Name: Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado In-situ Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de LacZ-Tagged Células Tumorais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a detectar metástases pulmonares em resolução de célula única em camundongos usando perfusão in situ e coloração X-Gal. Este método remove o sangue para reduzir o ruído de fundo e melhora significativamente a visualização de micrometástases.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lubor Borsig (Instituto de Fisiologia da Universidade de Zurique) para o seu conselho sobre a técnica de perfusão pulmonar. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Krebsliga da Zurich Kanton, o L. Walter e Wolf Johanna Foundation, Zurique, a Lydia Hochstrasser Foundation, Zurique, o Swiss National Science Foundation, SNF, Suíça, Schweizerischer Verein Balgrist, e da Universidade de Zurique.

1. Perfusão Pulmonar In situ e Fixação <ol><li> Anestesiar ratos por injecção ip de 150 ul ~ fosfato salino tamponado (PBS) contendo 112,5 mg / kg (peso corporal) de cetamina, xilazina 16,5 mg / kg e 15 mg / kg de acepromazina (ou por um outro anestésico contendo analgésicos adequados). </li><li> Quando os reflexos do mouse já não são observadas, corrigi-lo na mesa de operação de volta para baixo e molhar a pele com etanol 70% para os cabelos lisos para baixo. </li><li> Abrir a pele do abdómen até ao pescoço e puxá-la para os lados ou removê-lo. </li><li> Abra o peritônio eo tórax de um amplo tamanho. Impedir rupturas de grandes vasos (por exemplo, a veia jugular) para evitar a redução da eficiência da perfusão subsequente. </li><li> Cortar a veia cava caudal abaixo do fígado. </li><li> Usar uma seringa de 20 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar lentamente 10-15 ml de PBS para dentro do ventrículo direito do coração a bater até que o pulmão é completamente branco eo coração pára de bater (assistolia). </li><li> Beliscar fora dos vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma, com uma pinça vascular. </li><li> Use uma seringa de 10 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar ~ 2 ml de paraformaldeído a 3% (PFA) em PBS para o ventrículo direito. </li><li> Descobrir a traqueia fora do tórax. Usar a mesma seringa para injectar ~ 3 ml de 3% de PFA em PBS cranial (do lado de fora do tórax) na traqueia até o pulmão é insuflado. Imediatamente após a remoção da agulha, belisque da cauda traqueia de punção com uma pinça vascular e aguardar durante 10 minutos para permitir a fixação. </li><li> Transecão os vasos sanguíneos acima do grampo vascular, remover o grampo e injectar ~ 2 ml de PBS para o ventrículo direito para remover o excesso de PFA. </li><li> Punção as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha, retirar a pinça vascular na traqueia e injectar 3-5 ml de uma solução de PolyFreeze incorporação médio / PBS 1:1 para o caudal da traqueia da primeira punção até o PFA no pulmãolóbulos é substituída pela solução. </li><li> Retire cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e atravessa em ligamentos do tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e da traquéia. Manter o coração ligado para os pulmões. </li><li> Dependendo de como proceder com a análise do tecido pulmonar continuar com os protocolos descritos nas secções 2 ou 3. Se você quer fazer ambas as análises, remover um lobo do pulmão e proceder conforme descrito em 3. Processar os restantes lóbulos ligados ao coração, tal como descrito no ponto 2. </li></ol> 2. Visualização de lacZ-marcadas células tumorais metastáticas em lobos pulmonares inteiras <ol><li> Coloque o pulmão num copo de plástico com tampa de fecho estanque e fixá-lo com formaldeído a 2% em PBS à temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Remover solução fixadora e lavam cuidadosamente 3 vezes com PBS. </li><li> Adicionar pelo menos 10 ml preparada de fresco de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal), a coloração da solução (solução stock X-Gal [40 mg / ml emDimetilformamida] 01:40 diluído em solução de coloração básico, pH 7,1 (Tabela 1), proteger da luz). </li><li> Colocar um pedaço de gaze na parte superior do pulmão de natação para mantê-la completamente na solução e colocar a tampa apenas frouxamente sobre o pote para permitir a troca de ar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3-5 hr protegido da luz. </li><li> Remover X-Gal solução, lavar uma vez com PBS para remover a solução de X-Gal residual (opcional) e adicionar PFA a 4%. </li></ol> 3. Visualização de lacZ-tagged células tumorais metastáticas em criocortes Pulmonares <ol><li> Prefill um molde de encaixe marcado a 1/3 com meio não diluído PolyFreeze incorporação. Coloque o lobo em cima e encher-se com a incorporação médio até que o lobo está completamente coberto. Tente evitar bolhas. </li><li> Incubar os pulmões incorporados a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Em seguida, congelar os pulmões incorporados lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano e armazenar a -80 ° C. </li><li> Corte 7-10 mM crioseções em um criostato e montá-los em lâminas de microscópio SuperFrostPlus. </li><li> Incubar as secções imediatamente com X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida. </li><li> Enxaguar as lâminas em PBS 2 vezes durante 5 min e, em seguida, brevemente em água destilada. </li><li> Counter-mancha de vermelho rápido nuclear por 10-30 segundos, lavar em água destilada e montar as lâminas com Carac-Monte. </li></ol> 4. Resultados representativos Asai et al. Relatada no artigo original sobre o derivado Dunn-modelo de rato LM8 OS que os tumores sc primárias derivadas das células parentais de Dunn, diferentes dos derivados da linha de células altamente metastáticas LM8 sub, não formam espontaneamente metástases pulmonares em detectáveis ratinhos C3H singénicos 14. Com as técnicas aqui relatadas, que de novo inquérito a formação de metástases nas Dunn/LM8 modelos do rato do SO. Nós aproveitou estável lacZ transduzidas Dunn e LM8 celulars e de um protocolo para a in-situ de perfusão pulmonar e fixação em ratinhos. Imagens representativas de pulmões perfundidos e não perfundido de ratos injectados subcutaneamente com lacZ-transduzidas e não transduzidas de controlo Dunn e LM8 células são mostradas na Figura 1. Nos ratinhos injectados com células de controlo Dunn, metástases macroscópicas e microscópicas permaneceu indetectável no pulmão não-perfundidos e perfundido (Figura 1A, i-iv). Mas, curiosamente, em ratinhos injectados com células de Dunn-lacZ, X-gal revelou coloração azul micrometastático focos de células individuais ou grupos de células pequenas (&lt;0,1 mm), na superfície do não-perfundidos pulmões (Figura 1A, vi). In- perfusão in situ e fixação dos pulmões melhorou a detecção de micrometástases Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). No entanto, a excrescência focos macroscópico não foi observado (Figura 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; Nos ratinhos injectados com células de controlo LM8, translúcidas, dificilmente detectável macrometastatic focos maiores do que 0,1 mm de diâmetro foram reconhecidos em não-perfundidos pulmões (Figura 1B, i). Perfusão do pulmão (Figura 1B, iii) não melhorou a detecção de focos. No entanto, em ratinhos injectados com LM8-lacZ várias células X-Gal azul manchado macro-(Figura 1B, v) e micrometástases (Figura 1B, vi) foram detectados na superfície do não-perfundidos órgãos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou a detectabilidade de macro-e micrometástases (Figura 1B, vii - viii). Consequentemente, as micro-e macrometástases tornou visível a uma densidade mais elevada e um número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido de focos em que por baixo da superfície de órgãos tornou-se também visível. Um h adicionalanálise istological usando criocortes de tecido pulmonar confirmou a detectabilidade melhorada de metástases pulmonares em ratinhos injectados com lacZ-transduzidas Dunn e LM8 células. Nos ratinhos com tumores primários derivados de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ células, ao contrário dos camundongos com tumores primários das células de controlo respectivos, micrometástases ou mesmo única célula focos foram reconhecidos em secções de pulmão (Figura 2). Além disso, também foram macrometástases mais claramente visíveis em ratinhos injectados com células LM8-lacZ do que em animais injectados com o controlo LM8 células (Figura 2C e D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Detecção de metástases espontâneas de não transduzidas (i-iv) e lacZ transduzidas (v-viii) Dunn (A) e LM8 (B) células não perfundido (i, ii, v, vi) e perfundida (iii, iv, vii, viii) nos pulmões de ratinhos C3H. Metástases em representante X-Gal-staINED pulmões inteiros (V, VII, em A e B) e respectivo close-ups (VI, VIII em A e B) aparecem em azul. Macrometastatic focos (&gt; 0,1 mm) nos órgãos de ratos injetados com os não-etiquetados LM8 células (i-iv em B) são indicados por asteriscos. Áreas mostradas em close-ups são representativos para os pulmões inteiros. Barras de escala indicam um milímetro em imagens de pulmões inteiros e 0,1 mm de close-ups. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de Dunn e LM8 micrometástases em criocortes de pulmão. Secções de tecido de pulmão outubro embedded foram incubadas em X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida e, em seguida, contrastadas com vermelho nuclear rápido. As setas apontam para os focos micrometastático reconhecido em secções de pulmão de ratos injectados com Dunn-lacZ (B), ou células LM8-lacZ (D). Micrometastases permaneceu indetectável em secções de pulmão de ratos injectados com não transduzidas Dunn (A) ou LM8 células (C). Barras de escala indicam 0,1 mm.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os resultados aqui apresentados no modelo Dunn/LM8 OS rato demonstram o poder do método recentemente estabelecido que combina a coloração com X-Gal-lacZ de células tumorais marcadas com a perfusão in situ / fixação do tecido pulmonar. Esta combinação das duas técnicas permite uma detecção de alta sensibilidade de lesões micrometastáticas para baixo para o nível da célula individual e também melhora a visualização das macrometástases sobre a superfície do pulmão (Figura 1), bem como nas secções de pulmão (Figura 2). Embora a coloração com X-Gal permite também a detecção de (micro) metástases em outros órgãos, in-situ de perfusão / fixação melhora a detecção de focos metastáticos nos tecidos do pulmão que não sejam apenas ligeiramente por causa da cor natural do sangue e do tecido relacionada desses 13 órgãos. Mesmo se a perfusão é dirigida a um outro órgão, por exemplo, o fígado, a remoção do sangue só parcialmente melhorar a aposta contrasteween coloração com X-Gal e a cor natural do órgão. No entanto, o método é aplicável a qualquer tipo de lacZ-tagged células tumorais, irá melhorar drasticamente a detectabilidade de metástase pulmonar até ao nível de uma única célula dormente micrometástases e permite uma quantificação fácil e fiável de macro e micrometástases. Uma limitação deste método e todas as outras técnicas que são baseados em genes repórter, incluindo as proteínas de luciferase e de fluorescência, é a estabilidade da expressão do transgene. Como se mostra na Figura 2d, nem todas as células tumorais dentro do macrometastatic focos estão manchadas azul, indicando uma ausência de actividade de beta-galactosidase. Isso pode ser devido a necrose, mas é mais provavelmente devido a uma perda da expressão do transgene. Observou-se que a Dunn e LM8 células são muito eficazes na regulação negativa de lacZ e outros transgenes mesmo sob selecção contínua para a expressão. Nós, portanto, ligado em estudos recentes para o K12 murinoe K7M2 e os humanos HOS, 143B e SAOS-2 linhas de células de osteosarcoma, as quais todas mantidas expressão de lacZ estável in vitro, bem como in vivo, até 100% ao longo do tempo. Uma vez que a expressão de lacZ-estável é garantido, esta técnica pode ser aplicada em estudos com genes manipulados células tumorais, por exemplo, para investigar mecanicamente o processo de colonização do tecido 13, assim como para o desenvolvimento e teste de novas terapias visando a erradicação das lesões metastáticas 15 , 16. Além disso, pode servir como uma referência para a melhoria das atuais técnicas de imagem radiológica, tais como PET, (micro) TC e RM, usados ​​para a detecção precoce de lesões metastáticas. Em um estudo recente de PET (não publicado) com marcadores diferentes verificou-se a no pulmão detectado vivo metástases in vivo subsequentemente ex com o protocolo descrito. Em um estudo em curso com um novo animal pequeno micro-CT (SkyScan) estamos tão longe able para detectar metástases pulmonares in vivo para um tamanho de 0,5 mm para baixo e ex vivo a 0,3 mm, mas pretende-se uma resolução de 0,1 mm. Interessantemente, isto é o limite de tamanho, que definimos distinguir macro-de micrometástases com o método combinado de perfusão in situ e a coloração X-Gal. Esta sublinha uma vez mais a sensibilidade ea utilidade desta técnica fácil e de baixo custo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Xilazina (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazina) </td><td> FATRO SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine grampo vascular </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> mm, curvo 35 </td></tr><tr><td> Copo de plástico com tampa </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml com tampas de copos </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal); pó </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> dissolver em N, N-di-metilformamida e 40 mg / ml, loja de luz-protegido à temperatura de -20 ° C </td></tr><tr><td> Solução corante básico, equilibrada a pH 7,1, armazenadas light-protegida, a 4 ° C para max. 1 mês </td><td> por si mesmo </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M de MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L de sódio a 10%-Desoxicolato </td></tr><tr><td> Meio de incorporação PolyFreeze </td><td> Polysciences; distribuidor suíço: Brunschwig </td><td> 19.636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação molde </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 criostato </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lâminas SuperFrost </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast-Vermelho - solução de sulfato de alumínio </td><td> Divisão Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Carac-Monte </td><td> Thermo Electron, distribuidor suíço: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes e Equipamentos.

visualização melhorada de metástases pulmonares em resolução única célula em ratos por combinado<em&gt; in-situ</em&gt; perfusão do tecido pulmonar e x-gal coloração de<em&gt; lacz</em&gt;-tagged células tumorais

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metástase é a principal causa de morte na maioria dos tipos de câncer e, consequentemente, um foco principal na pesquisa do câncer. No entanto, a detecção de micrometástases de imagiologia radiológica e o sucesso na sua erradicação terapêutico permanecer limitado. Enquanto modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a pesquisa do câncer 1, o monitoramento / visualização de micrometástases continua a ser um desafio e avaliação imprecisa de metástase em estudos pré-clínicos potencialmente leva a resultados desapontadores em ensaios clínicos 2. Consequentemente, existe um grande interesse em refinar os métodos para finalmente permitir a detecção reprodutível e fiável de metástases para baixo para o nível de célula única em tecido normal. O foco principal é, por conseguinte, sobre técnicas que permitem a detecção de células tumorais in vivo, como a micro-tomografia computorizada (micro-CT), tomografia de emissão de positrões (PET), a bioluminescência ou imagens de fluorescência &lt;sup&gt; 3,4. Estamos actualmente a optimização destas técnicas para a monitorização in vivo do crescimento do tumor primário e as metástases em modelos de osteosarcoma diferentes. Algumas destas técnicas podem também ser usados ​​para análise ex vivo de metástase lado métodos clássicos como qPCR 5, 6 ou FACS diferentes tipos de coloração histológica. Como um padrão de referência, estabelecemos no presente estudo a transfecção ou transdução estável de células tumorais com o gene lacZ que codifica a enzima bacteriana β-galactosidase que metaboliza o substrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galactopiranosido (X-Gal) com um corante azul índigo insolúvel 7 e permite que altamente sensível e selectivo coloração histoquímica azul de células tumorais em tecido de rato ex vivo até ao nível da célula individual, como mostrado aqui. Esta é uma ferramenta de baixo custo e não equipamento intensivo, o que permite a validação preciso da metástase 8 em estudos de avaliação de um novoterapias ticancer 9-11. Um fator limitante de X-gal de coloração é o baixo contraste, por exemplo, relacionadas com o sangue de coloração vermelho tecidos bem vascularizada. No tecido pulmonar, este problema pode ser resolvido por perfusão in situ de pulmão, uma técnica que foi recentemente estabelecido pela Borsig et al. Perfundidos 12 que os pulmões dos ratos, sob anestesia para eliminá-las do sangue, e para fixar e inserir-los in situ sob inflação através da traquéia. Este método evita também o colapso do pulmão e, assim, mantém a morfologia funcional alvéolos pulmonares, o que melhora a qualidade do tecido para análise histológica. No presente estudo, nós descrevemos um novo protocolo, que tira vantagem de uma combinação de X-gal de coloração lacZ células tumorais que expressam e in-situ de perfusão e de fixação do tecido pulmonar. Este protocolo permite refinado de alta sensibilidade de detecção de simples células metastáticas no pulmão e permitiu-nos em um estudo recente para detect &quot;adormecidas&quot; micrometástases pulmonares em um modelo de rato 13, que foi originalmente descrito como sendo não-metastáticos 14.

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de<em&gt; LacZ</em&gt; Marcado com células tumorais.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

A metástase é a principal causa de morte na maioria dos tipos de câncer e, consequentemente, um dos focos principais na pesquisa oncológica. No entanto, a detecção de...

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a detecção de micrometástases no pulmão de camundongo ex vivo, preservando a arquitetura dos pulmões inflados. Isso é realizado primeiramente por meio da perfusão do pulmão in situ com PBS para remover o sangue, que é a principal fonte de fundo colorido nesse tecido. Os próximos passos consistem em inflar o pulmão pela injeção de PFA e, em seguida, pinçar para fixar o tecido pulmonar sob inflação.Em seguida, o pulmão é removido e fixado novamente em PFA ou lóbulos pulmonares individuais são embutidos para criosecção. Os passos finais consistem em corar os tecidos em solução Xal e visualizar as células tumorais LA zag; por fim, metástases podem ser detectadas em lóbulos pulmonares inteiros ou em cortes de tecido pulmonar, até mesmo ao nível de célula única, utilizando um microscópio binocular ou um microscópio de luz. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a técnica de sky standing por si só, é que a detectabilidade de micrometástases é consideravelmente melhorada devido à remoção do fundo relacionado ao sangue.Inicie o protocolo anestesiando um camundongo com uma injeção intraperitoneal de ketamina, xilazina e acepromazina em aproximadamente 150 microlitros de PBS. Quando os reflexos de dor do camundongo não forem mais observados, fixe-o na mesa cirúrgica. Retire e alise os pelos com etanol 70%.Abra a pele do abdômen até o pescoço. Puxe a pele para os lados ou remova-a. Abra cuidadosamente o peritônio no tórax para evitar a ruptura de grandes vasos, como as veias jugulares.Isso melhorará a eficiência da perfusão. Agora, corte a veia cava cardíaca abaixo do fígado usando uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de 21 a 24 gauge. Injete lentamente 10 a 15 mililitros de PBS no ventrículo direito do coração em batimento até que o pulmão fique completamente branco e o coração pare de bater.Em seguida, oclua os vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma com um prendedor vascular. Encha uma seringa de 10 mililitros com paraformaldeído a 3% e, com uma agulha de 21 a 24 gauge, injete no ventrículo direito. Aproximadamente dois mililitros.Exponha a traqueia fora do tórax e infle o pulmão com uma injeção na traqueia de cerca de três mililitros de aldeído a partir da região externa ao tórax. Em seguida, imediatamente após a remoção da agulha, oclua a traqueia ao redor do local da punção com um clamp vascular e aguarde 10 minutos para permitir a fixação. Em seguida, seccione os vasos sanguíneos acima do clamp vascular.Em seguida, remova o clamp e injete aproximadamente dois mililitros de PBS no ventrículo direito para remover o excesso de formaldeído a vácuo. Fure as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha e remova o clamp vascular da traqueia. Agora, injete três a cinco mililitros de solução de inclusão diluída na traqueia, ajustando em relação à outra injeção.Interrompa a injeção quando o parafôrmico nos lóbulos pulmonares for substituído pela solução. Remova cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e seccionando os ligamentos de tecido conjuntivo, os vasos sanguíneos e a traqueia. Certifique-se de manter o coração conectado aos pulmões.Reserve um lobo para cortes criostáticos e use o tecido pulmonar restante para coloração do pulmão inteiro. Coloque o pulmão em um copo plástico com tampa hermética e fixe com formaldeído 2% em PBS. Coloque um pedaço de gaze sobre o pulmão para mantê-lo submerso na solução e deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.Após meia hora, remova a solução de fixação e lave o tecido completamente com PBS por 3 vezes. Prepare frescamente a solução xal pronta para uso diluindo um mililitro da solução estoque de Xal, na proporção de 1 para 40, na solução básica de coloração e adicione pelo menos 10 mililitros dela ao copo. Mergulhe o pulmão com um pedaço de gaze. Fixe a tampa levemente para permitir a troca de ar e incube a 37 graus Celsius por três a cinco horas protegido da luz.Após a incubação, remova a solução de xal. Lave os pulmões uma vez com PBS para remover o resíduo da solução de xal e adicione pelo menos 10 mililitros de paraformaldeído a 4% em PBS. O tecido está agora pronto para histologia e pode ser armazenado por longo prazo em PFA a 4% a quatro graus Celsius.Comece preenchendo um terço de uma forma de inclusão com meio de inclusão poly forze não diluído. Em seguida, coloque o lobo pulmonar na forma e continue adicionando meio até que o lobo esteja completamente coberto. Evite cuidadosamente a formação de bolhas de ar e, em seguida, incube o lobo incluído a quatro graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, prepare os pulmões embutidos para o corte congelando-os lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano. Se necessário, eles podem agora ser transferidos para um congelador a menos 80 graus Celsius para armazenamento. Corte seções criostáticas de sete a 10 mícrons do lobo e monte as seções em lâminas comerciais prontas para seções criostáticas. Após o montagem, incube imediatamente as seções na solução de coloração XAL a 37 graus Celsius por 24 horas em uma câmara umidificada. No dia seguinte, lave as lâminas duas vezes com PBS, cinco minutos por lavagem.A seguir, realize uma breve lavagem com água destilada. Agora contracolora as lâminas com vermelho nuclear rápido durante 10 segundos para obter uma contracoloração fraca que torna o xal mais dominante e, imediatamente, remova a contracoloração com água destilada. Para uma contracoloração mais intensa, prolongue o tempo até 30 segundos ou mais.Monte as lâminas com imunomontagem. A formação de metástases nos modelos de OS murino LM oito foi reavaliada. Utilizando as imagens representativas descritas aqui de pulmões perfundidos e não perfundidos de camundongos injetados simultaneamente com células done e LM oito transduzidas com laxy e não transduzidas com controle, em camundongos injetados com células controle done.Metástases macroscópicas e microscópicas permaneceram indetectáveis em pulmões não perfundidos e perfundidos. No entanto, de forma interessante, em camundongos injetados com células dun LA Z, a coloração xgl revelou focos micrometastáticos azuis de células isoladas ou pequenos aglomerados celulares na superfície dos pulmões não perfundidos. A perfusão e fixação in situ dos pulmões melhoraram ainda mais a detectabilidade das micrometástases dun la z. Contudo, não foi observado crescimento para focos macroscópicos em camundongos injetados com células controle LM oito. Focos macrometastáticos translúcidos, mal detectáveis, maiores que 0,1 milímetro de diâmetro, foram reconhecidos em pulmões não perfundidos. A perfusão do pulmão não melhorou a detecção desses focos.No entanto, em camundongos injetados com células LAC Z ate, foram detectadas múltiplas metástases macroscópicas azuis por coloração com X-gal na superfície de órgãos não perfundidos. Metástases microscópicas também foram detectadas na superfície de órgãos não perfundidos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou ainda mais a detecção de metástases macroscópicas e microscópicas.Consequentemente, micro e macrometástases tornaram-se visíveis com maior densidade e em número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido, no qual focos localizados sob a superfície do órgão também se tornaram visíveis. Uma análise histológica adicional utilizando cortes criostáticos de tecido pulmonar confirmou a detecção aprimorada de metástases pulmonares em camundongos injetados com células LAX Z transduzidas e células LM oito em camundongos com tumores primários derivados de células Dun LAX Z. Micrometástases ou até mesmo focos de célula única foram identificados em cortes pulmonares.Isso não foi observado em camundongos com tumores primários das respectivas células controle. Além disso, as metástases macroscópicas também eram mais claramente visíveis em camundongos injetados com células LM oito LA C do que em animais com as células controle LM oito. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a perfusão e fixação pulmonar em ZI dois e a subsequente coloração exci das metástases nos pulmões ressecados.Esta técnica é uma leitura altamente sensível do ponto final para a distribuição de metástases no pulmão em qualquer tipo de estudo de câncer e também pode servir como referência para a melhoria das técnicas atuais de imagem in vivo, como micro-TC, PET e RNM, utilizadas na detecção precoce de lesões metastáticas.

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JoVE Journal

Medicine

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Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

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Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

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Aprenda a detectar metástases pulmonares em resolução de célula única em camundongos usando perfusão in situ e coloração X-Gal. Este método remove o sangue para reduzir o ruído de fundo e melhora significativamente a visualização de micrometástases.

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