Name: Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a medir a topologia de adesão celular com precisão nanométrica usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total de ângulo variável (VA-TIRFM). Este método permite comparar linhagens celulares.

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Os autores agradecem o Land Baden-Württemberg e da Europäische União Europäischer Fonds für die Entwicklung regionale - para financiamento ZAFH-PHOTON n, o Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para financiamento da investigação concessão não. 1792C08 bem como a GmbH Baden-Württemberg-Stiftung para o financiamento do projeto &quot;Aurami&quot;.

1. Sementeira e incubação de células <ol><li> Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm 2 sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) aplicado durante 60 minutos a uma concentração de 8 mM (em meio de cultura) 4, ou um marcador de citoplasma, por exemplo, calceína acetomethlyester aplicado durante 40 minutos a uma concentração de 5 uM 3, ou de uma membrana associada fotossensibilizador, por exemplo, protoporfirina IX induzida após 4 horas de incubação com o seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, 1 mM), 4,5. </li><li> Lavar as células com meio de cultura ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da microscopia de fluorescência. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Usar um microscópio vertical, por exemplo, Zeiss Axioplan, e substituir o condensador por um dispositivo de iluminação, tal como descrito na ref. 3 com um hemi-esférica ou de um prisma de vidro cilíndrico hemi-opticamente acoplado à corrediça objecto (ver Figura 1). </li><li> Usar um feixe laser colimado paralelo que após imagiologia pelo prisma de vidro e outros componentes ópticos (por exemplo, espelho côncavo) novamente resulta num feixe paralelo à superfície da amostra (raio da pupila telecêntrica). Tomar cuidado para que o vector de campo eléctrico é perpendicular polarizada ao plano de incidência. </li><li> Use um espelho ajustável localizado no interior do condensador que é imaginada no plano da amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidência (ray objeto). O espelho ajustável pode ser accionado por um motor de passo, em que cada posição corresponde a um ângulo de incidência bem definida, tal como determinado por medições goniométricas 3 </sup&gt;. </li><li> Calibrar a posição angular do espelho ajustável usando o ângulo crítico Θ c = 61,3 ° para uma transição de vidro-água como um valor fixo. Θ c podem ser visualizados mediante variação do Θ quando um corante fluorescente (por exemplo, 1 mM de mononucleótido de flavina, FMN) é dissolvido em água. A posição do espelho em Θ Θ = c é armazenado no programa de posicionamento do espelho. </li><li> Definir os parâmetros da câmera (iluminação traseira Andor ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Reino Unido 6), incluindo temperatura, tempo de gravação, ganho e velocidade de deslocamento. </li><li> Use uma lente objectiva de ampliação apropriado e preferencialmente moderado abertura numérica (por exemplo, 40 × / 0,75 ou 63 × / 0,90 imersão em água) e localizar o slide objecto no microscópio. Usar óleo de imersão para assegurar um contato óptica da amostra com o prisma de vidro. Gravar imagens de fluorescência das amostras idênticas mediante variação doângulo de iluminação (Θ ≥ Θ Θ c com c correspondendo a 64,5 ° de um interface de célula de vidro). Uma variação angular de 66 ° -74 ° com passos de 0,5 ° ou 1 ° é recomendada. Use um passe longo ou apropriado filtro passa banda para a detecção de fluorescência. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Ler as imagens (por exemplo, em formato ASCII) gravadas em vários ângulos Θ, bem como as configurações da câmara (para a discriminação de fundo), o comprimento de onda de excitação e os índices de refracção do vidro (n 1 = 1,52) e células (n 2 = 1,37) para o programa de avaliação (LabView; NanoCell). Para cada conjunto de parâmetros a profundidade de penetração d (Θ) e de transmissão factor T (Θ) são calculados automaticamente. </li><li> Selecione as imagens utilizadas para avaliação de célula-substrato distâncias Δ acordo com a Equação 5 (marcador de membrana) ou Equação 4 (marcador de citoplasma), as imagens individuais com heterogêneailuminação (e revelador, g. riscas) podem ser excluídos. </li><li> Calcule imagens de células-substrato topologia e seleccionar um código de cor apropriada para exibição. Durante perfis de avaliação dos pixels individuais podem ser apresentados, como descrito na Figura 2. Estes perfis podem ser usados ​​como um indicador da qualidade do ajuste. </li><li> Armazenar o protocolo de avaliação. </li></ol> 4. Resultados representativos Experiências representativas são realizadas com células geneticamente modificadas U251-MG glioblastoma, gentilmente cedidos pelo Prof Janeiro Mollenhauer, Departamento de Oncologia Molecular, Universidade do Sul da Dinamarca, Odense. Em dois subclones destas células U251 os genes supressores de tumor TP53 ou PTEN estão sobre-expressa utilizando um sistema de Tet-On expressão indutível, de tal modo que as mesmas exibem um potencial tumorigénico reduzida e pode ser considerado como menos maligna. Altamente malignas U251-MG células sem gene supressor são utilizadas como controlos, e U251-Células do tipo MG silvestres servem para uma posterior comparação. Um díodo laser emitindo uma série de impulsos quase contínua picossegundos (LDH400 com condutor PDL 800-B, Picoquant, Berlim, Alemanha; comprimento de onda: 391 nm; pulso de energia: 12 pJ; taxa de repetição: 40 MHz) é usado como uma fonte de excitação. Na Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de tumor TP53 activado e incubado com laurdan (8 uM; 60 min) são representadas por ângulos de incidência de 66,0 °, 69,0 ° e 73,0 ° correspondendo a profundidade de penetração do campo electromagnético evanescente de cerca de 140 nm, 75 nm e 60 nm, respectivamente. Com a diminuição da profundidade de penetração de fluorescência diminui de intensidade (ver tabelas), e origina a partir de locais mais superficiais do que as células (por exemplo, os contactos focais nas suas extremidades). Célula-substrato distâncias (visualizado na Figura 3d por um código de cores que varia de 0-600 nm) variam fortemente sobre as células entre emly alguns nanômetros (branco-amarelo) e 250-300 nm (vermelho escuro), ou seja, contatos focais e maiores de células-substrato distâncias são muito próximos. O mesmo é válido para U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de PTEN activado (Figura 4d), ​​enquanto célula-substrato distâncias são mais ou menos constante para U251-MG e controle de células de tipo selvagem, com os valores típicos de 80-100 nm (amarelo; Figura 4b ) e 150-200 nm (laranja-vermelho; Figura 4a). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Figura 1. Dispositivo de iluminação para VA-TIRFM em um microscópio vertical. Um espelho ajustável accionado por um motor passo permite uma resolução angular de ± 0,25 °. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Figura perfil Avaliação 2. Por um pixel (esquemática). Quando ln [I F / T (Θ)] é representada como uma função de 1 / d (Θ), o declive representa a célula-substrato distância Δ. Esta inclinação é normalmente determinada com uma precisão de cerca de ± 10%. Um valor - resultante de iluminação não homogênea - tem sido marcada e excluídas da avaliação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG com células de glioblastoma activado gene supressor TP53 após incubação com laurdan (8 uM; 60 min). Gravada em vários ângulos de iluminação (ac); célula-substrato distâncias na gama de 0-600 nm mostrado por um código de cores (d); comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Figura 4 Células-substrato distâncias de U251-MG glioblatoma células na gama de 0-600 nm mostrados por um código de cores,. (A) de tipo selvagem (b) Controlos, (c) células activadas com gene supressor TP53, (d) células com PTEN gene supressor ativado; comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada 7 ou em 8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia 11 são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante elevada de 50,100 W / cm ...

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n 1 encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n 2 &lt;n 1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corresponde à intensidade do campo electromagnético e d (Θ) para a profundidade de penetração no comprimento de onda λ, como dada pela d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 2 Θ pecado - n 2 2) -1 / 2 Conforme relatado na literatura 1,2, I 0 </sub&gt; corresponde à intensidade da luz incidente I e multiplicada com o factor de transmissão T (Θ) e a relação de n 2 / n 1. Se o vector do campo eléctrico do feixe de luz é perpendicular ao plano de polarização da incidência (isto é, o plano gerado pelo incidente e do feixe reflectido), este factor de transmissão é dada pela T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Para a intensidade de fluorescência detectada no TIRFM medições, a absorção de luz tem de ser integrado ao longo de todas as camadas da amostra e multiplicado com o rendimento quântico de fluorescência do corante η relevantes, bem como com o ângulo sólido de detecção Ω. Como relatado anteriormente 3, esta intensidade pode ser descrita pela Eu F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz se todos os fatores que são f independente<html> rom o ângulo de incidência e do Θ z coordenadas estão incluídos dentro da Equação A. experimental constante 3 pode ser resolvido analiticamente, se a concentração c (z) de fluoróforos é considerado para ser quase constante - Quer no todo z ≥ Δ coordenadas, por exemplo, dentro do citoplasma das células com uma distância Δ partir da interface. Neste caso, a integral tem de ser calculada a partir de z = Δ para z = ∞ resultando Eu F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Ou entre z = Δ - t / 2 e z = Δ + t / 2, ou seja, dentro de uma fina camada de espessura t, por exemplo, uma membrana celular, localizado a uma distância a partir da interface Δ. Neste caso, a intensidade de fluorescência pode ser calculado como Eu F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), se t é pequeno em comparação com Δ. &gt; ent &quot;A partir das Equações (4) e (5) da célula-substrato distâncias Δ pode ser calculado, se as imagens de intensidade de fluorescência, F I são registados por ângulos variáveis ​​Θ, e se ln (I F / T d) (Eq. 4) ou ln (I F / T) (Eq. 5) é avaliada como uma função de 1 / d para esses ângulos. Para a membrana laurdan marcador utilizado no presente documento (s. abaixo), a avaliação foi realizada de acordo com a Equação 5.. Como relatado anteriormente 3 de aquisição de imagem, e requer a avaliação - Distribuição homogênea da luz de excitação sobre a amostra, - A validade de um modelo de 2-camadas (com os índices de refracção n 1 e n 2 para o substrato e do citoplasma, respectivamente). Isto aplica-se a membrana do plasma é muito fina e, se a camada do meio extracelular (entre a célula e o substrato) é pequeno em comparação com o comprimento de onda da luz incidente. Além disso, a abertura de uma moderada numérica(Tipicamente 0,90 ≤ A) da lente da objectiva do microscópio é vantajosa para evitar desvios de brilho devido a anisotropia da radiação no domínio próximo da interface dielétrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Tipo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Fluxo laminar </td><td> Holten Seguro </td><td> S2010 1,2 PT GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Meio de cultura </td></tr><tr><td> Objeto lâminas de vidro </td><td> Marienfeld </td><td> Vidro branco puro </td><td> Procedimento de limpeza especial usado </td></tr><tr><td> 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcador fluorescente (solução de armazém: 2 mM em etanol) </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diodo laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 com motorista PDL 800-B </td><td> Comprimento de onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Sistema de fibra monomodo </td><td> Fonte ponto </td><td> kineFlex </td><td> Usado com óptica de colimação </td></tr><tr><td> Câmera EMCCD </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Câmera traseira iluminada </td></tr></tbody></table>

nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável microscopia de fluorescência reflexão interna total (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

A topologia de superfície, por exemplo, de células crescendo em um substrato, é determinada com precisão nanométrica por Fluorescência de Reflexão Interna Total de Ângulo Variável...

O objetivo geral deste procedimento é medir uma topologia de adesão celular em um substrato com precisão de nanômetro. Isso é conseguido primeiramente cultivando células em lâminas de vidro transparentes e incubando-as com um marcador fluorescente. Em seguida, a posição angular do espelho ajustável do microscópio é calibrada e a posição é armazenada no programa de posicionamento do espelho.O próximo passo é registrar as imagens de fluorescência mediante irradiação em aproximadamente 10 ângulos diferentes. O passo final é calcular as distâncias entre a célula e o substrato com uma precisão de alguns nanômetros. Por fim, os resultados da topologia da adesão celular ao substrato são utilizados para demonstrar diferenças na adesão entre diferentes linhagens celulares, por exemplo, células cancerígenas e células menos malignas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a resolução real está na faixa de apenas alguns nanômetros. Embora este método possa fornecer informações sobre membranas celulares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como vesículas pequenas ou nanomateriais.Quem demonstrará o experimento será nossa pós-doutoranda Petra, que preparará as amostras celulares, e nosso engenheiro, Michael Wagner, que realizará o experimento. Para preparar as células para microscopia de fluorescência por reflexão interna total em ângulo variável, semeie células individuais em uma densidade de 100 células por milímetro quadrado em uma lâmina de vidro, em meio de cultura suplementado com 10% de soro de bezerro fetal e antibióticos. Incube as células por 72 horas em estufa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, aplique às células o marcador fluorescente de membrana seis D, decano dois, dimetilamino naftaleno ou lorano numa concentração de oito micromolar no meio de cultura, e incube por 60 minutos antes da microscopia de fluorescência. Lave as células com PBS, pipetando a solução tampão sobre a lâmina de objeto para remover o meio; depois, remova a solução tampão do lado posterior da lâmina de objeto. Utiliza-se um microscópio ereto, como o Zeiss Axio plan, equipado com uma câmera E-M-C-C-D com iluminação traseira e/ou exon, para ângulo variável.O T-I-R-F-M substitui seu condensador por um dispositivo de iluminação personalizado com um prisma de vidro hemi-cilíndrico acoplado opticamente ao lâmina do objeto. O feixe de laser incide a partir de uma fibra monocromática colimada, que, após a formação da imagem pelo prisma de vidro e outros componentes ópticos, resulta novamente em um feixe paralelo na superfície da amostra. Tenha cuidado para que o vetor do campo elétrico esteja polarizado perpendicularmente ao plano de incidência.Essa posição é marcada no acoplador de saída da fibra. Utilize um espelho ajustável localizado dentro do condensador, que é projetado no plano da amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidência ou raio do objeto. O espelho ajustável pode ser acionado por um motor de passo, que é controlado por software.Cada posição corresponde a um ângulo de incidência bem definido, determinado por medições geométricas. Para calibrar a posição angular do espelho ajustável, utilize um corante fluorescente, como o nucleotídeo de flavina a um milimolar, dissolvido em água. Para visualizar o ângulo crítico mediante a variação do ângulo de incidência, utilize o ângulo crítico de 61,3 graus para uma transição vidro-água como valor fixo; a posição angular do espelho na qual o ângulo de incidência é igual ao ângulo crítico é armazenada no programa de posicionamento do espelho.Utilizando o software da câmera, defina os parâmetros da câmera E-M-C-C-D, incluindo ganho de temperatura, tempo de gravação e velocidade de deslocamento. Use óleo de imersão para garantir o contato óptico da amostra. Com um prisma de vidro, selecione uma lente objetiva com ampliação apropriada para as células e abertura numérica moderada.Para visualizar o objeto no microscópio, utilize um filtro de passagem longa ou de passagem de banda apropriado para a detecção de fluorescência. Registre imagens de fluorescência de amostras idênticas mediante variação do ângulo de iluminação. Os ângulos de incidência devem ser iguais ou maiores que o ângulo crítico.Com o ângulo crítico correspondente a 64,5 graus para uma interface célula-vídeo, recomenda-se uma faixa angular de 66 a 74 graus com incrementos de 0,5 ou um grau. Para iniciar a análise dos dados, utilize o programa LabVIEW para ler as imagens registradas em diversos ângulos, bem como as configurações da câmera, o comprimento de onda de excitação e os índices de refração. Para o vidro, cujo valor é 1,52, e para as células, cujo valor é 1,37, as configurações são importadas para a avaliação adequada dos dados.Para cada conjunto de parâmetros, a profundidade de penetração e o fator de transmissão são calculados automaticamente para o sucesso do procedimento. É importante que as imagens sejam cuidadosamente registradas e selecionadas para análise. Selecione as imagens utilizadas para a avaliação das distâncias entre células e substrato de acordo com a equação.Para um marcador de membrana, imagens individuais com iluminação homogênea, como mostrado neste exemplo, podem ser excluídas. Calcule imagens da topologia do substrato celular e selecione um código de cores apropriado para exibição durante a avaliação. Perfis de pixels individuais podem ser exibidos conforme ilustrado nesta figura.Esses perfis podem ser usados como um indicador da qualidade do ajuste. Por fim, armazene o protocolo de avaliação. Esta figura mostra imagens de reflexão interna total de células de glioblastoma U2 51 mg com o gene supressor de tumor TP 53 ativado.Após a incubação com luan registrada em vários ângulos de incidência, 66 graus correspondem a uma profundidade de penetração do campo eletromagnético evanescente de cerca de 140 nanômetros, 69 graus, correspondendo a uma profundidade de penetração de 75 nanômetros, e 73 graus, correspondendo a uma profundidade de penetração de 60 nanômetros, com penetração decrescente. A fluorescência diminui em intensidade e origina-se de locais mais superficiais das células, como contatos focais nas suas bordas. As distâncias entre célula e substrato são representadas no Painel D por um código de cores que varia de zero a 600 nanômetros, conforme visto aqui.As distâncias entre a célula e o substrato variam bastante ao longo das células, de apenas alguns nanômetros, representados por cores brancas a amarelas, a 250-300 nanômetros, representados por vermelho escuro. Isso indica que os contatos focais e as maiores distâncias entre a célula e o substrato estão em proximidade imediata. Uma variação semelhante nas distâncias entre a célula e o substrato é calculada para células de glioblastoma U251MG com o gene supressor de tumor P10 ativado.Em contraste, as distâncias entre células e substrato são bastante constantes para as células controle U2 51 mg, representadas em amarelo, e para as células selvagens, representadas do laranja ao vermelho, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de topologia célula-substrato explorarem células tumorais e as alterações morfológicas após terapia a laser. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar superfícies com uma resolução real na faixa de nanômetros com baixa exposição à luz, o que é bem tolerável para organismos vivos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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