Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a expressão gênica usando máquinas nucleares funcionais extraídas de células. Isso é conseguido pela primeira colheita no inchaço das células hela. Em seguida, as células são entrelaçadas por incenso e, em seguida, centrifugadas para granular os núcleos na terceira etapa.

Os núcleos são extraídos, concentrados e dialisados com sal para obter máquinas de expressão gênica solúveis e funcionais. Em última análise, a funcionalidade dos extratos nucleares pode ser avaliada com base em suas atividades de transcrição e splicing, conforme avaliado com uma RNA polimerase acoplada ao sistema de transcrição e splicing. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a preparação de extrato de núcleo em massa, é que, com esta técnica, uma pequena quantidade de células pode ser usada para preparar o extrato de núcleo.

Comece plaqueando células hela em três placas de 150 milímetros com meio DMEM suplementado com FBS e antibióticos, cultive as culturas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de CO2 até que as células atinjam 90% de fluência de Co, neste ponto aspire o meio das culturas de células HELOC e lave-os uma vez com 13 mililitros de temperatura ambiente. PBS por placa e depois aspirar. O PBS fica cada placa de lado por alguns segundos e aspira o resto do PBS.

Em seguida, use um elevador de células para raspar as células até a borda inferior de cada placa e, em seguida, puxe as células em um tubo einor de 1,5 mililitro. Finalmente, jogue as células em uma microfuga por cinco minutos a cem vezes G e a quatro graus Celsius. Agora aspire o PBS do pellet celular e estime o volume de células compactadas ou PCV observando a gradação no tubo.

Em seguida, adicione o dobro do volume de tampão hipotônico do PCV ao pellet da célula. Agite o tubo suavemente para ressuspender. As células pipetam suavemente a suspensão celular para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 microlitros para desalojar aglomerados de células conforme necessário.

Em seguida, pulverize as células sob as mesmas condições de centrífuga de antes. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente a camada tampão hipotónica. As células terão começado a inchar e o volume celular terá aumentado para cerca de 750 a 1000 microlitros.

Adicione um novo tampão hipotônico a um volume final de 1,5 mililitros e ressuspenda as células no tampão. Outra vez. Finalmente, incube as células inchadas ressuspensas no gelo por 10 minutos enquanto as células estão esfriando. Enxágue um homogeneizador com tampão hipotônico e coloque-o no gelo junto com as células.

Em seguida, usando um limpador de tarefas delicadas, como um lenço Kim, seque o pilão. Use uma ponta de micropipeta estendida de 1000 microlitros para remover o tampão das penugem. Agora use a pipeta para transferir as células inchadas resfriadas para as penas para baixo.

É a parte mais complicada deste procedimento para uma verificação de sucesso de entrada. Após cada descida ao microscópio, Mova lentamente o pilão apertado das penas para cima e para baixo cinco vezes para piolhos nas células, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, transfira um Eloqua de cinco microlitros da suspensão de células de lys para um tubo einor e adicione 10 microlitros de azul trian e 15 microlitros de um XPBS.

Adicione a solução celular a uma lâmina e examine as células sob um microscópio óptico para lise, os núcleos das células lisis aparecerão azuis após três onças. Não há lise suficiente, pois numerosas células vivas são visíveis. Depois de cinco onças, há lise suficiente.

Finalmente, transfira as células de lys para o tubo einor pré-resfriado e gire a suspensão celular por cinco minutos em uma microfuga a 1500 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente o super natin para um novo tubo sem interromper o pellet. Agora, estime o volume nuclear do patch ou PNV observando a gradação no tubo.

Encha uma ponta de micropipeta com tampão de baixo teor de sal na metade do PNV. Em seguida, insira a ponta da micropipeta nos núcleos na parte inferior do tubo einor. Esguichando lentamente o tampão nos núcleos enquanto mistura suavemente.

Agite suavemente o tubo para se certificar de que o pellet está completamente ressuspenso. Em seguida, adicione um tampão com alto teor de sal na metade do PNV e misture rapidamente uma vez invertendo o tubo. Gire o tubo por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Finalmente, gire os núcleos na microfuga por 15 minutos a 18.000 vezes G e quatro graus Celsius. Comece transferindo 500 microlitros do sobrenadante para micro cons resfriados. Centrifugar o extracto nuclear com elevado teor de sal durante 15 minutos a 14 000 vezes G e quatro graus Celsius após centrifugação, inverter o mini racon e colocá-lo num novo tubo EOR individual.

Depois de girar por dois minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius, o extrato nuclear com alto teor de sal será concentrado em aproximadamente 115 microlitros. Agora transfira alíquotas de 45 microlitros do extrato nuclear com alto teor de sal para SLIs de minidiálise. Certifique-se de que a parte inferior do slide esteja com a parte inferior do flutuador.

Em seguida, coloque os SLIs em 500 mililitros de tampão de diálise resfriado. Finalmente, mexa as alíquotas por uma a duas horas a quatro graus Celsius, o extrato nuclear aparecerá turvo após a diálise. Esta figura mostra dados representativos comparando uma reação de transcrição e fatiamento de RNA polimerase dois acoplada em um extrato nuclear de pequena escala versus um extrato nuclear a granel.

Quando a construção A-C-M-V-D-N-A foi incubada nos extratos a granel ou em pequena escala, níveis semelhantes do pré-mRNA nascente foram sintetizados no ponto de tempo de cinco minutos após a adição de alfa e manina para bloquear a transcrição adicional, os intermediários de splicing e os produtos de emenda acumulados ao longo do tempo com cinética semelhante em ambos os tipos de extratos. Esses resultados representativos confirmam que as eficiências do sistema de transcrição e splicing da RNA polimerase dois acopladas são semelhantes nos extratos nucleares a granel e em pequena escala. Para demonstrar a utilidade do extrato em pequena escala, os extratos do método foram preparados a partir de células hela tratadas com o inibidor de splicing E 7 1 0 7 ou o composto de controle negativo Platy analy F e, em seguida, um ensaio de transcrição e splicing de RNA polimerase dois acoplado foi realizado conforme demonstrado nesta figura a transcrição por RNA polimerase dois ocorreu eficientemente em extratos preparados a partir do xadrez F e E 7 1 0 7 tratados Células.

Em contraste, o splicing ocorreu normalmente no extrato preparado a partir das células tratadas com F analisadas, mas foi abolido nas células tratadas com E 7 1 0 7. Esses dados fornecem prova de conceito para o uso de extratos nucleares em pequena escala para tratamento especial de células em pequena escala. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de cinco horas.