Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

O objetivo geral deste procedimento é medir uma topologia de adesão celular em um substrato com precisão de nanômetro. Isso é conseguido primeiramente cultivando células em lâminas de vidro transparentes e incubando-as com um marcador fluorescente. Em seguida, a posição angular do espelho ajustável do microscópio é calibrada e a posição é armazenada no programa de posicionamento do espelho.

O próximo passo é registrar as imagens de fluorescência mediante irradiação em aproximadamente 10 ângulos diferentes. O passo final é calcular as distâncias entre a célula e o substrato com uma precisão de alguns nanômetros. Por fim, os resultados da topologia da adesão celular ao substrato são utilizados para demonstrar diferenças na adesão entre diferentes linhagens celulares, por exemplo, células cancerígenas e células menos malignas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a resolução real está na faixa de apenas alguns nanômetros. Embora este método possa fornecer informações sobre membranas celulares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como vesículas pequenas ou nanomateriais.

Quem demonstrará o experimento será nossa pós-doutoranda Petra, que preparará as amostras celulares, e nosso engenheiro, Michael Wagner, que realizará o experimento. Para preparar as células para microscopia de fluorescência por reflexão interna total em ângulo variável, semeie células individuais em uma densidade de 100 células por milímetro quadrado em uma lâmina de vidro, em meio de cultura suplementado com 10% de soro de bezerro fetal e antibióticos. Incube as células por 72 horas em estufa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, aplique às células o marcador fluorescente de membrana seis D, decano dois, dimetilamino naftaleno ou lorano numa concentração de oito micromolar no meio de cultura, e incube por 60 minutos antes da microscopia de fluorescência. Lave as células com PBS, pipetando a solução tampão sobre a lâmina de objeto para remover o meio; depois, remova a solução tampão do lado posterior da lâmina de objeto. Utiliza-se um microscópio ereto, como o Zeiss Axio plan, equipado com uma câmera E-M-C-C-D com iluminação traseira e/ou exon, para ângulo variável.

O T-I-R-F-M substitui seu condensador por um dispositivo de iluminação personalizado com um prisma de vidro hemi-cilíndrico acoplado opticamente ao lâmina do objeto. O feixe de laser incide a partir de uma fibra monocromática colimada, que, após a formação da imagem pelo prisma de vidro e outros componentes ópticos, resulta novamente em um feixe paralelo na superfície da amostra. Tenha cuidado para que o vetor do campo elétrico esteja polarizado perpendicularmente ao plano de incidência.

Essa posição é marcada no acoplador de saída da fibra. Utilize um espelho ajustável localizado dentro do condensador, que é projetado no plano da amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidência ou raio do objeto. O espelho ajustável pode ser acionado por um motor de passo, que é controlado por software.

Cada posição corresponde a um ângulo de incidência bem definido, determinado por medições geométricas. Para calibrar a posição angular do espelho ajustável, utilize um corante fluorescente, como o nucleotídeo de flavina a um milimolar, dissolvido em água. Para visualizar o ângulo crítico mediante a variação do ângulo de incidência, utilize o ângulo crítico de 61,3 graus para uma transição vidro-água como valor fixo; a posição angular do espelho na qual o ângulo de incidência é igual ao ângulo crítico é armazenada no programa de posicionamento do espelho.

Utilizando o software da câmera, defina os parâmetros da câmera E-M-C-C-D, incluindo ganho de temperatura, tempo de gravação e velocidade de deslocamento. Use óleo de imersão para garantir o contato óptico da amostra. Com um prisma de vidro, selecione uma lente objetiva com ampliação apropriada para as células e abertura numérica moderada.

Para visualizar o objeto no microscópio, utilize um filtro de passagem longa ou de passagem de banda apropriado para a detecção de fluorescência. Registre imagens de fluorescência de amostras idênticas mediante variação do ângulo de iluminação. Os ângulos de incidência devem ser iguais ou maiores que o ângulo crítico.

Com o ângulo crítico correspondente a 64,5 graus para uma interface célula-vídeo, recomenda-se uma faixa angular de 66 a 74 graus com incrementos de 0,5 ou um grau. Para iniciar a análise dos dados, utilize o programa LabVIEW para ler as imagens registradas em diversos ângulos, bem como as configurações da câmera, o comprimento de onda de excitação e os índices de refração. Para o vidro, cujo valor é 1,52, e para as células, cujo valor é 1,37, as configurações são importadas para a avaliação adequada dos dados.

Para cada conjunto de parâmetros, a profundidade de penetração e o fator de transmissão são calculados automaticamente para o sucesso do procedimento. É importante que as imagens sejam cuidadosamente registradas e selecionadas para análise. Selecione as imagens utilizadas para a avaliação das distâncias entre células e substrato de acordo com a equação.

Para um marcador de membrana, imagens individuais com iluminação homogênea, como mostrado neste exemplo, podem ser excluídas. Calcule imagens da topologia do substrato celular e selecione um código de cores apropriado para exibição durante a avaliação. Perfis de pixels individuais podem ser exibidos conforme ilustrado nesta figura.

Esses perfis podem ser usados como um indicador da qualidade do ajuste. Por fim, armazene o protocolo de avaliação. Esta figura mostra imagens de reflexão interna total de células de glioblastoma U2 51 mg com o gene supressor de tumor TP 53 ativado.

Após a incubação com luan registrada em vários ângulos de incidência, 66 graus correspondem a uma profundidade de penetração do campo eletromagnético evanescente de cerca de 140 nanômetros, 69 graus, correspondendo a uma profundidade de penetração de 75 nanômetros, e 73 graus, correspondendo a uma profundidade de penetração de 60 nanômetros, com penetração decrescente. A fluorescência diminui em intensidade e origina-se de locais mais superficiais das células, como contatos focais nas suas bordas. As distâncias entre célula e substrato são representadas no Painel D por um código de cores que varia de zero a 600 nanômetros, conforme visto aqui.

As distâncias entre a célula e o substrato variam bastante ao longo das células, de apenas alguns nanômetros, representados por cores brancas a amarelas, a 250-300 nanômetros, representados por vermelho escuro. Isso indica que os contatos focais e as maiores distâncias entre a célula e o substrato estão em proximidade imediata. Uma variação semelhante nas distâncias entre a célula e o substrato é calculada para células de glioblastoma U251MG com o gene supressor de tumor P10 ativado.

Em contraste, as distâncias entre células e substrato são bastante constantes para as células controle U2 51 mg, representadas em amarelo, e para as células selvagens, representadas do laranja ao vermelho, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de topologia célula-substrato explorarem células tumorais e as alterações morfológicas após terapia a laser. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar superfícies com uma resolução real na faixa de nanômetros com baixa exposição à luz, o que é bem tolerável para organismos vivos.