Name: Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a medir a topologia de adesão celular com precisão nanométrica usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total de ângulo variável (VA-TIRFM). Este método permite comparar linhagens celulares.

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Os autores agradecem o Land Baden-Württemberg e da Europäische União Europäischer Fonds für die Entwicklung regionale - para financiamento ZAFH-PHOTON n, o Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para financiamento da investigação concessão não. 1792C08 bem como a GmbH Baden-Württemberg-Stiftung para o financiamento do projeto &quot;Aurami&quot;.

1. Sementeira e incubação de células <ol><li> Semente de células individuais, por exemplo, U373-MG ou células U-251 MG-glioblastoma a uma densidade típica de 100 células / mm 2 sobre uma lâmina de vidro e crescê-los para 4872 horas em meio de cultura (por exemplo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e antibióticos), utilizando uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Incubar as células com um marcador de membrana, por exemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) aplicado durante 60 minutos a uma concentração de 8 mM (em meio de cultura) 4, ou um marcador de citoplasma, por exemplo, calceína acetomethlyester aplicado durante 40 minutos a uma concentração de 5 uM 3, ou de uma membrana associada fotossensibilizador, por exemplo, protoporfirina IX induzida após 4 horas de incubação com o seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, 1 mM), 4,5. </li><li> Lavar as células com meio de cultura ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da microscopia de fluorescência. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Usar um microscópio vertical, por exemplo, Zeiss Axioplan, e substituir o condensador por um dispositivo de iluminação, tal como descrito na ref. 3 com um hemi-esférica ou de um prisma de vidro cilíndrico hemi-opticamente acoplado à corrediça objecto (ver Figura 1). </li><li> Usar um feixe laser colimado paralelo que após imagiologia pelo prisma de vidro e outros componentes ópticos (por exemplo, espelho côncavo) novamente resulta num feixe paralelo à superfície da amostra (raio da pupila telecêntrica). Tomar cuidado para que o vector de campo eléctrico é perpendicular polarizada ao plano de incidência. </li><li> Use um espelho ajustável localizado no interior do condensador que é imaginada no plano da amostra e ilumina a amostra sob um ângulo variável de incidência (ray objeto). O espelho ajustável pode ser accionado por um motor de passo, em que cada posição corresponde a um ângulo de incidência bem definida, tal como determinado por medições goniométricas 3 </sup&gt;. </li><li> Calibrar a posição angular do espelho ajustável usando o ângulo crítico Θ c = 61,3 ° para uma transição de vidro-água como um valor fixo. Θ c podem ser visualizados mediante variação do Θ quando um corante fluorescente (por exemplo, 1 mM de mononucleótido de flavina, FMN) é dissolvido em água. A posição do espelho em Θ Θ = c é armazenado no programa de posicionamento do espelho. </li><li> Definir os parâmetros da câmera (iluminação traseira Andor ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Reino Unido 6), incluindo temperatura, tempo de gravação, ganho e velocidade de deslocamento. </li><li> Use uma lente objectiva de ampliação apropriado e preferencialmente moderado abertura numérica (por exemplo, 40 × / 0,75 ou 63 × / 0,90 imersão em água) e localizar o slide objecto no microscópio. Usar óleo de imersão para assegurar um contato óptica da amostra com o prisma de vidro. Gravar imagens de fluorescência das amostras idênticas mediante variação doângulo de iluminação (Θ ≥ Θ Θ c com c correspondendo a 64,5 ° de um interface de célula de vidro). Uma variação angular de 66 ° -74 ° com passos de 0,5 ° ou 1 ° é recomendada. Use um passe longo ou apropriado filtro passa banda para a detecção de fluorescência. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Ler as imagens (por exemplo, em formato ASCII) gravadas em vários ângulos Θ, bem como as configurações da câmara (para a discriminação de fundo), o comprimento de onda de excitação e os índices de refracção do vidro (n 1 = 1,52) e células (n 2 = 1,37) para o programa de avaliação (LabView; NanoCell). Para cada conjunto de parâmetros a profundidade de penetração d (Θ) e de transmissão factor T (Θ) são calculados automaticamente. </li><li> Selecione as imagens utilizadas para avaliação de célula-substrato distâncias Δ acordo com a Equação 5 (marcador de membrana) ou Equação 4 (marcador de citoplasma), as imagens individuais com heterogêneailuminação (e revelador, g. riscas) podem ser excluídos. </li><li> Calcule imagens de células-substrato topologia e seleccionar um código de cor apropriada para exibição. Durante perfis de avaliação dos pixels individuais podem ser apresentados, como descrito na Figura 2. Estes perfis podem ser usados ​​como um indicador da qualidade do ajuste. </li><li> Armazenar o protocolo de avaliação. </li></ol> 4. Resultados representativos Experiências representativas são realizadas com células geneticamente modificadas U251-MG glioblastoma, gentilmente cedidos pelo Prof Janeiro Mollenhauer, Departamento de Oncologia Molecular, Universidade do Sul da Dinamarca, Odense. Em dois subclones destas células U251 os genes supressores de tumor TP53 ou PTEN estão sobre-expressa utilizando um sistema de Tet-On expressão indutível, de tal modo que as mesmas exibem um potencial tumorigénico reduzida e pode ser considerado como menos maligna. Altamente malignas U251-MG células sem gene supressor são utilizadas como controlos, e U251-Células do tipo MG silvestres servem para uma posterior comparação. Um díodo laser emitindo uma série de impulsos quase contínua picossegundos (LDH400 com condutor PDL 800-B, Picoquant, Berlim, Alemanha; comprimento de onda: 391 nm; pulso de energia: 12 pJ; taxa de repetição: 40 MHz) é usado como uma fonte de excitação. Na Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de tumor TP53 activado e incubado com laurdan (8 uM; 60 min) são representadas por ângulos de incidência de 66,0 °, 69,0 ° e 73,0 ° correspondendo a profundidade de penetração do campo electromagnético evanescente de cerca de 140 nm, 75 nm e 60 nm, respectivamente. Com a diminuição da profundidade de penetração de fluorescência diminui de intensidade (ver tabelas), e origina a partir de locais mais superficiais do que as células (por exemplo, os contactos focais nas suas extremidades). Célula-substrato distâncias (visualizado na Figura 3d por um código de cores que varia de 0-600 nm) variam fortemente sobre as células entre emly alguns nanômetros (branco-amarelo) e 250-300 nm (vermelho escuro), ou seja, contatos focais e maiores de células-substrato distâncias são muito próximos. O mesmo é válido para U251-MG células de glioblastoma com um gene supressor de PTEN activado (Figura 4d), ​​enquanto célula-substrato distâncias são mais ou menos constante para U251-MG e controle de células de tipo selvagem, com os valores típicos de 80-100 nm (amarelo; Figura 4b ) e 150-200 nm (laranja-vermelho; Figura 4a). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Figura 1. Dispositivo de iluminação para VA-TIRFM em um microscópio vertical. Um espelho ajustável accionado por um motor passo permite uma resolução angular de ± 0,25 °. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Figura perfil Avaliação 2. Por um pixel (esquemática). Quando ln [I F / T (Θ)] é representada como uma função de 1 / d (Θ), o declive representa a célula-substrato distância Δ. Esta inclinação é normalmente determinada com uma precisão de cerca de ± 10%. Um valor - resultante de iluminação não homogênea - tem sido marcada e excluídas da avaliação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Figura 3 imagens TIRFM de U251-MG com células de glioblastoma activado gene supressor TP53 após incubação com laurdan (8 uM; 60 min). Gravada em vários ângulos de iluminação (ac); célula-substrato distâncias na gama de 0-600 nm mostrado por um código de cores (d); comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Figura 4 Células-substrato distâncias de U251-MG glioblatoma células na gama de 0-600 nm mostrados por um código de cores,. (A) de tipo selvagem (b) Controlos, (c) células activadas com gene supressor TP53, (d) células com PTEN gene supressor ativado; comprimento de onda de excitação: 391 nm, detecção: ≥ 420 nm; tamanho da imagem: 210. mM mM × 210 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

É descrito um método para a medição de célula-substrato distâncias com uma precisão nanométrica. Presentemente, os métodos de resolução super-microscopia, por exemplo, com base na iluminação estruturada 7 ou em 8-10 de detecção de moléculas isoladas, assim como depleção emissão estimulada (STED) Microscopia 11 são de considerável interesse. Nenhuma destas técnicas, contudo, permite uma resolução axial inferior a 50 nm. Além disso, a irradiância bastante elevada de 50,100 W / cm ...

Quando um feixe de luz que se propaga através de um meio de índice de refracção n 1 encontra uma interface para um segundo meio de índice de refracção n 2 &lt;n 1, a reflexão interna total ocorre em todos os ângulos de incidência Θ, que são maiores do que o ângulo crítico Θ c = arcsin (n 2 / n 1). Apesar de ter sido totalmente reflectido do feixe de luz incidente evoca um campo electromagnético evanescente que penetra no segundo meio e decai exponencialmente com a distância perpendicular a partir da interface de z de acordo com a I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corresponde à intensidade do campo electromagnético e d (Θ) para a profundidade de penetração no comprimento de onda λ, como dada pela d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 2 Θ pecado - n 2 2) -1 / 2 Conforme relatado na literatura 1,2, I 0 </sub&gt; corresponde à intensidade da luz incidente I e multiplicada com o factor de transmissão T (Θ) e a relação de n 2 / n 1. Se o vector do campo eléctrico do feixe de luz é perpendicular ao plano de polarização da incidência (isto é, o plano gerado pelo incidente e do feixe reflectido), este factor de transmissão é dada pela T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Para a intensidade de fluorescência detectada no TIRFM medições, a absorção de luz tem de ser integrado ao longo de todas as camadas da amostra e multiplicado com o rendimento quântico de fluorescência do corante η relevantes, bem como com o ângulo sólido de detecção Ω. Como relatado anteriormente 3, esta intensidade pode ser descrita pela Eu F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz se todos os fatores que são f independente<html> rom o ângulo de incidência e do Θ z coordenadas estão incluídos dentro da Equação A. experimental constante 3 pode ser resolvido analiticamente, se a concentração c (z) de fluoróforos é considerado para ser quase constante - Quer no todo z ≥ Δ coordenadas, por exemplo, dentro do citoplasma das células com uma distância Δ partir da interface. Neste caso, a integral tem de ser calculada a partir de z = Δ para z = ∞ resultando Eu F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - Ou entre z = Δ - t / 2 e z = Δ + t / 2, ou seja, dentro de uma fina camada de espessura t, por exemplo, uma membrana celular, localizado a uma distância a partir da interface Δ. Neste caso, a intensidade de fluorescência pode ser calculado como Eu F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), se t é pequeno em comparação com Δ. &gt; ent &quot;A partir das Equações (4) e (5) da célula-substrato distâncias Δ pode ser calculado, se as imagens de intensidade de fluorescência, F I são registados por ângulos variáveis ​​Θ, e se ln (I F / T d) (Eq. 4) ou ln (I F / T) (Eq. 5) é avaliada como uma função de 1 / d para esses ângulos. Para a membrana laurdan marcador utilizado no presente documento (s. abaixo), a avaliação foi realizada de acordo com a Equação 5.. Como relatado anteriormente 3 de aquisição de imagem, e requer a avaliação - Distribuição homogênea da luz de excitação sobre a amostra, - A validade de um modelo de 2-camadas (com os índices de refracção n 1 e n 2 para o substrato e do citoplasma, respectivamente). Isto aplica-se a membrana do plasma é muito fina e, se a camada do meio extracelular (entre a célula e o substrato) é pequeno em comparação com o comprimento de onda da luz incidente. Além disso, a abertura de uma moderada numérica(Tipicamente 0,90 ≤ A) da lente da objectiva do microscópio é vantajosa para evitar desvios de brilho devido a anisotropia da radiação no domínio próximo da interface dielétrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Tipo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Fluxo laminar </td><td> Holten Seguro </td><td> S2010 1,2 PT GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Meio de cultura </td></tr><tr><td> Objeto lâminas de vidro </td><td> Marienfeld </td><td> Vidro branco puro </td><td> Procedimento de limpeza especial usado </td></tr><tr><td> 6-dodecanoil-2-dimetilamino-naftaleno (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcador fluorescente (solução de armazém: 2 mM em etanol) </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diodo laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 com motorista PDL 800-B </td><td> Comprimento de onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Sistema de fibra monomodo </td><td> Fonte ponto </td><td> kineFlex </td><td> Usado com óptica de colimação </td></tr><tr><td> Câmera EMCCD </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Câmera traseira iluminada </td></tr></tbody></table>

nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável microscopia de fluorescência reflexão interna total (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Topologia de superfície, por exemplo, que as células crescem sobre um substrato, é determinada com uma precisão nanométrica por Variable Angle-Fluorescence Microscopy Internal Reflection total (TIRFM-VA). As células são cultivadas em lâminas transparentes e incubaram-se com um marcador fluorescente homogeneamente distribuídos na sua membrana plasmática. Iluminação ocorre por um feixe de laser paralelo sob um ângulo variável de reflexão interna total (TIR), com diferentes profundidades de penetração do campo electromagnético evanescente. A gravação de imagens de fluorescência após irradiação a cerca de 10 diferentes ângulos permite calcular distâncias célula-substrato, com uma precisão de alguns nanómetros. As diferenças de adesão entre as linhas de células diferentes, por exemplo, células cancerosas e células malignas, menos são assim determinados. Além disso, as variações possíveis de adesão das células mediante tratamento químico ou fotodinâmica pode ser examinado. Em comparação com outros métodos de super-resolução de exposição de microscopia de luz é mantidadanos muito pequena, e não de células vivas é de esperar a ocorrência.

Topologia de adesão celular num substrato é medida com uma precisão nanométrica de ângulo variável por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM-VA).

Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

A topologia de superfície, por exemplo, de células crescendo em um substrato, é determinada com precisão nanométrica por Fluorescência de Reflexão Interna Total de Ângulo Variável...

O objetivo geral deste procedimento é medir uma topologia de adesão celular em um substrato com precisão de nanômetro. Isso é conseguido primeiramente cultivando células em lâminas de vidro transparentes e incubando-as com um marcador fluorescente. Em seguida, a posição angular do espelho ajustável do microscópio é calibrada e a posição é armazenada no programa de posicionamento do espelho.O próximo passo é registrar as imagens de fluorescência mediante irradiação em aproximadamente 10 ângulos diferentes. O passo final é calcular as distâncias entre a célula e o substrato com uma precisão de alguns nanômetros. Por fim, os resultados da topologia da adesão celular ao substrato são utilizados para demonstrar diferenças na adesão entre diferentes linhagens celulares, por exemplo, células cancerígenas e células menos malignas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia confocal, é que a resolução real está na faixa de apenas alguns nanômetros. Embora este método possa fornecer informações sobre membranas celulares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como vesículas pequenas ou nanomateriais.Quem demonstrará o experimento será nossa

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

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Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Este protocolo é um guia para a implementação de microscopia de reflexão de interferência em um microscópio de fluorescência padrão para imagens sem rótulo, de alto contraste e alta velocidade de microtúbulos usando ensaios de superfícies in vitro.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&amp;B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

A litografia quase UV e a microscopia de força de tração são combinadas para medir forças celulares em hidrogéis micropatterados. A liberação induzida por luz direcionada de células únicas permite um alto número de medições na mesma amostra.

Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Aprenda a medir a topologia de adesão celular com precisão nanométrica usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total de ângulo variável (VA-TIRFM). Este método permite comparar linhagens celulares.

Nanotopology de adesão celular em cima de ângulo variável Microscopia de Fluorescência reflexão interna total (VA-TIRFM)

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