Name: Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprenda duas estratégias de genética reversa para recuperar norovírus murino infeccioso em cultura celular. Esses métodos permitem gerar isolados geneticamente definidos para estudar replicação viral e patogênese.

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Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa Wellcome Senior confiança atribuído a Ian Goodfellow, e Marie Curie Intra Europeia Fellowship (FP7 Conselho Europeu de Investigação) concedido a Armando Arias. Gostaríamos de agradecer a Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey e Dr. Mike Skinner para dar-nos permissão para usar seu Bioanalyzer Agilent e ajudando na execução de amostras de RNA.

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<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
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<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
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<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Aqui temos ilustrado duas diferentes abordagens reversa genéticos que permitem a recuperação de MNV infecciosa em cultura de células. Ambos aproxima eficazmente ignorar o requisito absoluto para a ligação covalente de VPG para a extremidade 5 &#39;do genoma de RNA viral através da geração de transcritos de casquilho MNV que são, então, reconhecidos pelos ribossomas celulares. Transcrição in vitro seguido de enzimaticamente capping é mais eficiente na a recuperação de MNV infeccioso que a transcrição de plasmídeos infecciosas em células que expressam polimerase de ARN T7, em que as transcrições podem ser tapados pelas enzimas FPV nivelamento. Os títulos de vírus recuperados com estes sistemas de genética inversa são semelhantes a estes obtidos por transfecção de virais VPG-linked RNA purificadas a partir de culturas de células infectadas 17 (Figura 5). A transfecção de capped MNV RNA em células permissivas Raw264.7 torna um título vírus apenas 1 log mais baixa do que as experiências que envolvem a transfection de RNA total de células infectadas e contendo viral VPG-linked RNA (Figura 5). Este facto encoraja novas investigações para determinar se a adição de uma molécula de VPG para a extremidade 5 &#39;dos ​​transcritos gerados por esses sistemas podem resultar em rendimentos de vírus aumento que podem revelar aspectos funcionais subjacentes infecciosidade MNV em células associadas à VPG. No entanto, consideramos este sistema de genética inversa como um um altamente eficiente comparável com outros vírus de RNA inverter sistemas genética actualmente utilizado em que o RNA transcrito in vitro permite a recuperação de títulos de anticorpos apenas 10-100 mais baixas do que as infecções reais com viriões 19, 20. Em geral, as metodologias atuais constituem um passo significativo no campo da biologia molecular e norovírus nos fornecer as ferramentas para investigar os papéis funcionais de proteínas e motivos conservadas nos genomas de RNA de norovírus. Estas abordagens têm já sido combinados com cmodelo de rato ACTUAL disponíveis e têm mostrado que MNV recuperado a partir de cDNA infeccioso é capaz de causar infecção letal de&gt; 80% STAT1-/ - ratinhos em menos de 10 dias 4, 21. Fazendo uso deste sistema que se recuperaram viáveis ​​mutantes norovírus murinos da proteína da cápside e de um tracto polipirimidina envolvido na ligação de factores do hospedeiro diferentes (PTB e PCBP) que exibem um fenótipos um tanto in vivo atenuado 21, 22. Além disso, demonstraram recentemente que os vírus que não possuem a capacidade de expressar a proteína a partir de VF1 ORF4 eficientemente replicar em cultura de células, mas novamente ter reduzido a virulência em ratinhos com respeito a WT MNV 8. Estes estudos nos incentivam a projetar versões atenuadas de norovírus humanos com base em estudos MNV que poderiam ser investigadas como candidatos vacinais potenciais.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Lítio solução de cloreto de precipitação </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA solução de armazenamento </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 roteiro </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap M7G nivelamento Sistema </td><td> Biotecnologias Epicentre </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Sistema de transfecção Neon </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Kit sistema Neon transfecção </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine Reagente Transfection 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR de DNA e Gel Kit de Purificação da faixa </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX grande escala de produção de RNA System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

recuperação de reversão genética mediada por norovírus murina infecciosas

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovírus humanos são responsáveis ​​pela maioria dos casos de gastrenterite humana (GE) em todo o mundo e são um problema recorrente em ambientes onde o contato pessoa-a-corpo não podem ser evitados 1, 2. Durante os últimos anos um aumento na incidência de focos nos hospitais tem sido relatada, causar perturbações significativas para a sua capacidade operacional, bem como grandes perdas económicas. A identificação de novas abordagens antivirais tem sido limitada devido à incapacidade de norovírus humanos para completar uma infecção produtiva em cultura de células 3. O isolamento recente de um norovírus murino (MNV), estreitamente relacionada com norovírus humano 4, mas que pode ser propagado em células 5 abriu novas vias para a investigação de agentes patogénicos estes 6, 7. Resultados de replicação MNV na síntese de genómico novo sentido positivo e moléculas de RNA subgenómico, o último dos quais corresponde ao thi últimaestr do genoma viral (Figura 1). MNV contém quatro diferentes estruturas de leitura abertas (ORFs), dos quais ORF1 ocupa a maior parte do genoma e codifica sete proteínas não estruturais (NS1-7) libertados por um precursor de poliproteínas. ORF2 e ORF3 estão contidos dentro da região de RNA subgenómico e codificar as proteínas da cápside (VP1 e VP2, respectivamente) (Figura 1). Recentemente, identificou-se que ORF4 adicional sobreposição ORF2 mas de uma grelha de leitura diferente é funcional e codifica para um factor de virulência mitocondrial localizada (VF1) 8. A replicação de vírus de sentido positivo de RNA, incluindo norovírus, tem lugar no citoplasma resultando na síntese de novos genomas não niveladas de RNA. Para promover a tradução viral, vírus explorar diferentes estratégias destinadas a recrutar a maquinaria de síntese protéica celular 9-11. Curiosamente, a tradução norovírus é impulsionada pelo multifuncional VPG proteína iniciador-viralcovalentemente ligada à extremidade 5 &#39;de ambos os RNAs genómicas e subgenómico 12-14. Este sofisticado mecanismo de tradução é provável que seja um fator importante na eficiência limitada de recuperação viral por convencionais genética reversa. Aqui relatamos duas estratégias diferentes com base na geração de murino norovírus-1 (MNV referido como anexo) transcrições seladas na extremidade 5 &#39;. Um dos métodos envolve tanto a síntese in vitro e capping de RNA viral, enquanto que a segunda abordagem implica a transcrição de MNV ADNc em células que expressam-polimerase de T7 RNA. A disponibilidade destes sistemas de genética inversa para o estudo da MNV e um modelo animal pequeno forneceu uma capacidade sem precedentes para dissecar o papel de sequências virais em replicação e patogénese 15-17.

Os norovírus são a principal causa de gastroenterite ainda técnicas moleculares para sua caracterização são ainda relativamente novo. Aqui relatamos duas diferentes abordagens genética reversa para a recuperação eficiente de norovírus murino (MNV), o único membro do gênero que podem ser propagadas em cultura de células.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Os norovírus humanos são responsáveis pela maioria dos casos de gastroenterite (GE) humana em todo o mundo e representam um problema recorrente em ambientes onde há proximidade...

O objetivo geral deste procedimento é recuperar o vírus neurovírus mu infeccioso utilizando dois sistemas genéticos reversos. Olá, sou Armando Arias, do setor de Virologia do Imperial College de Londres. Em nosso grupo, estamos interessados em analisar os mecanismos moleculares subjacentes à replicação do neurovírus.Os norovírus são uma causa importante de gastroenterite. Em todo o mundo, as técnicas moleculares para sua caracterização ainda são relativamente novas. A identificação de novas abordagens antivirais e o entendimento do ciclo de vida dos norovírus têm sido limitados devido à incapacidade destes vírus de completar uma infecção produtiva em cultura celular.O recente isolamento de antivirais capazes de infectar camundongos e se propagar em cultura celular, especificamente o neurovírus espelho, abriu novas possibilidades para a investigação desses patógenos importantes. Neste relato, demonstraremos duas estratégias que permitem a geração de isolados de neurovírus geneticamente definidos em cultura celular. Ambas as estratégias baseiam-se na geração de transcritos virais com capa na extremidade cinco prima.O primeiro envolve a síntese in vitro da capa do RNA viral antes da transfeção em células. A segunda abordagem consiste na transcrição do vírus MI neuro, cDNA no interior de células que expressam a polimerase de RNA T7. Visão geral do procedimento. O protocolo para recuperação do norovírus neuro a partir de transcritos de RNA com capa é iniciado por linearização.O plasmídeo contendo MV CD NA para mmv um. Isso é feito com a enzima de restrição NHE um. O DNA é posteriormente transcrito in vitro em RNA utilizando a RNA polimerase T sete.Posteriormente, o M-M-V-R-N-A é cappingado in vitro e é transfetado em células para permitir a recuperação de MNV infeccioso; recuperação direta de MNV infeccioso utilizando o vírus FAL PX que expressa a polimerase de RNA T sete para recuperação de MMV a partir de clones de cDNA diretamente transfetados. As células são primeiramente infectadas com um vírus FAL PX recombinante que expressa a polimerase de RNA T sete. A infecção por FAL PX resultará na expressão da polimerase de RNA T sete, bem como de enzimas virais de capping que podem cappingar parte do RNA sintetizado. O M-M-V-C-D-N-A é então transfetado nas células infectadas com FPV por transfeção mediada por lipídeos. A polimerase de RNA T sete produz então o M-M-V-R-N-A, parte do qual pode ser cappingado pela maquinaria de capping de RNA do FPV.Uma sequência ribozim garante que cada transcrição de RNA contenha uma extremidade três prima definida. Os transcritos de MMV com capuz serão então traduzidos em proteína antes da replicação, levando à produção de novas partículas infecciosas. Protocolo para transcrição e capping de RNA para o resgate de transcritos infecciosos de MMV e síntese de transcritos infecciosos de MMV com capuz.Primeiramente, misture os seguintes reagentes: transcrição, tampão de nucleotídeos, água e plasmídeo linearizado contendo o M-M-V-C-D-N-A. Em seguida, adicione RNA e a polimerase T sete de RNA à mistura de reação. Muitos kits comerciais estão disponíveis para essa finalidade e fornecem um método reprodutível para a síntese de RNA.A reação de transcrição é realizada incubando a mistura a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas. Analise uma pequena alíquota desta reação de transcrição em um gel de agarose não desnaturante. Primeiro, limpe o equipamento para gel com o detergente e lave com água livre de RNAses antes do uso.Certifique-se de que os géis de agarose sejam preparados utilizando reagentes livres de RNAses. O M-V-R-N-A migrará em aproximadamente três bases quinases em um gel de agarose não desnaturante. Além disso, um bioanalisador Agilent pode ser usado para fornecer um método rápido de análise da integridade do RNA.O RNA deve então ser purificado para remover os nucleotídeos não incorporados. Muitos métodos estão disponíveis; no entanto, neste protocolo, purificamos o RNA por precipitação com cloreto de lítio como uma alternativa econômica, que forma um pellet do RNA por centrifugação em velocidade máxima durante 15 minutos. Remova o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet translúcido e lave com etanol a 70%.Re-suspenda o transcrito MMV em solução de armazenamento de RNA e certifique-se de que esteja completamente dissolvido. O aquecimento do RNA a 65 graus C pode auxiliar esse processo posteriormente. Quantifique o RNA por espectrometria.Analisar a integridade do RNA executando uma pequena alíquota em um gel de agarose não desnaturante a 1%. Como é possível observar, a integridade do RNA após a precipitação com cloreto de lítio deve permanecer a mesma para melhorar a eficiência de capping. Aquecer uma alíquota do RNA a 65 graus por 10 minutos.Coloque o tubo imediatamente no gelo. Para evitar degradação ou refoldamento, prepare uma mistura de reação de capping conforme sugerido pelo fabricante. Normalmente, adicionamos cerca de 60 microgramas de M-N-V-R-N-A a uma reação final de 100 microlitros.Embora a reação possa ser reduzida, misture bem e incube a 37 graus por uma hora, purifique o RNA por precipitação com cloreto de lítio como antes. É essencial verificar novamente a integridade do RNA antes de prosseguir com a transfeção. Protocolo passo a passo para recuperação de MMV por eletroporação de RNA em células raw. Resus.Suspenda o frasco com células brutas em DMEM. Certifique-se de formar uma suspensão de célula única. Determine a concentração de células viáveis em um hemocitômetro utilizando exclusão com azul de tripano.Pelote as células e ressuspenda cuidadosamente. Suspenda-as em alíquotas de meio fresco sem antibiótico, com 8 milhões de células por transfeção, e pelote-as em uma microcentrífuga. Remova o meio e lave as células em 500 microlitros de PBS, centrifugue novamente, remova o PBS e ressuspenda as células em 130 microlitros de temperatura ambiente.Solução de suspensão de ressuscitação Neon. Adicione a quantidade apropriada de RNA com capuz, normalmente 1,3 microgramas por 130 microlitros de células, equivalente a um micrograma de RNA por 6 milhões de células. As células misturadas com os transcritos são coletadas na ponteira de transfeção Neon de 100 microlitros.Deve-se ter grande cuidado para não introduzir bolhas nesta etapa. Em seguida, eletroporar utilizando um único pulso de 1700 volts durante 25 milissegundos. Libere as células em um tubo eppendorf contendo um mililitro de meio livre de antibiótico.Distribua as células do tubo em poços independentes contendo DMEM sem antibiótico com 10% de FCS e incube as células a 37 graus por 24 a 72 horas. Recuperação de MMV por transcrição lipídica de RNA em células BSR T sete, conforme antes. Transcritos de MMV são gerados por meio da linearização do plasmídeo de MMV CD nna, transcrição in vitro com polimerase T sete e capeamento in vitro; os transcritos são então introduzidos por lipofecção em células BS RT sete. Use tripsina em uma monocamada de células bsrt sete e seme 7,5 vezes 10 à quinta células viáveis em placas de seis poços.Incube as células a 37 graus durante a noite. Remova o meio das células e substitua por três mililitros de meio fresco sem antibióticos. Para garantir a eficiência máxima da transfeção, misture um a dois microgramas de M-M-V-R-N-A com capa com 100 microlitros de Opti-MEM.Também misture quatro microlitros de lipectomia 2000 com 100 microlitros de OptiMEM. Combine as amostras contendo RNA e lipectomia e misture-as completamente pipetando para cima e para baixo 15 vezes. Deixe a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos.Em seguida, adicione os complexos de transfeção contendo transcritos de MMV com capuz de forma gota a gota na monocamada celular. Agite a placa em direções perpendiculares. Incube as células por 24 a setenta e duas horas.Protocolo para recuperação direta de MMV infeccioso a partir de CDNA em células que expressam a polimerase de RNA T sete, conforme descrito anteriormente. Este protocolo baseia-se na expressão da polimerase de RNA T sete e das enzimas de capeamento viral oxx em células infectadas por um vírus auxiliar oxx. Em seguida, o M-N-V-C-D-N-A sob controle de um promotor T sete é transfetado nas células.Primeiramente, remova o meio de cultura celular e adicione a cada poço 700 microlitros de vírus F pox diluído em meio sem antibiótico. Geralmente, utiliza-se uma multiplicidade de infecção de cerca de 0,5 PFU por célula, agite as placas perpendicularmente e incube por uma hora a 37 graus. Posteriormente, adicione duas porções de meio sem antibiótico e incube as células por mais uma hora a 37 graus para permitir a expressão da polimerase de RNA T sete. Após transfeção com MNV CG NNA, remova o meio das células infectadas e adicione três mililitros de meio fresco sem antibióticos.Prepare uma mistura de um micrograma de M-M-V-C-D-N-A e lipectomia conforme explicado na seção anterior. Misture bem movimentando para cima e para baixo. Mantenha o tubo à temperatura ambiente por 20 minutos, depois misture novamente e adicione gotas à monocamada celular.Agite suavemente a placa em direções perpendiculares. Incube as células a 37 graus por 24 a 72 horas para confirmar a recuperação do MMV infeccioso pelos diferentes enfoques de genética reversa mostrados no decorrer desta liberação de vídeo. Libere a variante infecciosa das células por ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Determine em cada amostra por procedimentos padrão, como TCID 50 ou ensaio de placas, os resultados representativos.A disponibilidade desses sistemas de genética reversa para o estudo do mi Neurovirus proporcionou uma capacidade sem precedentes de analisar o papel das sequências virais na replicação e patogênese do neurovírus no hospedeiro natural. Ambas as abordagens de genética reversa explicadas neste vídeo são altamente eficientes para a recuperação de neuro e neurovírus infecciosos em cultura celular. Como mostrado nesta figura.MMV infeccioso, o título está excedendo 10 à quinta TCID 50 por mil, é recuperado após a transfeção de transcritos de MMV com capuz em células RAW ou células BSRT7. A transfeção de MMV-CDNA em células BSRT7 previamente infectadas com auxílio do vírus helper fowlpox resulta em títulos virais excedendo 10 à quarta TCID 50 por mil. Os títulos virais obtidos por abordagens de genética reversa são semelhantes aos títulos recuperados na transfeção com RNA isolado de vírus infeccioso, destacando a alta eficiência dos sistemas de genética reversa descritos aqui.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.

Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Fonte: Leuthold, M. M., et al. Produção de Domínios Salientes de Norovírus Humano em E. coli para Cristalografia de Raios-X. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra a purificação do domínio P do norovírus humano recombinante usando cromatografia de exclusão de tamanho, destacando a separação da proteína-alvo de impurezas de maior e menor peso molecular com base na acessibilidade diferencial dos poros. O processo é monitorado por absorbância UV e confirmado por meio da análise SDS-PAGE de...

Purificação de proteínas de domínio P recombinante derivadas de bactérias de norovírus humano

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Resgate de arenavírus recombinantes a partir de ADNc clonados, uma abordagem designada por genética reversa, permite aos investigadores para investigar o papel dos produtos de genes virais específicos, bem como a contribuição dos seus vários domínios e resíduos específicos, de diferentes aspectos da biologia do arenavírus . Da mesma forma, inverter técnicas de genética em linhas de células aprovadas pela FDA (Vero) para o desenvolvimento da vacina proporciona novas possibilidades para a...

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

A geração de rotavírus recombinantes a partir do DNA plasmático fornece uma ferramenta essencial para o estudo da replicação de rotavírus e patogênese, e o desenvolvimento de vetores e vacinas de expressão rotavírus. Aqui, descrevemos uma abordagem genética reversa simplificada para a geração de rotavírus recombinantes, incluindo cepas expressando proteínas fluorescentes de repórteres.

Método de genética reversa simplificado para recuperar rotavírus recombinantes expressando proteínas de repórter

O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Aprenda duas estratégias de genética reversa para recuperar norovírus murino infeccioso em cultura celular. Esses métodos permitem gerar isolados geneticamente definidos para estudar replicação viral e patogênese.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

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