Name: Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a transfectar anticorpos em neurônios para estudar a patogênese de doenças neurológicas. Este método rápido utiliza microscopia de imunofluorescência para visualizar efeitos celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Investigação e Desenvolvimento, Pesquisa Médica de Serviço, Departamento de Assuntos de Veteranos. Este estudo foi financiado por uma Prêmio Mérito VA Review (a MCL) e da Universidade do Tennessee, Centro de Ciências da Saúde Fundo de Investigação de Esclerose Múltipla.

1. Etiquetagem de anticorpos (Figura 1) <ol><li> Fazer NaHCO3 0,1 M de tampão: <ul type="circle"><li> 8,4 g de NaHCO3 </li><li> 29,2 g de NaCl </li><li> 1 litro de H 2 O </li></ul></li><li> Traga o tampão até um pH de 8,4 com esta solução (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro de H 2 0). </li><li> Adicionar 35 ul de Atto550 NHS a 70 ul de anti-ul NaHCO hnRNPA1 e 500 3-tampão e girar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a rotação de uma hora, injectar a mistura num dialisador e dializar em 2 litros de PBS durante a noite. </li><li> No dia seguinte, concentrar os dialisados ​​Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizando uma coluna de centrifugação (Amicon Ultra 0,5). </li><li> Após os Atto550 NHS rotulado anti-hnRNPA1 anticorpo foi concentrada, suspensa nano-amostra para determinar a concentração. </li></ol> 2. Transfecção de anticorpos (Figura 2) <ol><li> Semente 10 5 células / poço em 500 ul de DulbeccModificado o de Eagle Médium (DMEM/F12 +10% FBS 1% de antibiótico) num poço de deslizamento 8 24 horas antes da transfecção. Confluência de células deve ser, pelo menos, 70%. </li><li> Vinte e quatro horas após a sementeira, adicionar 2 ul de Ab-deliverin reagente para um tubo Eppendorf. </li><li> Em seguida, adicionar 2 ug de Atto550 NHS marcados anti-hnRNPA1 anticorpo (0,5 ug / uL) ao tubo de Eppendorf e mesmo incubar 10-15 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação, aspirar meio e adicionar 394 uL de meio fresco de DMEM para as células. </li></ol> Nota: Adicionar 500 ul de DMEM para uma câmara de células intactas para actuar como um controlo. <ol start="5"><li> Após a incubação, adicionar 100 ul de DMEM com a mistura de anticorpos, misture pipetando para cima e para baixo, e adicionar as células em DMEM para um volume total de 500 ul. </li><li> Troque a mídia depois de 48 horas de entrega de anticorpos. </li></ol> Nota: O protocolo foi repetido com FITC Rigg como controlo positivo. 3. Imagens ao vivo e fixo para determinar a eficiência <ol><li> Células de imagem ao vivo às 48 horas usando os Cy3 filtro em um microscópio de fluorescência para a imagem dos transfectadas Atto550 NHS anticorpos marcados. </li><li> Depois de imagem ao vivo foi concluída, aspirar a mídia e as células de correção. </li><li> Depois de meios de aspiração, o tratamento de células com 0,4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente. Lave as células de 4 x 5 min cada com PBS. Em seguida, montar células com meios de montagem contendo DAPI reagente e lamela correção. Medir a eficiência de transfecção das células fixas com Axiovision software. Se Axiovision software não está na mão, basta contar os acontecimentos de sua imagem por resultados mão e ligue para cálculo em 3,7. Em alternativa, o software ImageJ podem ser usados ​​para estes cálculos. </li><li> Primeiro, use o &quot;Eventos&quot; medida para contar o número total de células em sua imagem de escolha com ampliação de 20x. </li><li> Em seguida, use o &quot;Eventos&quot; medida para contar as células que não eramtransfectadas com sucesso anticorpos na imagem mesma ampliação de 20x. </li><li> Para acessar os medidos &quot;Eventos&quot; em um formato estilo Excel, clique em &quot;Propriedades&quot;, clique na &quot;Medição&quot; guia, e clique para ver &quot;Como a Tabela&quot;. </li><li> Finalmente, use o seguinte cálculo para determinar a sua eficiência de transfecção, comparando os dois eventos previamente medidos: ((células Total - células não transfectadas) / total de células) x 100 = eficiência de transfecção. </li></ol> 4. Resultados representativos As imagens ao vivo de não transfectada (Figura 3A) em comparação com transfectadas (Figura 3B) neurónios revelam que a rotulagem dos anticorpos (vermelho ou verde, em cada figura) é claramente observado no interior das células (Figura 3B, C, D). Seguindo aspiração e lavagem com meios para remover os anticorpos entre ou aderentes à superfície das células, os anticorpos marcados são ainda presente dentro neurónios (Figura 3C e D).<html> Para o cálculo da eficiência de transfecção, utilizar o software para calcular Axiovision células totais comparados a células que não foram transfectadas com sucesso. Estes valores foram inseridos em uma fórmula de eficiência de transfecção para adquirir a eficiência de transfecção em percentagem do número total de células (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma dos procedimentos utilizados para os anticorpos de etiquetas com o 550 Atto NHS de éster seguida de etapas necessárias para concentrar os anticorpos marcados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de fluxo dos procedimentos utilizados para transfectar anticorpos marcados em células vivas em cultura.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Figura 3. Vivo imagens dos neurônios transfectadas 48 horas de transfecção seguinte. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Figura 4. Corrigido e enxaguado imagens com acontecimentos contados a fim de determinar a eficiência de transfecção.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A fim de testar hipóteses sobre moléculas específicas e sua expressão, genes e outros vectores normalmente são transfectados em células. O único aspecto deste processo é a capacidade de facilmente anticorpos para transfectar as células alvo. Realizamos este método em cinco experimentos em separado cada um em duplicatas. Resultados de eficiência de transfecção foram semelhantes entre todos os experimentos. É importante notar que o método permite a introdução de anticorpos para dentro da célula, sem alterar a estrutura ou...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Microscópio fluorescente AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision versão 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biociências </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS éster </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-deliverin </td><td> OZ Biociências </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibióticos 1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina-8 assim Slides Cultura </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientific Industries Inc </td><td> Modelo 151 </td></tr><tr><td> DAPI montar mídia </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialisador </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (solução a 4%) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Anticorpos fornecem a capacidade de ter uma visão romance em vários eventos que ocorrem em sistemas vivos. A capacidade de produzir anticorpos altamente específicos para proteínas alvo tem permitido muito precisas questões biológicas a ser tratada. É importante notar que os anticorpos têm sido implicados na patogénese de várias doenças humanas, incluindo o lúpus eritematoso sistémico (SLE), artrite reumatóide (RA), as síndromes paraneoplásicas, a esclerose múltipla (MS) e o tipo de vírus T-linfotrópico humano 1 (HTLV-1) mielopatia associada ao / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Como anticorpos causam a doença é uma área de investigação em curso, e os dados sugerem que as interacções entre vários anticorpos e moléculas intracelulares resultados na inflamação, alterados celular, mensagens e apoptose 10. Tem sido demonstrado que os pacientes com EM e HAM / TSP produzir anticorpos para a proteína de ligação intracelular de proteínas RNA heterogéneo ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dados recentes indicam que os anticorpos para tanto intra-neuronal e antigénios de superfície são patogénicas 3, 5-9, 11. Assim, um procedimento que permite o estudo de anticorpo intracelular: interações proteína daria grande insight sobre a patogênese da doença. Os genes são comumente transfectado em células primárias e linhas de células em cultura, no entanto a transfecção de anticorpos em células tem sido dificultada pela alteração da estrutura do anticorpo ou a eficiência de transfecção fraca 12. Outros métodos de transfecção incluem a transfecção com base em anticorpo lipossomas catiónicos (consistindo de DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), ambas das quais resultou numa diminuição de 10 vezes na transfecção de anticorpos em comparação com os controlos 12. O método realizado em nosso estudo é semelhante à de lípidos catiónicos mediadas métodos e utiliza um mecanismo de base de lípidos de modo a formar complexos não covalentes com os anticorpos através electrostática e hidrinteracções ophobic 13. Utilizamos Ab-deliverin reagente, que é uma formulação de lípidos capaz de capturar os anticorpos não covalentes através de interacções electrostáticas e hidrofóbicas e entregando-os no interior das células. Assim químico e genético acoplamentos não são necessários para a entrega de anticorpos funcionais em células vivas. Este método permitiu-nos realizar várias anticorpo rastreamento e localização de proteínas experiências, bem como as análises das conseqüências moleculares de anticorpo intracelular: interações proteína 9. Neste protocolo, será mostrado como os anticorpos para transfectar-se em neurónios rápida, reprodutível e com um grau elevado de eficiência de transfecção. Como exemplo, iremos utilizar anticorpos anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Para a quantificação da eficácia de transfecção fácil o uso do anti-hnRNP anticorpos marcados com A1 Atto-550-NHS e marcado com FITC de IgG. Atto550 SNS é um novo rótulo com absorção molecular alta e yi quânticaeld. Fonte de excitação e filtros fluorescentes para Atto550 são semelhantes a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Além disso, tem Atto550 fotoestabilidade elevada. Marcado com FITC de IgG foram utilizados como controlo para mostrar que este método é versátil e não dependente tingir. Esta abordagem e os dados que são gerados irão auxiliar na compreensão do papel que os anticorpos para antigénios alvo intracelulares podem desempenhar na patogénese de doenças humanas.

Uma abordagem rápida para investigar as interacções e efeitos sobre os mecanismos moleculares relacionados com a presença de anticorpos em um ambiente intracelular é descrito. O método envolve a transfecção de anticorpos em células vivas utilizam uma formação complexo não-covalente com base em uma formulação de lípidos. A técnica é adaptável a linhas celulares imortalizadas, e células primárias.

Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença

Os anticorpos proporcionam a capacidade de obter novas perspectivas sobre diversos eventos que ocorrem em sistemas vivos. A capacidade de produzir anticorpos altamente específicos...

O objetivo deste procedimento é fornecer uma abordagem rápida e reprodutível para investigar como os anticorpos, mecanismos moleculares autólogos relacionados à função neuronal e a patogênese de doenças neurológicas. Primeiro, os anticorpos são marcados com um rótulo fluorescente ATO five 50 NHS. Em seguida, os anticorpos são misturados com o reagente de transfeção e então transfectados em células neuronais.Em cultura, 48 horas após a transfeção, os neurônios são fixados e montados com meio DPI e visualizados por microscopia de imunofluorescência. A eficiência de transfeção pode ser calculada utilizando software de imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em neurociência e neuroimunologia, como, por exemplo, como os autoanticorpos alteram os mecanismos moleculares relacionados à função neuronal e à patogênese de doenças neurológicas mediadas pelo sistema imunológico.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejamos testar a hipótese de que anticorpos contra h e RPA um e proteína ligadora de RNA superexpressos em neurônios contribuíam para o mecanismo de neurodegeneração. O procedimento será demonstrado por Josh Douglas, um estudante de pós-graduação. Antes de iniciar o procedimento, certifique-se de que células neuronais íntegras de alta qualidade, cultivadas a 100.000 células por poço e com pelo menos 80% de confluência, estejam disponíveis um dia antes dos experimentos. No dia do ensaio, observe as células para garantir que estejam saudáveis.Para começar, prepare 0,1 mil de tampão de bicarbonato de sódio misturando 8,4 gramas de bicarbonato de sódio e 29,2 gramas de cloreto de sódio em um litro de água. Em seguida, ajuste o pH do tampão para 8,4 em 500 microlitros do tampão. Adicione 70 microlitros do anticorpo a ser transcrito, neste caso, anti H-N-R-N-P-A um, e 35 microlitros do reagente de marcação, aqui OH550 NHS.Rotacione a solução à temperatura ambiente durante uma hora, depois injete-a em um dialisador e realize a diálise em dois litros de PBS a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, utilize uma coluna de centrifugação para concentrar o anticorpo marcado após a diálise. Por fim, determine a concentração do anticorpo utilizando um espectrofotômetro NanoDrop.Em uma lâmina de oito poços, semear 10.000 células por poço em um volume de 500 microlitros de DMEM completo. Incubar as células a 37 graus Celsius durante a noite ou até que a confluência celular atinja pelo menos 70%. Quando as células estiverem 70% confluentes, iniciar o procedimento misturando dois microlitros de anticorpo, adicionando os reagentes de transfeção e dois microgramas de anticorpo marcado a 0,5 microgramas por microlitro em um tubo e incubar a solução por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente.Enquanto isso, remova o meio SUP das placas de cultura celular e substitua por exatamente 394 microlitros por poço, com meio fresco. Quando a solução de transfeção estiver pronta, adicione 100 microlitros de DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione exatamente 106 microlitros da mistura de transfeção a cada poço contendo células, obtendo um volume final de 500 microlitros por poço.Certifique-se de incluir um poço controle negativo NÃO TRANSFECTADO, no qual DMEM, em vez de anticorpo, é adicionado. Incube as células por 48 horas a 37 graus Celsius. Após essa incubação, substitua o meio por DMEM fresco e realize a imagem em tempo real utilizando um microscópio fluorescente 48 horas após a marcação.Para visualizar o ATO cinco anticorpos marcados com NHS 50, utilize o filtro SI três após a imagem em tempo real; aspire o meio e fixe as células adicionando paraformaldeído 4% e incubando a lâmina por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação das células, lave-as quatro vezes em PBS, com um período de incubação de cinco minutos em PBS para cada lavagem. Em seguida, remova o PBS e adicione uma gota de meio de montagem contendo DPI.Em cada poço, coloque suavemente uma lamínula sobre as células utilizando um microscópio fluorescente. Inicie a aquisição de imagens das células. Neste experimento, realizamos com sucesso a imagem fluorescente de células vivas de neurônios transfectados com anticorpos anti H-N-R-N-P-A1 marcados com ATO cinco 50 NHS.Esta imagem mostra anticorpos dentro das células neuronais, incluindo os processos citoplasmáticos neuronais, bem como a fixação e coloração do núcleo. O uso de DPI mostrado aqui em azul permite determinar a eficiência de transfeção dividindo o número de células transfectadas pelo número total de células. Neste caso, a eficiência é de 50% após este procedimento.Outros métodos, como imunocitoquímica, extração de RNA, análise de micromatriz e western blots, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a colocalização de anticorpos dentro de organelas celulares, bem como alterações na função e integridade neuronais relacionadas à especificidade do anticorpo para o antígeno-alvo. Neste vídeo, demonstramos como marcar anticorpos com um marcador fluorescente, preparar um complexo de reagente de transfeção com anticorpos marcados fluorescentemente, transfectar neurônios e calcular a eficiência de transfeção. Este método é útil na avaliação de como os autoanticorpos afetam funções celulares, como viabilidade, apoptose, transporte neuronal, bem como os mecanismos moleculares relacionados à função neuronal e à patogênese de doenças neurológicas.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o processo de transdução de células neuronais humanas com um lentivírus que codifica uma proteína tau humana mutante marcada com proteína fluorescente amarela (YFP) para estudar a agregação de proteínas. Ele descreve as etapas desde a entrada viral até a expressão da tau mutante, culminando na formação de agregados de tau citoplasmática visíveis nos neurônios.

Transdução mediada por lentivírus de neurônios humanos para análise de agregação de proteínas Tau

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Controlar a expressão de proteínas não é apenas essencial para todos os organismos vivos, mas também uma estratégia importante para investigar as funções das proteínas em modelos celulares. O protocolo apresentado mostra a aplicação da interferência de anticorpos em células de mamíferos, incluindo neurônios primários do hipocampo, e demonstra o uso de reconstruções tridimensionais no estudo da função proteica.

Estudar a função da proteína eo papel da expressão proteína alterada pela interferência de anticorpos e reconstruções tridimensionais

Este manuscrito descreve como a entrega de genes locais mediada por vetores virais fornece uma maneira atraente de expressar transgenes no sistema nervoso central.  O protocolo descreve todas as etapas cruciais para realizar uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson.

Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Encefalite autoimune é uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos do sistema nervoso central. Neurônios hipocampais podem ser usados para descobrir e caracterizar esses anticorpos. Este artigo fornece um protocolo para a cultura celular primária e imunostenção para determinar autoanticorpos no soro e fluido cefalorraquidiano dos pacientes.

Culturas neuronais hipocampais para detectar e estudar novos anticorpos patogênicos envolvidos em encefalite autoimune

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Aprenda a transfectar anticorpos em neurônios para estudar a patogênese de doenças neurológicas. Este método rápido utiliza microscopia de imunofluorescência para visualizar efeitos celulares.

Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença

Explorar mais vídeos