Pipete 100 microlitros da mistura diluída de gelatina 488 em cada lamínula.

Usando quantidade suficiente de gelatina para revestir a lamínula sem espalhamento manual. É importante manter a mistura diluída de gelatina 488 a 37 graus durante o procedimento de revestimento para evitar solidificação prematura. Além disso, a partir deste passo, mantenha as lamínulas no escuro tanto quanto possível para evitar potencial descoloração pela luz.

Depois que todas as lamínulas forem revestidas em uma única placa, segure a placa em um ângulo e remova o excesso de gelatina de cada poço por aspiração a vácuo. Em seguida, incube as lamínulas revestidas no escuro por 10 minutos à temperatura ambiente. Após lavar as lamínulas três vezes com PBS, adicione 500 microlitros de borohidreto de sódio, hidreto de sódio, borohidreto de sódio.

O borohidreto é efervescente e pequenas bolhas serão visíveis na superfície e ao redor de cada lamínula; incubar por 15 minutos à temperatura ambiente para reduzir e inativar o glutaraldeído residual. Remover a solução de borohidreto de sódio por aspiração a vácuo, com um movimento rápido ao redor da borda externa de cada poço, tomando cuidado para não aspirar quaisquer lamínulas soltas que se tenham destacado do fundo da placa de cultura de tecidos durante o tratamento com borohidreto de sódio. Após três lavagens com PBS, incubar as lamínulas em etanol 70% por 30 minutos à temperatura ambiente.

Utilizando técnica estéril, transfira a lamínula contendo as placas para uma capela de fluxo laminar tipo II para cultura de células B e lave as lamínulas três vezes com PBS estéril, utilizando uma agulha estéril e pinça. Transfira cuidadosamente as lamínulas para um poço vazio de uma nova placa de 24 poços para equilibrar. As lamínulas com o meio de cultura para o tipo celular específico sendo acidificado.

Agora, semeie as células diretamente sobre as lamínulas após um tempo apropriado de incubação. Processe as amostras para imagem de imunofluorescência para montar as amostras. Coloque uma gota de prolongado ouro anti desbotamento ou reagente similar sobre uma lâmina de microscopia e posicione cuidadosamente a lamínula invertida, adquira imagens para análise.

Esta análise fornece a área normalizada de degradação da matriz em relação à área das células ou ao número de células. É útil para analisar campos microscópicos inteiros onde estão presentes múltiplas células que foram coletivamente tratadas com fatores de crescimento irna ou agentes terapêuticos. Para esta análise, são utilizadas imagens coletadas em menor aumento, suficiente para coletar eficientemente informações sobre populações de células.

Abra a imagem no ImageJ. Verifique as informações de escala e selecione as medições. Escolha a área e limite às opções de limiar. Calcule a área de degradação utilizando a imagem de gelatina fluorescente, corrigindo a iluminação irregular na gelatina subtraindo o limiar de fundo, ajustando a imagem para definir os valores de intensidade de pixel superior e inferior.

Nas imagens subsequentes. Use o botão definir na janela de limiar para estabelecer o mesmo limiar para todas as imagens como um meio objetivo de selecionar a área de degradação. Utilize a função analisar partículas para medir o limiar nas áreas de degradação da matriz.

Escolha um tamanho de partícula maior que zero para remover o ruído da seleção. Exiba os contornos para identificar regiões de interesse. Em seguida, marque exibir resultados e resumir para mostrar as medições, caso o desenho tenha delimitado especificamente todas as áreas de degradação.

Copie a medição da área total para uma planilha; se outros objetos foram selecionados, como detritos, registre apenas as áreas das regiões de interesse relevantes. Em seguida, para calcular a área celular, abra o foid e o limiar da imagem corada para definir os valores de intensidade de pixel superior e inferior de modo que as bordas das células sejam selecionadas nas imagens subsequentes. Use o botão definir na janela de limiar para aplicar o mesmo limiar a todas as imagens.

Como um meio objetivo para selecionar a área celular. Utilize a função analisar partículas para medir o limiar da área das células. Escolha um tamanho de partícula maior que zero para remover o ruído da seleção.

Exibir contornos para identificar regiões para análise, verificar os resultados exibidos e resumir para mostrar as medidas de área. Não marque. Inclua os orifícios se houver espaços entre as células e um agrupamento.

Agora escolha. Ok, copie os resultados da área para as regiões de interesse relevantes em uma planilha e calcule a área de degradação da gelatina por área total de células. Uma abordagem alternativa é normalizar a área de degradação ao número de células, determinado pela contagem de núcleos corados com DAP e.

Isso é importante se manipulações alterarem a área média da célula. Para esta abordagem, utilize o plugin contador de núcleos para contar automaticamente os núcleos. Ajuste as opções para otimizar de acordo com suas imagens. Se os núcleos se sobrepuserem extensivamente, a contagem automática pode não fornecer uma enumeração precisa neste caso.

A contagem manual pode ser facilitada com o uso do plugin de contagem de células quando realizada corretamente. Lâminas de cobertura são uniformemente revestidas com gelatina conjugada com Oregon Green 488. Vários artefatos podem ocorrer durante o revestimento e o processamento de lâminas de cobertura revestidas com gelatina.

Por exemplo, um revestimento irregular resulta da cobertura inadequada do lamínula durante o processo de revestimento, devido à mistura insuficiente, espalhamento manual ou solidificação parcial da mistura de gelatina. Arranhões indicam a remoção da matriz revestida por meio de riscos com agulhas ou pinças durante o manuseio. A secagem da superfície do lamínula durante períodos prolongados de armazenamento pode resultar em uma aparência semelhante a paralelepípedos. Esta área reflete o desbotamento fotográfico da superfície fluorescente de gelatina durante a aquisição de imagens, devido à exposição prolongada ou à luz de alta intensidade.

Observe como uma lamínula bem preparada exibe fluorescência homogênea quando visualizada por microscopia. As matrizes finas resultantes produzidas durante este procedimento fornecem um meio sensível para avaliar a capacidade das células de degradar a MEC. Por exemplo.

Essas imagens capturam a atividade de degradação da matriz do podium invadido por uma célula de câncer de cabeça e pescoço OSC 19. Aqui, as células foram semeadas sobre lamínulas de gelatina conjugadas com Oregon Green 488 e analisadas por microscopia de fluorescência, conforme mostrado nas imagens 2D e 3D. Essas células OSC 19 semeadas em lamínulas de gelatina conjugadas com Oregon Green 488 foram marcadas com fitofalemina conjugada com R domine e anticorpos anti-cort-actina, visualizados com anticorpo secundário ANOR 647 e coloridas artificialmente em verde para indicar invasão.

Os podia são evidentes na imagem mesclada como concentrações focais citoplasmáticas de actina F e cortan que se sobrepõem às áreas de volume de clareamento de gelatina. A visualização mostra como os podia invadidos penetram no subvolume de ECMA, criado para exibir uma borda no interior da célula onde estão presentes os podia invadidos. A vista da borda dorsal demonstra os podia invadidos inseridos na gelatina subjacente.

A vista da borda ventral mostra projeções nos podia de Veda e áreas de degradação da gelatina sob a lamínula como regiões vermelhas presentes na matriz verde. Essas imagens mostram alguns dos passos importantes para a quantificação de células que degradam a matriz de gelatina normalizada em toda a imagem microscópica. Todas as imagens fluorescentes foram convertidas para escala de cinza para melhor exibir o limiar vermelho e as marcações da região de interesse.

Esta imagem de gelatina conjugada com Oregon Green 488 mostra as áreas escuras onde ocorreu a degradação. Após aplicação de limiarização, a imagem de gelatina destaca as áreas de degradação, a partir das quais são medidas as regiões de interesse selecionadas quanto à área de degradação. Esta imagem mostra rumine, foid e coloração de f actina conforme esperado.

O limiar na imagem da actina destaca a área total da célula a partir da qual são selecionadas as áreas celulares a serem medidas. Da mesma forma, a técnica pode ser aplicada para estudar imagens de núcleos celulares corados com DAPI. Este painel demonstra etapas selecionadas envolvidas na quantificação da degradação fluorescente de gelatina por células individuais dentro de uma população celular mista.

Essa quantificação simples é de uma única célula OSC 19 transfectada superexpressando cortactina recombinante fundida à marcação epitópica flag. Observe como a degradação da matriz por células transfectadas também pode ser analisada dentro de uma população mista de células transfectadas e não transfectadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar várias coisas.

Primeiro, certifique-se de que seus marcadores celulares fluorescentes não se sobreponham à cor da gelatina fluorescente. Ao coletar imagens, é importante escolher campos com base na presença de células. Não busque preferencialmente áreas de degradação, pois isso pode introduzir viés nos dados devido à variabilidade entre linhagens celulares e suas respostas a diversos agentes terapêuticos.

Fatores como o tempo de degradação do número de assentos e a seleção de proteínas para marcação por imunofluorescência devem ser otimizados para o seu experimento específico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar lamínulas uniformemente revestidas com gelatina fluorescente a partir de ensaios de degradação mediada por podios, bem como dos métodos para quantificação da degradação da matriz.