Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

O objetivo geral deste procedimento é recuperar o neurovírus infeccioso do olho mu usando dois sistemas genéticos reversos. Olá, sou Armando Arias da seção de Virologia do Imperial College of London. Em nosso grupo, estamos interessados em dissecar os mecanismos moleculares sob a replicação subjacente do neurovírus.

Os norovírus são uma das principais causas de gastroenterite. Técnicas moleculares de jato em todo o mundo para sua caracterização ainda são relativamente novas. A identificação de abordagens neoantivirais e insights sobre o ciclo de vida do neurovírus têm sido limitados devido à sua incapacidade de completar uma infecção produtiva em cultura de células.

O recente isolamento de um antiviral capaz de infectar camundongos e propagar cultura de células, o neurovírus espelho, abriu novos caminhos para a investigação desses importantes patógenos. Neste relatório, demonstraremos duas estratégias que permitem a geração de isolados de neurovírus geneticamente definidos em cultura de células. Ambas as estratégias são baseadas na geração de transcritos virais limitados às cinco extremidades principais.

O primeiro envolve a síntese em capeamento de RNA viral in vitro antes da transfecção em células. A segunda abordagem envolve a transcrição do frasco neuro MI, CDNA dentro de células que expressam T sete RNA polimerase Visão geral do procedimento. O protocolo para a recuperação de neuronorovírus a partir de transcritos de RNA tampados é iniciado por aumento linear.

O plasmídeo contendo MV CD NA para mmv um. Isso é feito com a enzima de restrição NHE um. O DNA é então transcrito in vitro em RNA usando T sete RNA polimerase.

Posteriormente, o M-M-V-R-N-A é tampado in vitro e é transfectado em células para permitir a recuperação direta de MMV infeccioso de MNV infeccioso usando o vírus FAL PX expressando T sete RNA polimerase para recuperação de MMV de clones de cDNA diretamente transfectados, as células são primeiro infectadas com um vírus FAL PX recombinante expressando T sete RNA polimerase A infecção FAL PX resultará na expressão de T sete RNA polimerase, bem como RNA viral enzimas de cobertura que podem tampar parte do RNA sintetizado. O M-M-V-C-D-N-A é então transfectado para as células infectadas pelo FPV por transfecção mediada por lipídios. A RNA polimerase T seven produz então o M-M-V-R-N-A, alguns dos quais podem então ser tampados pelo maquinário de capeamento F-P-V-R-N-A.

Uma sequência ribo zyme garante que cada transcrito de RNA contenha três extremidades primas definidas. Os transcritos de MMV tampados serão então traduzidos em proteína antes da replicação, levando à produção de novas partículas infecciosas. Protocolo para transcrição e capeamento de RNA para a recuperação da síntese infecciosa de MMV de transcritos infecciosos de MMV tampados.

Em primeiro lugar, misture os seguintes reagentes, transcrição, nucleotídeos tampão, água e plasmídeo linearizado contendo o M-M-V-C-D-N-A. Em seguida, adicione RNA e T sete RNA polimerase à mistura de reação. Muitos kits comerciais estão disponíveis para esse fim e fornecem um método reprodutível para a síntese de RNA.

A reação de transcrição é realizada incubando a mistura a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas. Analise um pequeno alcott desta reação de transcrição em um gel agros não desnaturante. Primeiro, limpe o equipamento de gel com o detergente e lave com água livre de RNAs antes de usar.

Certifique-se de que os géis agros preparados com reagentes livres de RNAs. M-V-R-N-A funcionará em aproximadamente três bases assassinas em um gel agro rose não desnaturante. Além disso, um bioanalisador Agilent pode ser usado para fornecer um método rápido de análise da integridade do RNA.

O RNA deve então ser purificado para remover nucleotídeos não incorporados. Muitos métodos estão disponíveis, no entanto, neste protocolo, purificamos o RNA por precipitação de cloreto de lítio como uma alternativa econômica pelota o RNA por centrifugação na velocidade máxima por 15 minutos. Remova o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet translúcido e lave com etanol a 70%.

Ressuspenda o transcrito MMV na solução de armazenamento de RNA e certifique-se de que esteja totalmente dissolvido. Aquecer o RNA a 65 graus C pode ajudar nesse processo mais tarde. Quantificar o RNA por espectrometria.

Analise a integridade do RNA executando uma pequena alíquota em um gel agros 1% não desnaturante. Como você pode ver, a integridade do RNA após a precipitação do cloreto de lítio deve permanecer a mesma para melhorar a eficiência do nivelamento. Aqueça uma alíquota do RNA a 65 graus por 10 minutos.

Coloque o tubo imediatamente no gelo. Para evitar degradação ou redobramento, prepare uma mistura de reação de nivelamento conforme sugerido pelo fabricante. Normalmente adicionamos cerca de 60 microgramas de M-N-V-R-N-A a uma reação final de 100 microlitros.

Embora a reação possa ser reduzida completamente misturada e incubada a 37 graus por uma hora, purifique o RNA por precipitação de cloreto de lítio como antes. É essencial verificar novamente a integridade do RNA antes de prosseguir com a transfecção. Protocolo de etapas para recuperação de MMV por eletroporação de RNA em células brutas. Resus.

Suspender o balão de células brutas no DMEM. Certifique-se de formar uma suspensão de célula única. Determine a concentração de células viáveis em um hemocitômetro usando a exclusão de azul trian.

Limpe as células e resuse com cuidado. Suspenda-os em alíquotas de meios frescos e livres de antibióticos 8 milhões de células por transfecção e pelete-os em uma micro fuga. Remova o meio e lave as células em 500 microlitros de centrífuga PBS novamente e remova o PBS ressuspenda as células em 130 microlitros de temperatura ambiente.

Solução de suspensão de néon resus. Adicione a quantidade apropriada de RNA tampado, normalmente 1,3 microgramas por 130 microlitros de células, equivalente a um micrograma de RNA por 6 milhões de células. As células misturadas com transcritos são coletadas na ponta de transfecção de néon de 100 microlitros.

Deve-se tomar muito cuidado para não introduzir bolhas nesta fase. Em seguida, a eletrooperação usando um único pulso a 1700 volts por 25 milissegundos. Libere as células em um tubo de orph final contendo um mil de meio livre de antibióticos.

Distribua as células do tubo em poços independentes contendo DMEM livre de antibióticos com 10% FCS incube as células a 37 graus por 24 a 72 horas. Recuperação de MMV pela perfeição labial de RNA em células BSR T sete como antes CAP Os transcritos MMV são gerados pelo plasmídeo MMV CD nna LINEARIZAÇÃO T sete polimerase transcrição in vitro e transcritos de capeamento in vitro são então afetados labialmente em BS RT sete células. A tripsina é uma monocamada de bsrt sete células e semeia 7,5 vezes 10 para as cinco células viáveis em seis pratos de poços.

Incube as células a 37 graus durante a noite. Remova o meio das células e substitua-o por três mils de meio fresco sem antibióticos. Para garantir a máxima eficiência da transfecção, misture um a dois microgramas de M-M-V-R-N-A tampado com 100 microlitros de ótimo.

Misture também quatro microlitros de lipectomia 2000 com 100 microlitros de ótimo. Combine as amostras contendo RNA e lipectomia e misture-as bem pipetando para cima e para baixo 15 vezes. Deixe a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, adicione os complexos de transfecção contendo transcritos de MMV tampados em um preço de queda à monocamada da célula. Agite a placa em direções perpendiculares. Incube as células por 24 a sete horas.

Protocolo para recuperação direta de MMV infeccioso de CDNA em células que expressam T sete RNA polimerase conforme descrito anteriormente. Este protocolo é baseado na expressão de enzimas T sete RNA polimerase e capeamento viral oxx em células infectadas com a ajuda do vírus oxx. M-N-V-C-D-N-A sob controle de um promotor T seven é então transfectado para as células.

Em primeiro lugar, remova o meio de cultura celular e adicione a cada poço 700 microlitros de vírus da varíola F diluído em meio livre de antibióticos. Geralmente é usada uma multiplicidade de infecção de cerca de 0,5 PFU por célula, moldar as placas perpendicularmente e incubar por uma hora a 37 graus. Depois. Adicione duas refeições de meio livre de antibióticos e incube as células por mais uma hora a 37 graus para permitir a expressão de T sete RNA polimerase, MNV CG, NNA, transfecção, remova o meio das células infectadas e adicione três moinhos de meio fresco sem antibióticos.

Prepare uma mistura de um micrograma de M-M-V-C-D-N-A e lipectomia conforme explicado na seção anterior. Misture bem preparando para cima e para baixo. Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 20 minutos, depois misture novamente e adicione tortas à monocamada de células.

Agite a placa suavemente em direções perpendiculares. Incube as células a 37 graus por 24 a 72 horas para confirmar a recuperação do MMV infeccioso pelas diferentes abordagens de genética reversa mostradas no decorrer deste vídeo libere varion infeccioso das células por congelamento repetido. Determine o em cada amostra por procedimentos padrão, como TCID 50 ou resultados representativos do ensaio de placa.

A disponibilidade desses sistemas genéticos reversos para estudar mi Neurovírus proporcionou uma capacidade sem precedentes de dissecar o papel das sequências virais na replicação e patogênese do neurovírus no hospedeiro natural. Ambas as abordagens de genética reversa explicadas neste vídeo são altamente eficientes para a recuperação de neurovírus e neurovírus infecciosos e cultura de células. Como mostrado nesta figura.

MMV infeccioso, o título é superior a 10 elevado a cinco TCID 50 por mil são recuperados após a transfecção de transcritos MM V tampados em células brutas ou BS RT sete células. A transfecção de MM V-C-D-N-A em sete células BSRT previamente infectadas com a ajuda do vírus foul pops resulta em títulos virais superiores a 10 elevado a quatro TCID 50 por mil. Os títulos virais obtidos por abordagens de genética reversa são semelhantes aos de Titus resgatados em transfecto com RNA, isolados de vírus infecciosos, destacando a alta eficiência dos sistemas genéticos reversos aqui descritos.