Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

O objetivo geral deste procedimento é maximizar as informações dos sinais moleculares associados à regulação da dopamina a partir de uma única dissecação de tecido das regiões somatodendríticas da região ventral do cérebro. Isso é alcançado primeiramente por meio de uma dissecação precisa para separar a substância negra da área tegmental ventral. O segundo passo consiste em processar os tecidos para análise da dopamina por CLAE e realizar o processamento adicional das proteínas endógenas precipitadas para análise.

Em seguida, o processamento da proteína precipitada para conteúdo total de proteína permite a determinação de quais proteínas reguladoras da dopamina ou fosforilação proteica podem ser medidas em conjunto com a leitura do conteúdo tecidual de dopamina na amostra. Em última análise, as análises da dopamina e de suas proteínas reguladoras nas regiões discretas do mesencéfalo e nas regiões somatodendríticas permitem tirar conclusões sobre os mecanismos moleculares associados à regulação da dopamina.

As monoaminas afetam muitos resultados comportamentais, e de fato pesquisadores nas áreas de dependência, biologia e disfunção locomotora, como notavelmente na doença de Parkinson, têm grande interesse em como monoaminas como a dopamina, que estudamos em meu laboratório, influenciam os resultados comportamentais. Mas a importância do estudo das monoaminas pode ser ainda mais aprimorada se compreendermos como elas são reguladas em nível molecular. A vantagem de nossa técnica é que podemos obter, a partir de uma única amostra obtida de tecido do SNC, múltiplas leituras dessa mesma amostra, permitindo-nos obter um perfil completo de como eventos moleculares afetam a desregulação das monoaminas.

Podemos utilizar esses dados e colocá-los em contexto para entender como o comportamento será afetado. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a determinação da proteína e da fosforilação exige conhecimento sobre a quantidade total de proteína necessária para uma leitura precisa, dependendo dos anticorpos escolhidos pelo pesquisador. A demonstração visual deste método é fundamental.

As técnicas de dissecção e a determinação de mono com as proteínas reguladoras representam uma abordagem relativamente nova para analisar a regulação in vivo. Para iniciar este procedimento, resfrie a matriz cerebral de roedor, uma placa de Petri contendo cinco lâminas e um bisturi número 11 sobre uma cama de gelo úmido. Também pré-resfrie tantos tubos quantos forem necessários para a dissecção em gelo seco.

Em seguida, após sacrificar um rato, remova seu cérebro e posicione-o de cabeça para baixo, com o cerebelo lateral encaixado nas ranhuras da matriz gelada. Após um minuto, insira as lâminas de barbear frias no cérebro resfriado, começando cerca de dois milímetros à frente do quiasma óptico para a análise do estriado e do núcleo accumbens. Em seguida, continue inserindo as lâminas de barbear frias a cada corte de um milímetro até o ponto médio dos pedúnculos, posicionando alternadamente cada lâmina de forma escalonada para facilitar a remoção da matriz.

Ao retirar as lâminas, procure o início do hipocampo, pois ele é o melhor guia para garantir a presença da SN e da VTA no local onde o hipocampo envolve completamente o mesencéfalo. Faça cortes com a lâmina de bisturi número 11 para dissecar primeiro a SN da VTA. Remova o córtex e o hipocampo sobrejacentes.

Em seguida, faça um corte vertical separando a área pigmentada da SN do VTA, garantindo que a lâmina mantenha contato constante com o gelo úmido durante a dissecação. Depois, faça um corte horizontal na ou próxima à linha média, logo acima da parte mais dorsal e lateral do SN. Por fim, separe delicadamente a SN do restante do tronco encefálico.

Uma vez removido o SN, separe o VTA do restante do mesencéfalo. Coloque imediatamente os tecidos dissecados em tubos microcêntrifuga pré-resfriados. Em seguida, armazene os tecidos a menos 80 graus Celsius até que estejam prontos para o processamento.

Neste procedimento, homogeneíze suavemente o tecido imediatamente após a remoção do gelo seco, utilizando uma solução de ácido perclórico 0,1 molar com EDTA gelada. Em seguida, mantenha a amostra novamente sobre gelo seco. Depois, centrifugue as amostras a 12.000 RPM para sedimentação.

O pellet proteico a ser usado para determinações de western blot: posteriormente, aspire os sobrenadantes para o frasco de HPLC. Coloque os pellets proteicos precipitados, ainda congelados, derivados do tratamento com tampão de HPLC, sobre gelo úmido para descongelar e certifique-se de que todo o tampão tenha sido removido e arquivado. Para o processamento bilateral da SN, adicione 300 microlitros de SDS 1% contendo triss 5 milimolar e EDTA 1 milimolar ao pellet e sonique; já para o processamento bilateral da VTA, 200 microlitros de SDS 1% serão suficientes.

Em seguida, coloque as amostras na água fervente por cerca de cinco minutos para completar a desnaturação das proteínas. Deixe esfriar até a temperatura ambiente, garantindo que as tampas estejam bem fechadas nesta etapa. Em seguida, utilize o ensaio BCA com uma curva padrão de proteína na faixa de dois a 40 microgramas de proteína.

Para determinar a concentração de proteína nas amostras de cinco microlitros, utilize o valor mediano obtido a partir de uma análise em triplicata para determinar a quantidade de proteína em relação à curva padrão. Divida o resultado pelo volume da amostra para obter a concentração de proteína. Em seguida, prepare as amostras com o tampão amostral contendo DIO três etol para eletroforese SDS redutora em gel de acrilamida 10%, se necessário, conforme indicado pela cor do tampão amostral.

Alterar para amarelo, adicionar tris base um molar pH 8,2 em incrementos de 10 microlitros à amostra até que a cor azul seja aparente. Para garantir o pH adequado, realizar a quantidade apropriada de proteína total usando eletroforese SDS-PAGE em gel de acrilamida 10%, em seguida transferir as proteínas para membrana de nitrocelulose com poro de 0,45 mícron. Configurar o tanque de transferência para pelo menos 27 volts e permitir que a transferência ocorra durante a noite.

No dia seguinte, seque o blot por pelo menos 30 minutos. Em seguida, cora-o com a solução de poncho S por cerca de cinco minutos. Depois disso, detenha-o vigorosamente com solução de ácido clorídrico 0,2% até que as faixas individuais de proteína estejam claramente resolvidas e a coloração de fundo tenha sido removida.

Em seguida, obtenha uma imagem da coloração do poncho S utilizando o ImageJ para quantificar ainda mais as cargas relativas de proteína em cada poço e normalizar os resultados da tirosina hidroxilase, transportador de dopamina ou transportador vesicular de monoamina tipo dois. Abaixo está o western blot da tirosina hidroxilase fosforilada em S31 de Syriana nos amostras de substância negra de rato. A curva padrão calibrada de tirosina hidroxilase fosforilada em S31 de Syriana varia de 0,3 nanogramas a 2,0 nanogramas e encontra-se dentro da faixa linear de detecção. Abaixo está o western blot da tirosina hidroxilase fosforilada em S40 de Syriana nas amostras de tegmento ventral de rato.

A curva padrão de tirosina hidroxilase fosforilada SN 40 calibrada varia de 0,2 nanogramas a 1,5 nanogramas e está dentro do intervalo linear de detecção. É importante manter a temperatura adequada, bem como rotular os tubos. Também é essencial normalizar a proteína para reduzir a variância dos seus resultados.

Este protocolo, quando seguido rigorosamente, pode fornecer aos pesquisadores na área de função locomotora e comportamento relacionado ao vício respostas moleculares extensivas que afetam a regulação de monoaminas no cérebro, especialmente a dopamina, que é o que nos interessa. Como resultado, essas respostas podem oferecer uma análise muito detalhada e completa do significado para os resultados comportamentais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como maximizar as respostas da regulação de monoaminas na substância negra e na área tegmental ventral a partir de uma única dissecação de tecido.