Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado In-situ Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de LacZ-Tagged Células Tumorais

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a detecção de micrometástases no pulmão de camundongo ex vivo, preservando a arquitetura dos pulmões inflados. Isso é feito primeiro perfundindo o pulmão in situ com PBS para remover o sangue, que é a principal fonte de fundo de cor nesse tecido. Os próximos passos são inflar o pulmão por injeção de PFA e, em seguida, beliscar para fixar o tecido pulmonar sob inflação.

Em seguida, o pulmão é removido e posteriormente fixado em PFA ou lobos pulmonares únicos são incorporados para criossecção. As etapas finais são corar os tecidos em solução Xal e visualizar as células tumorais LA zag, em última análise, a metástase em lobos pulmonares inteiros ou em seções de tecido pulmonar pode ser detectada até o nível de célula única com um microscópio binocular ou um microscópio óptico. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o céu por conta própria, é que a detectabilidade de micrometástases é consideravelmente melhorada devido à remoção do fundo relacionado ao sangue.

Comece o protocolo anestesiando um camundongo com uma injeção intraperitoneal de cetamina, xilazina e ace promazina em aproximadamente 150 microlitros de PBS. Quando os reflexos de dor do mouse não forem mais observados, fixe-o na mesa de operação. Volte para baixo e alise o cabelo com 70% de etanol.

Abra a pele do abdômen até o pescoço. Puxe a pele para os lados ou remova-a. Abra cuidadosamente o peritônio no tórax para evitar a ruptura de grandes vasos, como as jugulares veninas.

Isso melhorará a eficiência da perfusão. Agora corte a veia cava cardis embaixo do fígado usando uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de calibre 21 a 24. Injete lentamente 10 a 15 mililitros de PBS no ventrículo direito do coração batendo até que o pulmão esteja completamente branco e o coração pare de bater.

Em seguida, retire os vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma com uma pinça vascular. Carregue uma seringa de 10 mililitros com aldeído paraforme a 3% e, com uma agulha de calibre 21 a 24, injete no ventrículo direito. Aproximadamente dois mililitros.

Descubra a traqueia fora do tórax e infle o pulmão com uma injeção na traqueia de cerca de três mililitros de aldeído de fora do tórax. Então, imediatamente após remover a agulha, aperte a traqueia mimada na punção com uma pinça vascular e aguarde 10 minutos para permitir a fixação. Em seguida, faça o transecto dos vasos sanguíneos acima da pinça vascular.

Em seguida, remova a braçadeira e injete aproximadamente dois mililitros de PBS no ventrículo direito para remover o excesso de formaldeído de energia. Perfure as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha e remova a pinça vascular na traqueia. Agora injete de três a cinco mililitros de solução de inclusão diluída na traqueia mimada na outra injeção.

Pare a injeção quando o couro paraforme nos lobos pulmonares for substituído pela solução. Remova o pulmão com cuidado, puxando o coração com uma pinça e seccionando os ligamentos do tecido conjuntivo, os vasos sanguíneos e a traqueia. Certifique-se de manter o coração conectado aos pulmões.

Separe um lóbulo para seções criogênicas e use o tecido pulmonar restante para uma coloração longa inteira. Coloque o pulmão em um copo plástico com tampa bem fechada e fixe-o com 2% de formaldeído e PBS. Coloque um pedaço de gaze em cima do pulmão para mantê-lo na solução e deixe descansar em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após meia hora, remova a solução de fixação e lave bem o tecido Com PB S3 vezes, prepare novamente a solução xal pronta para uso diluindo um mililitro de solução estoque Xal, um a 40 na solução de coloração básica e adicione pelo menos 10 mililitros no copo. Afunde o pulmão com um pedaço de gaze. Fixe a tampa frouxamente para permitir a troca de ar e incube-a a 37 graus Celsius por três a cinco horas protegida da luz.

Após a incubação, remova a solução xal. Enxágue os pulmões uma vez com PBS para remover a solução xal residual e adicione pelo menos 10 mililitros de aldeído paraforme a 4% em PBS. O tecido agora está pronto para histologia e pode ser armazenado por muito tempo no PFA de 4% a quatro graus Celsius.

Comece preenchendo um terço de um molde de incorporação com meio de incorporação poly forze não diluído. Em seguida, carregue o lóbulo pulmonar no molde e continue adicionando meio até que o lóbulo esteja completamente coberto. Evite cuidadosamente fazer bolhas de ar agora incubar o lóbulo embutido a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, prepare os pulmões embutidos para seccionamento, congelando-os lentamente em uma mistura de gelo seco e pentano isop. Se necessário, eles agora podem ser transferidos para um freezer de 80 graus Celsius negativos para armazenamento em um criostato corte seções criogênicas de sete a 10 mícrons do lóbulo Monte as seções em lâminas prontas para seção criogênica disponíveis comercialmente Uma vez montadas, incube imediatamente as seções em solução de coloração xal a 37 graus Celsius por 24 horas em uma câmara umidificada. No dia seguinte, enxágue as lâminas em PBS duas vezes por cinco minutos por enxágue.

Em seguida, enxágue brevemente em água destilada. Agora contra-core as lâminas com vermelho nuclear rápido por 10 segundos para obter uma contra-coloração fraca que torna o xal mais dominante e enxágue imediatamente a contra-mancha com água destilada. Para uma contra-mancha mais escura, estenda o tempo para até 30 segundos ou mais.

Monte as lâminas com montagem imunológica. A formação de metástases nos modelos de OS de camundongos LM oito realizados foi reinvestigada. Usando as imagens aqui descritas representativas de pulmões perfundidos e não perfundidos de camundongos injetados simultaneamente com células transduzidas laxy e não transduzidas controladas e LM oito em camundongos injetados com células controladas feitas.

As metástases macroscópicas e microscópicas permaneceram indetectáveis em pulmões não perfundidos e perfundidos. Mas, curiosamente, em camundongos injetados com células dun LA Z, a coloração xgl revelou focos micrometastáticos azuis de células únicas ou pequenos aglomerados de células na superfície de pulmões não perfundidos perfusão in situ e fixação dos pulmões melhoram ainda mais a detectabilidade de micrometástases dun la z, no entanto, o crescimento para focos macroscópicos não foi observado em camundongos injetados com células LM de controle oito translúcidas, Focos macrometastáticos pouco detectáveis maiores que 0,1 milímetro de diâmetro foram reconhecidos em pulmões não perfundidos. A perfusão do pulmão não melhorou a detecção dos focos.

No entanto, em camundongos injetados com células LAC Z, várias macro metástases azuis da coloração X gal foram detectadas na superfície de órgãos não perfundidos. Micrometástases também foram detectadas na superfície de órgãos não perfundidos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou ainda mais a detectabilidade de macro e micrometástases.

Consequentemente, as metástases micro e macro tornaram-se visíveis em maior densidade e maior número, principalmente devido à translucidez do tecido perfundido, no qual os focos sob a superfície do órgão também se tornaram visíveis. Uma análise histológica adicional usando cortes criogênicos de tecido pulmonar confirmou a detectabilidade melhorada de metástases pulmonares em camundongos injetados com células LAX Z transduzidas e LM oito em camundongos com tumores primários derivados de células Dun LAX Z. Micrometástases ou mesmo focos de células únicas foram reconhecidos em cortes pulmonares.

Isso não foi observado em camundongos com tumores primários das respectivas células de controle. Além disso, as macro metástases também foram mais claramente visíveis em camundongos injetados com células LM oito LA C do que em animais com as células LM oito controle. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a perfusão e fixação pulmonar no ZI dois e a subsequente coloração exci da metástase nos pulmões excisados.

Esta técnica é um endpoint altamente sensível lido para a distribuição de metástase no pulmão em qualquer tipo de estudo de câncer e também pode servir como referência para a melhoria das técnicas atuais de imagem in vivo, como micro ct PET e MRI usadas para detecção precoce de lesões metastáticas.