Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

O objetivo geral deste procedimento é medir uma topologia de adesão celular em um substrato com precisão nanométrica. Isso é feito primeiro cultivando células em lâminas de vidro transparentes e incubando-as com um marcador fluorescente. Em seguida, a posição angular do espelho ajustável do microscópio é calibrada e a posição é armazenada no programa de posicionamento do espelho.

O próximo passo é registrar as imagens de fluorescência após a irradiação em cerca de 10 ângulos diferentes. A etapa final é calcular as distâncias do substrato celular com uma precisão de alguns nanômetros. Em última análise, os resultados da topologia da adesão celular no substrato são usados para mostrar diferenças de adesão entre várias linhagens celulares, por exemplo, células cancerígenas e células menos malignas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a resolução real está na faixa de apenas alguns nanômetros. Embora este método possa fornecer informações sobre as membranas celulares. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como pequenas vesículas ou nanomateriais.

Demonstrando o experimento estará nossa pós-doutoranda Petra, que preparará as amostras de células e nosso engenheiro, Michael Wagner, que executará o experimento Para preparar células para ângulo variável, reflexão interna total. A microscopia de fluorescência semeia células individuais a uma densidade de 100 células por milímetro quadrado em uma lâmina de vidro em meio de cultura suplementada com 10% de bezerro fetal, soro e antibióticos. Cultive células por 72 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, aplique às células a membrana fluorescente, marcador seis D, decano dois, dimetil aminonaftaleno ou lorano na concentração de oito micromolares em cultura, meio incubar por 60 minutos antes da microscopia de fluorescência. Lave as células com PBS pipeta a solução tampão sobre a lâmina do objeto para remover o meio depois, limpe a solução tampão da parte de trás da lâmina do objeto. Um microscópio vertical, como um plano Zeiss Axio, equipado com uma câmera EMCDD retroiluminada e/ou exon é usado para ângulo variável.

T-I-R-F-M substitua seu condensador por um dispositivo de iluminação feito sob medida por um prisma de vidro hemicilíndrico acoplado opticamente à corrediça do objeto. O feixe de laser é incidente de uma fibra monomodo agrupada, que após a imagem do prisma de vidro e outros componentes ópticos, novamente resulta em um feixe paralelo na superfície da amostra. Tome cuidado para que o vetor do campo elétrico seja polarizado, perpendicular ao plano dos incidentes.

Esta posição está marcada no acoplador de saída da fibra. Use um espelho ajustável localizado dentro do condensador, que é fotografado no plano de amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidentes ou raio de objeto. O espelho ajustável pode ser acionado por um motor de passo, que é controlado por software.

Cada posição corresponde a um ângulo bem definido de incidentes, conforme determinado pelas medições realizadas pela métrica go. Para calibrar a posição angular do espelho ajustável, use um corante fluorescente, como um nucleotídeo de flavina milimolar, dissolvido em água. Para visualizar o ângulo crítico após a variação do ângulo de incidentes, use o ângulo crítico de 61,3 graus para uma transição de água vítrea como um valor fixo, a posição angular do espelho na qual o ângulo de incidentes é igual ao ângulo crítico é armazenado no programa de posicionamento do espelho.

Usando o software da câmera, defina os parâmetros da câmera EMCD, incluindo ganho de temperatura, tempo de gravação e velocidade de mudança. Use óleo de imersão para garantir o contato óptico da amostra. Com um prisma de vidro, selecione uma lente objetiva de ampliação apropriada para as células e abertura numérica moderada.

Para visualizar o objeto no microscópio, use um filtro passa-longo ou passa-banda apropriado para detecção de fluorescência. Registre imagens de fluorescência de amostras idênticas após a variação do ângulo de iluminação. Os ângulos dos incidentes devem ser iguais ou maiores que o ângulo crítico.

Com o ângulo crítico correspondente a 64,5 graus para uma interface de vidro celular, recomenda-se uma faixa angular de 66 graus a 74 graus com passos de 0,5 graus ou um grau. Para iniciar a análise de dados, use o programa de visualização de laboratório para ler as imagens gravadas em vários ângulos, bem como as configurações da câmera, o comprimento de onda de excitação e os índices de refração. Para vidro, que é 1,52, e células, que é 1,37, as configurações são importadas para avaliação adequada dos dados.

Para cada conjunto de parâmetros, a profundidade de penetração e o fator de transmissão são calculados automaticamente para o sucesso do procedimento. É importante que as imagens sejam cuidadosamente gravadas e selecionadas para análise. Selecione as imagens usadas para avaliação das distâncias do substrato celular de acordo com a equação.

Para um marcador de membrana, imagens individuais dentro de iluminação homogênea, como mostrado neste exemplo, podem ser excluídas. Calcule as imagens da topologia do substrato da célula e selecione um código de cores apropriado para exibição durante a avaliação. Perfis de pixels individuais podem ser exibidos conforme ilustrado nesta figura.

Esses perfis podem ser usados como um indicador da qualidade do ajuste. Por fim, armazene o protocolo de avaliação. Esta figura mostra imagens de reflexão interna total de células de glioblastoma U2 51 mg com um gene supressor de tumor TP 53 ativado.

Após a incubação com luan registrado em vários ângulos de incidentes, 66 graus correspondendo a uma profundidade de penetração do campo eletromagnético evanescente de cerca de 140 nanômetros, 69 graus, correspondendo a uma profundidade de penetração de 75 nanômetros e 73 graus correspondendo a uma profundidade de penetração de 60 nanômetros com penetração decrescente. A fluorescência de profundidade diminui de intensidade e se origina de locais mais superficiais das células, como contatos focais em suas bordas. As distâncias do substrato celular são representadas no Painel D por um código de cores que varia de zero a 600 nanômetros, como visto aqui.

As distâncias do substrato celular variam muito entre as células entre apenas alguns nanômetros representados por branco a amarelo e 250 a 300 nanômetros representados por vermelho escuro. Isso indica que contatos focais e distâncias maiores do substrato celular estão próximos. Uma variação semelhante nas distâncias do substrato celular é calculada para células de glioblastoma U2 51 mg com um gene supressor de tumor ativado P 10.

Em contraste, as distâncias do substrato celular são bastante constantes para células de controle U2 51 mg representadas por células amarelas e selvagens representadas por laranja a vermelho após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da topologia do substrato celular explorarem as células tumorais e as mudanças morfológicas na terapia a laser. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar superfícies com uma resolução real na faixa nanométrica com baixa exposição à luz, o que é bem tolerável para organismos vivos.